馬齒莧中新骨架生物堿化合物及其提取分離方法

馬齒莧中新骨架生物堿化合物及其提取分離方法
【專利摘要】本發明涉及中藥提取、分離領域，尤其涉及從馬齒莧中提取、分離和鑒別出的新骨架生物堿化合物及其提取分離方法。所述的新骨架生物堿化合物，分子依次式為C18H26N2O，C18H24N2O2，C18H28N2O2，命名為Oleracimine，Oleracimine A和Oleracone A。還提供上述新化合物的提取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、ODS中壓柱、及Sephadex LH?20，成功的提取分離出骨架獨特的新生物堿化合物，新化合物具有抗炎、鎮痛和抗腫瘤作用，本發明新化合物及其鹽或衍生物可以作為其他化合物合成先導物，以及新藥開發和藥理活性研究的原料，用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【專利說明】
馬齒莧中新骨架生物堿化合物及其提取分離方法
技術領域
[0001] 本發明涉及中藥提取、分離領域，尤其涉及從馬齒莧藥材中提取、分離和鑒別出的 新骨架生物堿化合物及其提取分離方法。
【背景技術】
[0002] 馬齒莧(Portulaca oleracea L.)，又名長命菜、馬莧菜，為馬齒莧科植物。馬齒莧 耐旱耐澇，且耐光耐陰，分布廣泛，資源豐富，作為藥食兩用的野生植物備受關注，2015版 《中華人民共和國藥典》中收載馬齒莧的干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血止血、止痢 等功效，用于熱毒血痢、癰腫疔瘡、濕疹、丹毒、蛇蟲咬傷、便血、痔血、崩漏下血等。
[0003] 馬齒莧現代藥理學研究表明，其具有抗炎止痛、抗菌抗病毒、降血壓、降血脂、抗氧 化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、調節免疫功能等作用。研究表明馬齒莧眾多化學成分為其 多樣的藥理作用提供了物質基礎，馬齒莧主要化學成分包括黃酮類、香豆素、萜類、留類、生 物堿、氨基酸、各種色素類和礦物質類等。其中生物堿是馬齒莧中一類主要的化學成分，目 前已報道的生物堿類成分有去甲腎上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N_ 二環己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺;還有環二肽生物堿和酰胺類生物堿:馬齒莧酰 胺A-I、K、L、N-S 〇
[0004] 目前從馬齒莧中分離出的化學成分大多數是已知的，且結構新穎性較低，因此，對 馬齒莧中新化合物的開發和分離是亟待需要的。

【發明內容】

[0005] 針對上述問題，本發明提供從馬齒莧中提取的新骨架生物堿化合物，經研究發現 本發明的新骨架生物堿具有抗炎鎮痛抗腫瘤的作用，同時提供一種針對本發明新化合物的 簡便、快速、環保、純度高的提取分離方法。
[0006] 為實現本發明的上述目的，本發明提供新骨架生物堿化合物，分子式分別為 〇181126他0，〇181124他〇2，〇181128~〇2，命名依次為〇16瓜(3；[111；[116,016抑(3；[111；[116八，016瓜(30116八，化 學結構式依次為：
[0007]
[0008] 為買現本友明的上還目的，本友明邊提供一種馬齒莧中新骨架生物堿化合物的提 取分離方法，具體步驟為。
[0009] 步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃 縮，放涼至室溫，得藥液備用；
[0010]步驟2、將步驟1中藥液用乙酸乙酯反復萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸 乙酯萃取物；
[0011] 步驟3、將步驟2中乙酸乙酯萃取物經硅膠柱層析分離，依次用石油醚-丙酮梯度洗 脫得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫 部位經減壓濃縮至干，得到濃縮物備用；
[0012] 步驟4、將步驟3中所得物再經預處理的0DS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵 合硅膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯 色，將各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得到濃縮物備用；
[0013] 步驟5、將步驟4中所得各濃縮物經預處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠） 層析分離，分別以甲醇-水梯度洗脫，得到來源于馬齒莧的新骨架生物堿化合物。
[0014] 所述0DS和Sephadex LH-20凝膠的預處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇 洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。
[0015]與現有技術相比本發明的有益效果。
[0016]本發明中所述馬齒莧新骨架化合物的分離和藥理活性研究未被現有的論文期刊 所報道;本發明提供來源于馬齒莧的新骨架生物堿化合物及一種針對本發明新化合物的提 取分離方法，依次采用水煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱、及Sephadex LH-20，成功提取分離出骨架獨特的新生物堿化合物，該方法操作步驟僅為五步，操作方法 簡便及快速，提取分離過程主要采用水提取及乙酸乙酯萃取，工藝方法環保，且經該方法分 離得到的化合物純度較高均大于90%，此外經研究表明以上各化合物具有抗炎、鎮痛和抗 腫瘤作用，因此本發明三種新化合物及其鹽和衍生物可以作為其他化合物合成先導物，以 及新藥開發和藥理活性研究的原料，亦可用于制備抗炎、治療疼痛和抗腫瘤的藥物。
【附圖說明】
[0017]圖1為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的紫外光譜圖。
[0018]圖2為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的紅外光譜圖。
[0019]圖3為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的高分辨質譜圖。
[0020] 圖4為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracimine h-NMR光譜圖。
[0021]圖5為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracimine 13C-NMR光譜圖。
[0022]圖6為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。 [0023]圖7為本發明新骨架生物堿化合物Olerac imine的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0024]圖8為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振HMBC光譜圖。
[0025]圖9為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振HSQC光譜圖。
[0026]圖10為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁共振N0ESY光譜圖。
[0027]圖11為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的紫外光譜圖。
[0028]圖12為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的紅外光譜圖。
[0029]圖13為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的高分辨質譜圖。
[0030] 圖14為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracimine A h-NMR光譜圖。
[0031] 圖15為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracimine A 13C-NMR光譜圖。
[0032]圖16為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振碳譜(DEPT)光譜 圖。
[0033]圖17為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0034]圖18為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振HMBC光譜圖。
[0035]圖19為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振HSQC光譜圖。
[0036]圖20為本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁共振N0ESY光譜圖。
[0037]圖21為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的紫外光譜圖。
[0038]圖22為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的紅外光譜圖。
[0039]圖23為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的高分辨質譜圖。
[0040] 圖24為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracone A h-NMR光譜圖。
[0041 ] 圖25為本發明新骨架生物堿化合物的Oleracone A 13C_NMR光譜圖。
[0042]圖26為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振碳譜(DEPT)光譜圖。 [0043]圖27為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振1H-hCOSY光譜圖。 [0044]圖28為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振HMBC光譜圖。
[0045]圖29為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振HSQC光譜圖。
[0046]圖30為本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁共振N0ESY光譜圖。
【具體實施方式】 [0047] 實施例1。
[0048]本發明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H26N20，化學結構式為：
[0049]
[0050]所述新骨架生物堿化合物根據結構命名為Oleracimine，表1為該新骨架生物堿化 合物的核磁數據:^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0051 ]表1:本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine的核磁數據。
[0052]
[0053]請參閱圖1-10,本發明一種新骨架生物堿化合物的結構鑒定與推導。
[0054] Oleracimine:黃色粉末，[a]2QD+4.2(c 0 · 38，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(MeOH)A max: 448， 272nm，IRvN-h3354，vc=01666，v c=N1554，δΝ-h1510，vc-Nl〇49cm- 1，HRESI ( + )T0FMS給出m/z : 287.2118[M+H]+的準分子離子峰，分子量為286.2045。結合1H-NMR，13C-NMR以及DEPT數據， 推測該化合物可能的分子式SC 18H26N20，不飽和度為7。13C-匪R譜和DEPT譜顯示18個碳信 號，分別為 7個〇130:14.4,21.2,27.4,28.6,28.8,29.1，32.5)、2個(：!12(3 :46.8,52.3)、9個 季碳（一個羰基碳，δ :206.2;-個碳氮雙鍵的碳，δ: 169.4;四個雙鍵碳，δ :11〇. 7,121.3， 141 · 0，143 · 5;三個脂肪碳，δ: 38 · 9，50 · 6，65 · 7)。
[0055] h-NMR譜顯示一個活潑Η信號δ4.07(1H，s)，表明其可能在一個氨基基團。7個甲基 信號，分別為 Sl.l6(3H，s)，Sl.29(3H，s)，Sl.30(3H，s)，Sl.34(3H，s)，Sl.45(3H，s)，Sl.82 (3!1，8)』1.88(3!1，8)。2個亞甲基信號分別為52.02(1!1，(1，1=13.5)，51.47(1!1，(1，1=13.5) 和32.56(1!1，(1，1=15.3)，52.28(1!1，(1，1=15.3)，根據!1-!1邙3￥譜可知，7個甲基中!1譜3 1.88與51.82相耦合，31.45與51.30相耦合，31.16與51.34、31.29相耦合。而51.82與31.88 相對于其他甲基化學位移較大，可能與雙鍵相連。
[0056] HMBC 譜相關峰表明 H2-6 與 C-5，C-7，C-8，C-9，C-4a 和，C-14; H2-9 與 C-6，C-7，C-8，C-10，C-16 和 C-17; H3-14 與 C-6，C-7，C-8，C-9 和 C-10; H3-15 與 C-8 和 C-8a; H3-16 與 C-9，C-10 和 C-17;H3-17與C-9，C-10和C-16有耦合作用，說明存在兩個六元環結構，此兩個六元環公用 C-7，C-8，C-8a三個碳原子，且結合H-H COSY譜可知，兩個甲基C-16，C-17連接在C-10上，一 個甲基C-14連接在C-7上。C-8a，C-10和C-2出現在碳譜低場區（SC-8a: 141.0，δ〇10:50.6，δ C-2:65.7)，說明此三個碳原子與Ν相連。由HMBC相關譜顯示H3-l 1與C-2，C-3和C-12; H3-l 2與 C-2，C-3和C-l 1; Η3-13與C-3，C-4和C-4a的耦合關系可知，另有一六元環片段與上述兩個六 元環共用C_4a，C-8a和N三個原子，一個甲基C-13連接在C-4上，且結合H-H COSY譜可知兩個 甲基C-l 1，C-12均連接在C-2上。此外，季碳原子C-5出現在碳譜低場區（δ(：-5:169.4)，可推 測得知亞胺基團與C-5相連。根據以上信息，此新骨架生物堿為上述結構。
[0057]本發明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H24N2O2,化學結構式為：
[0058]
[0059]所述新骨架生物堿化合物根據結構命名為Oleracimine Α，表2為該新骨架生物堿 化合物的核磁數據:^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0000]表2:本發明新骨架生物堿化合物Oleracimine A的核磁數據。
[0061]
[0063] 請參閱圖11-20,本發明一種新骨架生物堿化合物的結構鑒定與推導。
[0064] Oleracimine A:黃色粉末，[a]2QD-13(c 0· 1，MeOH)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、 微溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(MeOH)A max: 446， 268nm,IRvN-H 3470,3290,ν〇=〇 1712,1668,5n-h 1628,v〇=n 1578,vc=c 1531,v〇-n 1312cm-l, HRESI( + )T0FMS 給出 111/2:301.1912[]\1+!1]+的準分子離子峰，分子量為300.1833。結合1!1-匪1? ， 13C-NMR以及DEPT數據，推測該化合物可能的分子式為C18H24N 2〇2，不飽和度為8。13C-NMR譜 和 DEPT 譜顯示 18 個碳信號，分別為 6 個(?3(δ:14·7,25·5,27·6,27·8,28·4,28·7)、?Αα?2(δ: 43.3)、1個ΟΚδ: 22.1)、10個季碳(兩個羰基碳，206.6，212.1; -個碳氮雙鍵的碳，166.8;四 個雙鍵碳，δ :110.6,122.2,140.3,142.0;三個脂肪碳，δ :49.3,60.2,65.9)。
[0065] 匪R譜顯示兩個活潑Η信號64.07(1!1，8)、61.62(2!^8)，表明存在兩個氨基基 團。6個甲基信號，分別為Sl.31(3H，s)J1.34(3H，s)，Sl.37(3H，s)J1.44(3H，s)J1.49 (3!1，8)』1.95(3!1，8)。1個亞甲基信號為52.85(1!1，(1，了=17.1)，52.60(1!1，(1，了=17.1)，1個 次甲基信號為S2.〇2(lH，s)。根據H-H COSY譜可知，6個甲基中，δ?.37與δ?.49相耦合，δ?.44 與si. 34相耦合，δ?. 31與δ2.85相耦合。而δ?.95相對于其他甲基化學位移較大，可能與雙鍵 相連。
[0066]由HMBC譜所示，H2-10/與C-l，C-2，C-7，C-8a，C-9和C-16;Hi-3a與C-8和C-8a;H 3-l 1 與C-2，C-3和C-12;H3-12/與C-2，C-3and和C-l 1; H3-I6與C-l，C-2，C-8a和C-10相互耦合，提 示存在一個六元環和一個五元環，兩環公用C-1和C-8a兩個碳原子，C-1和C-3出現在低場區 (δ〇1:49.3，δ〇3:60.2)，提示C-2所在羰基位于C-1和C-3之間，甲基C-16連接在C-1上，C-8 和C-9出現在碳譜低場區（δ〇8:142.0，δ(：-9:166.8)，說明雙鍵碳原子C-8與伯胺基團相連， 亞胺基團位于C-9上。結合H-H COSY譜推測可知，兩個甲基C-l 1，C-12連接在C-3上。此外，根 據 HMBC 譜，可知 Hi-3a/與 C-5; H3-l 3 與 C-4，C-5 和 C-14; H3-14/與 C-4，C-5 和 C-13; H3-15 與 C-5，C-6和C-7的耦合關系，提示存在另外一個七元環結構與上述兩環共用C-3a，C-7和C-8a三 個碳原子，提示C-5所在羰基與C-4相連。綜合考慮HMBC譜和H-H COSY譜，可知甲基C-15連接 在C-6上，甲基C-13和C-14均與C-4相連。根據以上信息描述，可確定此新骨架生物堿結構如 上所述結構。
[0067]本發明提供一種新骨架生物堿化合物，分子式為C18H28N20 2,化學結構式為：
[0068]
[0069]所述新骨架生物堿化合物根據結構命名為Oleracone A，表3為該新骨架生物堿化 合物的核磁數據:^-NMR與13C-NMR在CDC13中。
[0070] 表3:本發明新骨架生物堿化合物Oleracone A的核磁數據。
[0071]
[0072]
[0073] 請參閱圖21-30,本發明一種新骨架生物堿化合物的結構鑒定與推導。
[0074] Oleracone A:褐色粉末，[a]2QD+20(c 0.1，Me0H)，易溶于氯仿和甲醇等，不溶、微 溶于水。噴稀碘化鉍鉀試液顯紅棕色，提示該化合物為生物堿成分，UV(Me0H)Amax:339， 273nm，IRvN-η 3330,3278，vc=h 3075，vc=〇 1655，1620，vc=c 1506，vc-n 1258，1160cm-l， HRESI ( + )T0FMS給出m/z : 305.2359[M+H]+的準分子離子峰，分子量為304.2280。結合1H-NMR ，13C-NMR以及DEPT數據，推測該化合物可能的分子式為C18H28N 2〇2，不飽和度為6。13C-NMR譜 和 DEPT 譜顯示 18 個碳信號，分別 7 個 CH3(S:20.3,22.0,24.4,24.6,25.2,27.3,29.0)、lfCH2 (δ:42·7)、3 個〇Κδ:44·0,48·3，112·0)、7 個季碳(兩個羰基碳，169·5,200·6;三個雙鍵碳， δ :101.0,132.0,152.7;兩個脂肪碳，δ :51.0,58.1)。
[0075] 々-Μ?譜顯示兩個活潑Η信號64.61(1!1沁8)、65.40(1!^8)，表明存在兩個氨基基 團。7個甲基信號，分別為 δ1·08(3Η，8)，δ1·09(3Η，8)，δ1·09(3Η，(1，7·3)δ1·29(3Η，8)，δ1·39 (3Η，s)J1.90(3H，s)J2.35(3H，shl個亞甲基信號為δ2.33(lH，d，J= 13.9)，δ2.19( lH，d， 了=13.9)，3個次甲基信號為62.44(3!14，了 = 7.3)，62.92(1!14，了 = 5.2)，65.05(1!1，(1，了 = 6.25)。由!1-!1〇)5￥譜可知，有相互耦合關系的!1為51.09與52.44,51.08與51.29,51.09與3 1.39,32.92與35.05,32.35與34.61。而31.90和32.35相對于其他甲基化學位移較大，可能 與雙鍵相連。
[0076] HMBC譜所示相關峰如下所述，H3-2與C-1，活潑HS5.40(lH，b S)與C-1和C-2相互耦 合，說明存在一個乙酰基片段。出-2'與(：-3'，(：-4'，(：-9'3，(：-10'和(：-15'；!1 2-4'與(：-3'，(：-5'，C-6'，C-10'和C-ΙΓ ;Ηι-6'與C-4'，C-6'a和C-9'a;Hi-6'a與C-5'和C-6' ；H3-10'與C-3'， C-4 '，和C-l Γ ;H3-l Γ 與C-3 '，C-4 ' 和C-10 ' ；H3-15 ' 和C-Γ 和C-9 'a相互耦合，考慮到C-Γ 和 C-3 '的化學位移偏大，推測與仲胺基團相連，如此可斷定一個八元環片段的存在，甲基C-15'位于C-Γ上，因 C-5'出現在碳譜低場區〇(：-5'：132.0)，推斷其與上述酰胺基團的仲氨 基相連，結合H-H COSY譜可知兩個甲基C-10 '，C-1Γ均連接在C-3 '上。此外，根據HMBC譜可 知Hi-6'a/與C-7'，C-8'，C-9'，C-9'a，C-12'和C-13' ；Ηι-9'與C-6'，C-6'a，C-7'，C-8'，C-9'a 和C-14' ；H3-12'與C-6'a，C-7'和C-13' ；H3-137與C-6'a，C-7'和C-12' ；H3-14'與C-8'和C-9 '相互耦合，證明一個五元環片段的存在，甲基C-14 '與C-9 '相連，根據ft-9 '與C-8 '的耦合 關系和C-7 '較大的化學位移可推斷C-8 '所在的羰基連在出-7 '與C-9 '之間，并且該五元環 與上述八元環共用C_6'a和C_9'a兩個碳原子，結合H-H COSY譜所示δ1.〇9與δ?.39的相互耦 合可斷定兩個甲基C-12'和C-13'均連在C-7'上。綜合以上信息推斷，可確定此新骨架生物 堿結構如上所述。
[0077]本發明還提供上述新骨架生物堿化合物的提取分離方法，具體步驟為。
[0078]步驟1:稱取馬齒莧干燥藥材150kg，采用水煎煮提取，水用量為藥材的8~16倍，煎 煮提取兩次，每次煎煮2小時，水提液濾過，合并濾液直接加熱濃縮，放涼至室溫，得藥液備 用。
[0079]步驟2:將步驟1中所得藥液，用乙酸乙酯反復萃取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積 比例為1:1(^4,40°(：以下減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
[0080] 步驟3:將步驟2中所得乙酸乙酯萃取物干法上樣，經硅膠柱層析分離，其中硅膠為 200~300目，依次用石油醚-丙酮（1:1、1 :2、1:3、1:5，￥:￥)梯度洗脫，共得到150個部位（即 共得到150個瓶，每瓶400mL)，經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的90~130洗脫部位（即 合并顯色的90~130瓶，棄去1~89瓶與131~150瓶），將合并后的90~130部位經40 °C以下 減壓濃縮至干，備用。
[0081] 步驟4:將步驟3中所得物再經預處理的0DS中壓柱層析分離，其中填料粒度為20~ 40μL?，用甲醇-水（10/90，30/70，50/50，70/30，100/0，v/v)梯度洗脫（加壓，使流速為lml/ min，溫度為室溫），得到10個部位（即梯度洗脫得10個瓶，每瓶200mL)，經薄層色譜進行檢 測，顯色，將顯色的部位分別合并，50°C以下減壓濃縮至干，備用。所述0DS的預處理過程為 甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。
[0082] 步驟5:將步驟4中所得各顯色部位經預處理的Sephadex LH-20柱層析，分別以甲 醇-水(70/30，v/v)等度洗脫，得到新骨架生物堿化合物。經超高效液相色譜，歸一法測定純 度均為90~99%。所述Sephadex LH-20凝膠的預處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲 醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平衡。
[0083]本發明新骨架生物堿化合物的抗炎作用。
[0084] 1、主要材料。
[0085] 1.1、藥品和試劑：實驗所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國 Hyc 1 one公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）；LPS (美國Si gma公司）；IL-6、TNF-α、PGE2 的EL ISA試劑盒(美國Cayman公司）；細胞裂解液、Gr i e s s試劑(碧云天生物技術有限公司）
[0086] 1 · 2細胞株:RAW264 · 7巨噬細胞(美國ATCC細胞庫）
[0087] 1.3分組:分為對照組、LPS組和實驗組，各一組。
[0088] 2實驗方法。
[0089] 2.1細胞培養，DMEM高糖培養基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C02培養箱中培養。
[0090] 2.2MTT比色法測定細胞活力，上述三組分別取對數生長期RAW264.7巨噬細胞接種 于96孔培養板中，細胞密度為1 X 104個/mL，每孔100yL，溫度37°C，5%C02條件下培養過夜 后，實驗組加入不同濃度的本發明三種新化合物〇leracimine( 1_50μΜ)或oleracimine A (1-50μΜ)或oleracone Α(1-50μΜ)，孵育lh后向LPS組和實驗組分別加入終濃度為lyg/mL的 LPS，另設調零組(含DMS0溶媒的培養液），每組設3個復孔，考察加入藥物后對細胞的影響。 上述各組細胞培養24h后，在各孔細胞中加入5mg/mL MTT 20yL，溫度37°C，5%C02條件下繼 續孵育4h后，終止培養，吸棄孔內液體，每孔加入100yL二甲基亞砜(DMS0)，振蕩10min，使細 胞內結晶充分溶解，酶標儀570nm波長處測定各孔吸光值。
[0091] 2.3利用格里斯(Griess)法測定N0的含量，考察本發明三種新化合物對LPS誘導的 小鼠巨噬細胞RAW264.7的N0產生量的抑制作用。小鼠巨噬細胞RAW264.7傳代后在含10 %胎 牛血清的高糖細胞培養基D Μ E Μ中培養，實驗組加入不同濃度的本發明三種新化合物 oleracimine(l_20yM)或oleracimine Α(1_20μΜ)或oleracone Α(1_20μΜ)，在37°C，5%C〇2 條件下孵育lh后用LPS(終濃度為lyg/mL)誘導炎癥反應，24h后收集上清液，每組處理重復3 孔。Griess法測定細胞上清液中N0的含量，根據不同濃度本發明三種新化合物對LPS誘導的 RAW264.7細胞釋放N0的影響，用以反映 N0水平。
[0092] 2.4ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF-a和炎癥介質PGE2:將對數生長期RAW264.7巨 噬細胞接種于24孔培養板中，細胞密度為1 X 105個/mL，每孔lmL，溫度37°C，5%C02條件下培 養過夜，實驗組加入本發明三種新化合物oleracimine(1_20μΜ)或oleracimine Α(1_20μΜ) 或oleracone Α(1-20μΜ)，培育lh后，在每孔加入LPS(終濃度為lyg/mL)，共孵育24h，每組處 理重復3孔。ELISA法測定三種馬齒莧來源新生物堿處理后的RAW264.7巨噬細胞分泌的IL-6、TNF_a和PGE 2的含量。
[0093] 3實驗結果。
[0094]實驗結果表明本發明三種新化合物對LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7的增殖無影 響，安全無毒;并可有效抑制LPS誘導的巨噬細胞RAW264.7所產生過量炎癥細胞因子IL-6、 TNF-a和炎癥介質NO、PGE2，且呈濃度依賴。
[0095]細胞相對存活率實驗結果如表4所示。
[0096] 表4:本發明對RAW264.7巨噬細胞相對存活率的影響。
[0097]
[0098]
[0099] 注:*P〈0.05與對照組比較(高濃度組有顯著性差異）。
[0100]利用格里斯(Griess)法測定N0的含量實驗結果見表5。
[0101] 表5:本發明對LPS誘導的RAW264.7細胞釋放N0的影響（均數土標準差，η = 3)。
[0102]
[0104] 注:*P〈0 · 05與對照組比較，#P〈0 · 05與LPS組比較。
[0105] ELISA法測定炎癥因子IL-6、TNF_a和炎癥介質PGE2結果如表6所示。
[0106] 表6:本發明對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌的IL-6、TNF-a和PGE2含量的影響（均 數土標準差，n = 3)。
[0107]
[0109] 注，P〈0 · 05與對照組比較，#P〈0 · 05與LPS組比較。
[0110] 本發明新骨架生物堿化合物的鎮痛作用。
[0111] 1主要藥品和試劑。
[0112] 實驗所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為99%，精密稱取，用生理鹽 水稀釋至下述各劑量組所需溶液。致痛劑為〇 . 6 %乙酸，用生理鹽水配制。鹽酸嗎啡注射液 (沈陽第一制藥廠），用生理鹽水稀釋至下述劑量溶液。
[0113] 2實驗動物。
[0114] 昆明種雄性小鼠，體重為20±2g，清潔級，由大連醫科大學實驗動物中心提供。室 溫20~25°C，自由飲食，實驗室適應一周后用于實驗。
[0115] 3實驗方法。
[0116] 取健康小鼠，雌雄各半，共150只小鼠，體重20±2g，隨機分為三組空白對照組、九 組實驗組(分別為本發明三種新骨架生物堿化合物高劑量組(2mg/kg)、本發三種明新骨架 生物堿化合物中劑量組（lmg/kg)、本發明三種新骨架生物堿化合物低劑量組(0.5mg/kg)、、 三組陽性藥組(5mg/kg)共計組十五，每組10只。
[0117] 各組小鼠灌胃給予受試藥物，每日兩次，連續給藥3天。空白對照組給予等體積的 生理鹽水，陽性藥組給予鹽酸嗎啡注射液。末次給藥1小時后，各組小鼠腹腔注射0.6%乙酸 (0. lmL/10g體重），觀察30分鐘內各組小鼠扭體出現時間、扭體次數、扭體結束時間，與空白 對照組比較計算各組鎮痛抑制率。按下式計算鎮痛抑制率，對各組小鼠扭體次數進行統計 分析，P<〇. 05為有顯著差異。
[0118] 抑制率％ =(空白對照組平均扭體數一給藥組平均扭體數)/空白對照組平均扭體 數 X100%〇
[0119] 4實驗結果。
[0120]空白對照組小鼠腹腔注射乙酸后表現為顯著的扭體次數多，表現出強烈的疼痛反 應;與空白對照組比較，中、高劑量組及陽性藥組扭體次數及扭體結束時間均有減少趨勢， 本發明新骨架生物堿化合物高劑量組、中劑量組、低劑量組及陽性藥組潛伏期均有不同程 度延長趨勢。結果表明本發明新骨架生物堿化合物對乙酸致小鼠扭體反應有一定的鎮痛作 用。具體實驗結果如表7所示。
[0?21 ]表7:本發明對乙酸致扭體反應小鼠的鎮痛作用影響(均數土標準差，η = 10)。
[0122]
[0123 ] 注:*P〈〇 · 05廣P〈0 · 01廣*P〈0 · 001與空白對照組比較。
[0124] 本發明新骨架生物堿化合物的抗腫瘤作用。
[0125] i主要材料。
[0126] 1.1藥品和試劑：實驗所用新骨架生物堿化合物由上述方法制備，純度為90~ 99%，精密稱取，用DMS0稀釋至下述各劑量組所需溶液。DMEM高糖培養基、胎牛血清（美國 Hyclone公司）；青霉素、鏈霉素(杭州四季青公司）；
[0127] 1.2細胞株:人結腸癌細胞Caco-2、人乳腺癌細胞MCF-7、人胃癌細胞BGC-823、人肺 腺癌細胞SPC-A1、人肝癌細胞BEL-7402、人宮頸癌細胞Hela-229、卵巢癌細胞Ho-8910、人類 口腔表皮樣癌細胞KB (中科院上海細胞庫）。
[0128] 1.3分組:分為對照組、實驗組和調零組(含DMS0溶媒的培養液）。
[0129] 2實驗方法。
[0130] 2.1細胞培養，DMEM高糖培養基，加入10 %的胎牛血清，1 %抗菌素（100U/mL青霉素 和100yg/mL鏈霉素），置于37 °C、5 % C02培養箱中培養。
[0131 ] 2.2MTI法檢測細胞增殖，取對數生長期細胞接種于96孔培養板中，細胞密度為1 X 104個/mL，每孔100yL，溫度37°C，5%C02條件下培養過夜后，實驗組加入不同濃度的本發明 三種新化合物，每組設3個復孔，加藥后置于37 °C，5 % C02培養箱中培養48h。將含藥培養液 吸去，加入體積比為4:1的無血清培養液和MTT (終質量濃度為5mg/mL)共1 OOmL，繼續孵育 4h，小心吸去上清液后，每孔加入DMS0 150yL，放于震蕩器上震蕩以使結晶完全溶解 (5min)，酶標儀在570nm波長下檢測各孔的吸光度(A)值。然后，計算各濃度化合物對細胞生 長的抑制率，抑制率公式:細胞生長抑制率=(1-A細fL/A*ML) X 100%，再應用SPSS軟件處理 數據，將抑制率對藥物濃度作曲線，計算IC5〇值。
[0132] 3實驗結果。
[0133] 實驗結果表明本發明三種新化合物對人結腸癌細胞Caco-2、人乳腺癌細胞MCF-7、 人胃癌細胞BGC-823、人肺腺癌細胞SPC-A1、人肝癌細胞BEL-7402、人宮頸癌細胞Hela-229、 卵巢癌細胞Ho-8910、人類口腔表皮樣癌細胞KB、的增殖具有抑制作用，且隨藥物濃度增大， 抑制率也明顯升高，即呈濃度依賴。本發明三種新化合物對上述八種腫瘤細胞IC 5Q值見表8。
[0134] 表8本發明三種新化合物對腫瘤細胞的抑制作用。
[0135]
[0136] 綜上所述，本發明提供三種新骨架生物堿化合物及其提取分離方法，依次采用水 煎煮提取、乙酸乙酯萃取、硅膠柱層析、0DS中壓柱層析、及Sephadex LH-20柱層析，成功的 提取分離出新骨架生物堿化合物，該方法簡便，快速，環保，且經該方法分離得到的化合物 純度較高，由于所得三種化合物化學結構獨特，從常用中藥馬齒莧中提取出來，其具有抗 炎、鎮痛、抗腫瘤作用，因此本發明三種新化合物及其鹽和衍生物可以作為天然產物開發中 藥新藥，具有廣闊的前景。
【主權項】
1. 一種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子為C18H26N2O 3,命名為 Oleracimine，化學結構式如下。2. -種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子式為C18H24N2O2，命名為 Oleracimine，化學結構式如下。3. -種馬齒莧中新骨架生物堿化合物，其特征在于，分子式為C18H28O2,命名為 Oleracone A，化學結構式如下。4. 如權利要求1至3所述的化合物的提取分離方法，其特征在于，具體步驟為： 步驟1、取馬齒莧干燥藥材，采用水煎煮提取，水提液過濾，合并濾液直接加熱濃縮，放 涼至室溫，得藥液備用； 步驟2、將步驟1中濃縮液用乙酸乙酯反復萃取，減壓回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙 脂萃取物； 步驟3、將步驟2中乙酸乙脂萃取物經硅膠柱層析分離，依次用石油醚-丙酮梯度洗脫得 到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，合并顯色的洗脫部位，將合并后的洗脫部位 經減壓濃縮至干，備用； 步驟4、將步驟3中所得物再經預處理的ODS柱(Octadecylsilyl，十八烷基硅烷鍵合硅 膠填料)層析分離，用甲醇-水梯度洗脫，得到若干洗脫部位，經薄層色譜進行檢測，顯色，將 各顯色的洗脫部位分別減壓濃縮至干，得濃縮物備用； 步驟5、將步驟5中所得各濃縮物經預處理的Sephadex LH-20(羥丙基葡聚糖凝膠），分 別以甲醇-水等度洗脫得到來源于馬齒莧新骨架生物堿化合物。5. 如權利要求1所述提取分離方法，其特征在于，所述步驟1中水煎煮提取兩次，每次煎 煮2小時，水用量為藥材的8~16倍。6. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于，所述ODS和Sephadex LH-20凝膠的 預處理過程為甲醇浸泡過24小時，上柱，用甲醇洗至滴入水中無混濁，再以初始流動相平 衡。7. 如權利要求1所述的提取分離方法，其特征在于，所述步驟2中濃縮液用乙酸乙酯萃 取3次，乙酸乙酯與濃縮液的體積比為10:1。8. 如權利要求4所述的化合物用于制備抗炎、鎮痛和抗腫瘤的藥物或保健品。
【文檔編號】A61P35/00GK106008502SQ201610398734
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】英錫相, 英哲銘, 張文潔, 李翠玉
【申請人】遼寧中醫藥大學