子囊霉素的純化方法
【專利摘要】本發明提供了一種子囊霉素的純化方法，包括步驟：將胞內含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；菌絲體用酒精浸泡提取，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，用乙酸丁酯或乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液并濃縮；先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌；用甲醇或者乙醇溶液溶解、過濾；再用非極性烷烴溶劑萃取，濃縮下相萃取液中甲醇或者乙醇至干；用甲基叔丁基醚溶解，而后用正己烷混合結晶；過濾；用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌，烘干，即得到含有子囊霉素固體。與現有技術相比，本發明技術方案降低了生產成本、提高了收率、操作簡單且適合于工業化生產。
【專利說明】
子囊霉素的純化方法
技術領域
[0001]本發明屬于藥物化學領域，具體涉及子囊霉素的純化方法。
【背景技術】
[0002]子囊霉素也叫長川霉素(Ascomycin，Immunomycin，FK-520)，是二十三碳的大環內酯類化合物，是免疫抑制劑FK-506(他克莫司，Tacrolimus)乙基類似物，40多年前日本藤澤制藥公司從含有吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus的土壤中分離得到。研究發現子囊霉素具有很強的免疫抑制劑作用，目前子囊霉素已被廣泛用作生產半合成APK如吡美莫司)的中間體。
[0003]近年來國外主要選用以吸水鏈霉菌為代表的微生物發酵法來生產子囊霉素。國內對子囊霉素的研究尚處于起步階段，申請號為01126969.3公開了一種以長川霉素為有效成分的農用殺菌劑，純化方法是用丙酮或者乙醇將菌絲體破壁后與發酵液合并，經樹脂交換分離，并用丙酮或者乙醇解吸，解吸液濃縮或者進而純化得到長川霉素;該公開技術制備的是農用殺菌劑，且純化方法與本發明截然不同。申請號為201110200242.1公開了一種從鏈霉菌發酵液中提純子囊霉素的方法;采用發酵液過濾、菌絲體超聲破碎提取、大孔樹脂吸附、硅膠柱層析和結晶技術得到子囊霉素純品；但是該提純方法需要消耗大量溶劑，收率低，操作繁瑣。
[0004]目前提取分離方法中多含有水相，產品中含有子囊霉素結構類似物，影響產品純度及產品形態。而我國目前還未有子囊霉素工業化生產報道，其市場基本被日本和美國等國外公司占領。因此，本領域迫切需要提供一種生產成本低廉、收率高、操作簡單且適合于工業化生產的提純子囊霉素的生產方法。
【發明內容】
[0005]本發明要解決的技術問題是提供一種生產成本低廉、收率高、操作簡單且適合于工業化生產的純化方法。
[0006]為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為:
[0007]—種子囊霉素的純化方法，包括以下步驟:
[0008]I)將含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；
[0009]2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯或乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液，取上相萃取液，濃縮上相萃取液至上相萃取液體積的1/3-1/4體積，得到濃縮液。
[0010]酒精與菌絲體重量比例大概在8:1至10:1。
[0011 ] 3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，濃縮上相液中的乙酸丁酯或乙酸異丁酯至干，得到稠狀濃縮物；
[0012]加入飽和碳酸氫鈉的作用是除去色素及酸堿極性雜質，加入飽和食鹽水的作用是除去碳酸氫鈉等堿性物質。
[0013]4)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，過濾后得濾液；
[0014]5)用非極性烷烴溶劑萃取步驟4)中的濾液，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中甲醇或者乙醇至干，得到濃縮物；
[0015]用非極性烷烴溶劑萃取，可以去除油性雜質。
[0016]6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，用正己烷與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物；
[0017]加正己烷，可以在結晶時去除油性雜質，提高產品純度。
[0018]7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物；
[0019]8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物，烘干，即得到含有子囊霉素的結晶固體。
[0020]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟2)中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯或乙酸異丁酯的體積比為1:1;用乙酸丁酯或乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/3-1/4體積，得到濃縮液。
[0021]浸泡時間分兩次提取，第一次浸泡2小時，浸泡過程中每隔半個小時攪拌一次，第一次浸泡后固液分離獲得一次酒精浸泡液;然后進行第二次浸泡，合并兩次浸提液。
[0022]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟3)中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為
0.5:1，洗滌2次。
[0023]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟4)中溶解用的甲醇或者乙醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:1至5:1。
[0024]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟4)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還包括用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。
[0025]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟5)中每次萃取用的非極性烷烴溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為2?3次，合并下相萃取液。
[0026]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟5)中非極性烷烴溶劑為正己烷、正庚烷或石油醚。
[0027]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟6)甲基叔丁基醚與步驟5)中的濃縮物重量比為1:0.6至2:1，正己燒與溶液的體積比為0.2:1。
[0028]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟6)結晶溫度為(TC至5°C，結晶時間為40小時至45小時。
[0029]優選地，所述子囊霉素的純化方法，步驟8)洗滌次數為2?3次，烘干溫度為45°C至500C，烘干時間為3至5小時。
【附圖說明】
[0030]圖1為子囊霉素的結構式。
[0031]圖2為純化前子囊霉素HPLC的色譜圖。
[0032]圖3為經過本發明純化方法后子囊霉素HPLC的色譜圖。
【具體實施方式】
[0033]為詳細說明本發明的技術內容、構造特征、所實現目的及效果，以下結合【具體實施方式】并配合附圖詳予說明。
[0034]圖1為子囊霉素的結構式。
[0035]分子式:C43H69N0i2分子量:792.0lg/mol。。
[0036]實施例1
[0037]本實施例的具體工藝方法如下:
[0038]I)胞內含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；
[0039]2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯的體積比為I: I，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/3體積，得到濃縮液；
[0040]3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，其中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為0.5:1，洗滌2次;濃縮上相液中的乙酸丁酯至干，得到稠狀濃縮物；
[0041]4)用甲醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，其中溶解用的甲醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:1，過濾后得濾液;在用甲醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。
[0042]5)用非極性烷烴正己烷萃取步驟4)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴正己烷溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為2次，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中甲醇至干，得到濃縮物；
[0043]6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，其中甲基叔丁基醚與步驟5)中的濃縮物重量比為1:0.6;用正己烷與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物，其中正己烷與溶液的體積比為0.2:1;其中結晶溫度為0°C，結晶時間為45小時；
[0044]7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物；
[0045]8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物2次，在50 °C下烘3個小時，即得到含有子囊霉素固體。
[0046]實施例2
[0047]本實施例的具體工藝方法如下:
[0048]I)胞內含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；
[0049]2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸異丁酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/4體積，得到濃縮液；
[0050]3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，其中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為0.5:1，洗滌2次;濃縮上相液中的乙酸異丁酯至干，得到稠狀濃縮物；
[0051]4)用乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，其中溶解用的乙醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為5:1，過濾后得濾液;在用乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。
[0052]5)用非極性烷烴正庚烷萃取步驟4)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴正庚烷溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為3次，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中乙醇至干，得到濃縮物；
[0053]6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，其中甲基叔丁基醚與步驟5)中的濃縮物重量比為2:1;用正庚烷與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物，其中正己烷與溶液的體積比為0.2:1;其中結晶溫度為5°C，結晶時間為40小時；
[0054]7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物；
[0055]8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物3次，在45 °C下烘5個小時，即得到含有子囊霉素固體。
[0056]實施例3
[0057]本實施例的具體工藝方法如下:
[0058]I)胞內含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；
[0059]2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸異丁酯的體積比為1:1，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/3體積，得到濃縮液；
[0060]3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，其中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為0.5:1，洗滌2次;濃縮上相液中的乙酸異丁酯至干，得到稠狀濃縮物；
[0061]4)用甲醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，其中溶解用的甲醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為4:1，過濾后得濾液;在用甲醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。
[0062]5)用非極性烷烴石油醚萃取步驟4)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴石油醚溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為2次，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中甲醇至干，得到濃縮物；
[0063]6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，其中甲基叔丁基醚與步驟5)中的濃縮物重量比為1.5:1；用石油醚與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物，其中正己烷與溶液的體積比為0.2:1;其中結晶溫度為3°C，結晶時間為44小時；
[0064]7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物；
[0065]8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物2次，在48°C下烘4個小時，即得到含有子囊霉素固體。
[0066]實施例4
[0067]本實施例的具體工藝方法如下:
[0068]I)胞內含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體；
[0069]2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，其中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯的體積比為I: I，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/4體積，得到濃縮液；
[0070]3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，其中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為0.5:1，洗滌2次;濃縮上相液中的乙酸丁酯至干，得到稠狀濃縮物；
[0071]4)用乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，其中溶解用的乙醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為3:1，過濾后得濾液;在用乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還可以用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。
[0072]5)用非極性烷烴正己烷萃取步驟4)中的濾液，其中每次萃取用的非極性烷烴正己烷溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為3次，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中乙醇至干，得到濃縮物；
[0073]6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，其中甲基叔丁基醚與步驟
5)中的濃縮物重量比為1:1;用正己烷與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物，其中正己烷與溶液的體積比為0.2:1;其中結晶溫度為2°C，結晶時間為42小時；
[0074]7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物；
[0075]8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物3次，在47 °C下烘4個小時，即得到含有子囊霉素固體。
[0076]純度檢測方法:高效液相色譜測定，色譜柱Kromasil ODS C18，5ym，250mm*4.6mm;流動相體積比為V(乙腈):V(乙酸):V(水)=650:1: 350，流動相流速I.0mL/min;檢測波長210nm;色譜柱柱溫60°C ;外標法定量。
[0077]在上面測定參數下，測得用本方法純化前子囊霉素HPLC的色譜圖，見圖2。
[0078]在上面測定參數下，用本方法純化前后，測得實施例4得到的子囊霉素HPLC的色譜圖，見圖3。
[0079]通過對比圖2和圖3，可以看出圖2雜質峰比較多，純度約為68%;圖3的子囊霉素純度可以達到94%，若按本技術方案進行再次重結晶，產品純度可以達到作為合成原料所需。
[0080]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1.一種子囊霉素的純化方法，其特征在于，所述的方法包括步驟: 1)將含有子囊霉素的鏈霉菌發酵液進行固液分離過濾，得到菌絲體； 2)菌絲體用酒精浸泡提取，得到浸提液，減壓濃縮浸提液至無酒精為止，得到濃縮后的浸提液，用乙酸丁酯或乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液，取上相萃取液，濃縮上相萃取液至上相萃取液體積的1/3-1/4體積，得到濃縮液； 3)先后分別用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌步驟2)中濃縮液，用飽和碳酸氫鈉和飽和食鹽水洗滌過程中都取上相液，濃縮上相液中的乙酸丁酯或乙酸異丁酯至干，得到稠狀濃縮物； 4)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物，過濾后得濾液； 5)用非極性烷烴溶劑萃取步驟4)中的濾液，取下相萃取液，濃縮下相萃取液中甲醇或者乙醇至干，得到濃縮物； 6)用甲基叔丁基醚溶解步驟5)中的濃縮物，得到溶液，用正己烷與該溶液混合靜置結晶，得到結晶混合物； 7)過濾步驟6)中的結晶混合物，濾去母液，得到結晶物； 8)用甲基叔丁基醚浸潤抽濾洗滌步驟7)中結晶物，烘干，即得到含有子囊霉素的結晶固體。2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟2)中濃縮后的浸提液與每次萃取用的乙酸丁酯或乙酸異丁酯的體積比為1:1;用乙酸丁酯或乙酸異丁酯萃取濃縮后的浸提液2次，每次萃取都取上相萃取液，合并第一次和第二次的上相萃取液并濃縮至合并后上相萃取液總體積的1/3-1/4體積，得到濃縮液。3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中洗滌用的飽和碳酸氫鈉與步驟2)中濃縮液的體積比為1:1，洗滌I次;每次洗滌用的飽和食鹽水與步驟2)中濃縮液的體積比為0.5:1，洗滌2次。4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中溶解用的甲醇或者乙醇與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:1至5:1。5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)用甲醇或者乙醇溶液溶解步驟3)中的稠狀濃縮物后過濾前，還包括用活性炭進行脫色處理，活性炭與步驟3)中稠狀濃縮物的重量比為2:100。6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟5)中每次萃取用的非極性烷烴溶劑與步驟4)中的濾液的體積比為1:1，萃取次數為2?3次，合并下相萃取液。7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟5)中非極性烷烴溶劑為正己烷、正庚烷或石油醚。8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟6)甲基叔丁基醚與步驟5)中的濃縮物重量比為I: 0.6至2:1，正己烷與溶液的體積比為0.2:1。9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟6)結晶溫度為(TC至5°C，結晶時間為40小時至45小時。10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟8)洗滌次數為2?3次，烘干溫度為45至50°C，烘干時間為3至5小時。
【文檔編號】C07D498/18GK106008553SQ201610467120
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】黃楷, 樂占線, 莊鴻, 陳秀明, 洪秀清, 徐蘭, 張祝蘭, 鄭衛, 連云陽
【申請人】福建省微生物研究所