一種靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法
【專利摘要】本發明公開了一種靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法，其中靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的結構式為：本發明熒光探針分子水溶性良好，具有較小的毒性。其單光子激發波長為540nm，雙光子激發波長為800nm，均可以靶向細胞核仁，可以用于活體細胞的顯微成像。
【專利說明】
一種靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及 其合成方法 一、
技術領域
[0001] 本發明涉及一種生物熒光探針及其合成方法，具體地說是一種靶向細胞核仁的噻 吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法。 二、
【背景技術】
[0002] 近年來，隨著人們生活質量的提高，健康問題成了人們越來越關注的主題。化學家 希望合成一些生物相容性的發光小分子，以此作為熒光探針，在細胞、組織或活體中實現對 疾病的可追蹤性、可視性和可治療性。
[0003] 小分子熒光探針因分子量小、合成方法簡單、溶解性好等優點，有關的研發與應用 探索工作廣受關注。
[0004] 相關資料顯示，核仁是細胞核內生產核糖體的場所，所有真核生物的核糖體RNA (rRNA)的轉錄都是在核仁中完成，其過程是由rDNA轉錄成rRNA，rRNA與來自細胞質的蛋白 質結合，進而加工、改造成核糖體的前體，輸送到細胞質。細胞核仁組成成分復雜，包括 rDNA，rRNA和核糖核蛋白等。核仁是rRNA基因存儲、rRNA合成加工以及核糖體亞單位的裝配 場所。而DNA是基因的基本單元，因此，核仁及其功能的研究具有非常重要的意義。
[0005] 隨著生物顯影材料的發展，雙光子熒光探針引起了人們的廣泛關注。雙光子顯微 成像的激發波長較長，具有較低激發能量和較強的穿透性，而且光損傷較小。顯然，制備激 發波長更長，毒性較小，生物相容性較好的小分子熒光探針，定能促進細胞顯影成像技術的 發展。
[0006]
【申請人】對本申請的主題進行了如下的文獻檢索：
[0007] 1、 http://scholar.glgoo.org/網檢索結果：（2016/4/28)
[0008]
[0009]
[0010] 2、中國知網檢索結果：
[0011] 檢索方式一：
[0012] 篇名-靶向細胞核仁的吡啶鹽生物顯影材料及其合成方法:無相關文獻。
[0013] 篇名-靶向細胞核仁的小分子噻吩基吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法:無相關 文獻。
[0014] 篇名-靶向細胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方 法:無相關文獻。
[0015] 檢索方式二：
[0016] 全文-靶向細胞核仁的六氟磷酸吡啶鹽:8篇相關文獻，但均與靶向細胞核仁的小 分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方法無關。
[0017] 全文-靶向細胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其合成方 法:29篇相關文獻，但均與靶向細胞核仁的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及 其合成方法無關。 三、
【發明內容】
[0018] 本發明旨在提供一種靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針及其 合成方法，所要解決的技術問題是遴選合適的分子結構使其可以作為靶向細胞核仁的熒光 探針。
[0019] 本發明基于吡啶為母體，引入乙烯、富電子的噻吩環構筑大的共輒體系，借助六氟 磷酸根調節化合物的結晶性，設計合成了水溶性好的陽離子型有機小分子熒光探針，期望 其在生物顯影方面有所應用。
[0020] 本發明熒光探針分子水溶性良好，具有較小的毒性。其單光子激發波長為540nm， 雙光子激發波長為800nm，均可以靶向細胞核仁，可以用于活體細胞的顯微成像。
[0021] 本發明靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針，其結構式為：
[0022]
[0023]本發明靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的合成方法，包括如 下步驟：
[0024] 1、4_甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ的合成
[0025] 50mL圓底燒瓶中加入43.2g(0.3moL)碘甲烷，稱取18.6g(0.2moL)4-甲基吡啶，用 10mL乙醇稀釋，通過恒壓漏斗緩慢滴入燒瓶，滴完后，常溫攪拌反應40分鐘，移去恒壓漏斗， 45°C下繼續攪拌10分鐘，冷卻、得白色晶體，過濾，并用少量乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物 即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M。
[0026] 2、目標分子P1的合成
[0027] 250mL 圓底燒瓶中加入 4.76g(183.27g/mol，0.026mol)4-N，N-二乙基噻吩甲醛、 6.11g(235.07g/mol，0.026mol)4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴 催化劑哌啶，70°C下攪拌回流反應10小時，得紫紅色溶液；向所述紫紅色溶液中滴加20mL六 氟磷酸銀(252.83g/mol，0.026mol)的甲醇溶液，攪拌回流反應3小時，反應結束后向反應液 中加入100mL無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍紫色沉 淀析出，抽濾，乙醇重結晶，得目標產物，為藍紫色棒狀晶體。
[0028]本發明合成路線如下：
[0029]
[0030]與已有技術相比，本發明的有益效果體現在：
[0031] 1、本發明合成的小分子噻吩基六氟磷酸吡啶鹽P1是一類光學性質優良、生物相容 性好的生物顯影材料；
[0032] 2、本發明合成的目標產物原料易得、成本低、合成步驟簡單、毒性小、溶解性好，使 其商業化成為可能；
[0033] 3、本發明合成的目標產物可以作為單光子熒光探針，其激發波長在540nm，發射波 長在近紅外波段。單光子激發能量比常用核仁染料Syt〇9低，即對細胞的損傷較小。較常用 商染的激發波長488nm的能量低，對細胞損傷小；
[0034] 4、本發明合成的目標產物還可以作為雙光子熒光探針，其激發波長在800nm處的 近紅外區，具有更低的激發能量、更強的穿透性、對細胞的光損傷更小等特點，而常用商染 無雙光子熒光；
[0035] 5、本發明合成的目標產物，可以作為一種靶向細胞核仁的熒光探針。與常用商染 相比具有明顯的優勢，因此，具有較強的商業價值，有可能成為商業化核仁染料。 四、
【附圖說明】
[0036]圖1是目標分子P1的單晶結構圖（為了清晰，刪除了分子中的所有氫原子）<XCDC號 為1060367,說明目標分子是尚未見報道的新化合物。
[0037]圖2 (左)是不同濃度的P1在PBS緩沖溶液(pH=7.4)中的紫外-可見吸收光譜，測試 的濃度分別為2,4,6,8，10,20,30,40，\10^1〇1/1，左圖說明隨著？1濃度的增加，最大吸光 度值逐漸增大；圖2(右)是濃度與對應的最大吸光度作圖，從右圖中可以看出，目標分子的 濃度與對應的最大吸光度值呈線性關系，說明其水溶性良好。
[0038]圖3是目標分子P1的細胞毒性測試結果。分別用不同濃度的P1溶液培養人類肝癌 細胞(HepG2ce 11) 24小時。通過酶標儀，測試了不同濃度下的P1對Η印G2細胞的毒性大小，結 果表明，當Ρ1的濃度達到60Μ時，細胞的存活率仍接近90%，說明目標分子Ρ1的毒性較小，適 宜作為熒光探針應用于生物體。
[0039]圖4是目標分子Ρ1的細胞共聚焦顯影成像研究結果。將20Μ的Ρ1與HepG2細胞共培 養30分鐘，用PBS緩沖溶液洗滌3次。通過共聚焦顯微成像，得到單、雙光子熒光圖、明場圖、 疊加圖和三維圖。從圖中看出，P1可以穿過細胞膜，進入HepG2細胞的核仁區域，并發出較強 的熒光。說明P1可以作為細胞核仁的單雙光子熒光探針。
[0040]圖5是目標分子P1與常用核仁商染Syt〇9的單光子熒光共定位分析研究結果。從圖 中可以清楚地看出，P1可以穿過HepG2細胞膜，并能很好地進行細胞核仁著色。通過計算，P1 與Syto9的共定位相關系數(Overlap Coefficient)!?值為0.8397。說明目標分子P1可以革巴 向定位活細胞的核仁區域。 五、
【具體實施方式】
[0041 ] 1、4_甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ的合成
[0042] 50mL圓底燒瓶中加入43.2g(0.3moL)碘甲烷，稱取18.6g(0.2moL)4-甲基吡啶，用 10mL乙醇稀釋，通過恒壓漏斗緩慢滴入燒瓶，滴完后，常溫攪拌反應40分鐘，移去恒壓漏斗， 45°C下繼續攪拌10分鐘，冷卻、得白色晶體，過濾，并用少量乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物 即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M。
[0043] 2、目標分子P1的合成
[0044] 250mL 圓底燒瓶中加入 4.76g(183.27g/mol，0.026mol)4-N，N-二乙基噻吩甲醛、 6.11g(235.07g/mol，0.026mol)4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽Μ和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴 催化劑哌啶，70°C下攪拌回流反應10小時，得紫紅色溶液；向所述紫紅色溶液中滴加20mL六 氟磷酸銀(252.83g/mol，0.026mol)的甲醇溶液，攪拌回流反應3小時，反應結束后向反應液 中加入lOOmL無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍紫色沉 淀析出，抽濾，乙醇重結晶，得目標產物，為藍紫色棒狀晶體。
[0045] ^-NMRCDMSO-de^OOMHz) ,5(ppm) :8.81 (s,lH),844(d,2H) ,8.03(m,2H) ,7.26(d, 1H)，6.42(d，lH) ,6.10(d，lH)，4.06(s，3H)，3.43(m，4H)，1.21(m，6H) .13C-匪R(100MHz, DMS〇-d6)，δ (ppm):162.23,153.05,143.37,137.97,135.73,127.94,122.63,120.44， 112.18,47.11,45.70,21.24.IR(KBr,cm _1)selected bands:2976(w),1646(m),1587(s), 1538(s),1518(m),1480(s),1441(s),1396(m),1358(m),1283(s),1244(s),1221(m),1188 (s),1128(m),1057(s),1039(m),998(m),935(m),834(s),760(m),662(w),560(s),533(w) ,MALDI-T0F:m/z, cal:273.14,found:273.25(M+) 〇
【主權項】
1. 一種靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針，其特征在于其結構式 為.2. -種權利要求1所述的靶向細胞核仁的噻吩基六氟磷酸吡啶鹽生物熒光探針的制備 方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M的合成 50mL圓底燒瓶中加入43.2g碘甲烷，稱取18.6g 4-甲基吡啶并用IOmL乙醇稀釋，通過恒 壓漏斗滴入燒瓶，滴完后常溫攪拌反應40分鐘，移去恒壓漏斗，45°C下繼續攪拌10分鐘，冷 卻、得白色晶體，過濾，用乙醇洗滌，干燥后得白色晶狀物即為4-甲基-N-甲基吡啶碘鹽M; (2) 目標分子Pl的合成 25〇1^圓底燒瓶中加入4.768 4，少-二乙基噻吩甲醛、6.1184-甲基，-甲基吡啶碘鹽 M和50mL甲醇，攪拌溶解，滴加5滴催化劑哌啶，70 °C下攪拌回流反應10小時，得紫紅色溶液； 向所述紫紅色溶液中滴加〇. 〇26mol六氟磷酸銀的甲醇溶液，攪拌回流反應3小時，反應結束 后向反應液中加入無水甲醇，熱抽濾出碘化銀沉淀，濾液旋出部分甲醇，靜置，冷卻，有藍紫 色沉淀析出，抽濾，乙醇重結晶，得目標產物，為藍紫色棒狀晶體。
【文檔編號】C09K11/06GK106008486SQ201610389375
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】田肖和, 張國翠, 柳詩潤, 潘輝, 周虹屏, 李勝利, 李飛, 吳杰穎, 田玉鵬
【申請人】安徽大學