一種新的查爾酮衍生物及其制備方法與在自身免疫病應用
【專利摘要】本發明公開了一種具有抗炎、免疫抑制作用的新的查爾酮衍生物及其制備方法與在制備自身免疫性疾病藥物中的應用。本研究采用活性亞結構拼接的方法，形成含氟查爾酮衍生物，再將含氟查爾酮衍生物與哌嗪片段連接起來，最后合成得到6個新的4’?(1?哌嗪基)查爾酮衍生物。基于體外免疫活性篩選及2個自身免疫性疾病(多發性硬化疾病動物模型和關節炎模型)為篩選平臺。本發明首次發現這6個化合物具有顯著的免疫抑制作用，在治療自身免疫性疾病(如：多發性硬化、類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡和腸炎)顯示出較好的藥物開發前景。
【專利說明】
一種新的查爾酮衍生物及其制備方法與在自身免疫病應用
技術領域
[0001] 本發明涉及醫藥領域，具體涉及一種具有免疫抑制作用的新的查爾酮衍生物及其 制備方法與在制備自身免疫性疾病藥物中的應用。 技術背景
[0002] 自身免疫性疾病是一類難治性的免疫紊亂而造成的疾病，尤其是類風濕關節炎、 多發性硬化和系統性紅斑狼瘡等以T細胞反應為主自身免疫性疾病一直困擾著很多病人， 這些疾病具有迀延日久、延綿難治的特點，一直是當今世界醫學領域的難題。免疫抑制劑可 通過調節免疫應答的各個環節阻斷疾病進程來達到治療自身免疫性疾病的目的。目前我國 的免疫抑制劑主要依賴進口，且多數免疫抑制劑對機體免疫系統的作用缺乏特異性和選擇 性，毒副作用大，限制了其在臨床廣泛應用。特別在眾多類型的自身免疫性疾病的治療中， 仍然缺乏療效可靠的藥物，目前在國際上雖然有一些新型的生物技術和常規免疫抑制用于 自身免疫性疾病的治療，但藥物的種類非常有限而價格昂貴，因此研制開發具有我國自主 知識產權的高效低毒的抗炎和免疫抑制創新藥物已成為當今醫學和藥學研究的緊迫課題。
[0003] 多發性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經系統炎性脫髓鞘病變為主 要特征的自身免疫性疾病，發病原因主要在于自身免疫T細胞破壞血腦屏障，炎癥介質進入 并攻擊神經系統，造成神經纖維上的髓鞘脫失、神經元及軸索損傷，炎癥細胞浸潤。如果未 及時規范診治，病情最終可導致失明、癱瘓、甚至死亡，因此這種病號稱"死不了的癌癥"。該 疾病白種人群較為高發，在我國發病率相對較低，但近年來呈現逐年增長的趨勢。由于對疾 病本身的了解有限，迄今為止沒有一種有效方法能將MS完全治愈，惟一的辦法就是靠藥物 控制病情的發展，如當下就連臨床中可選擇的藥物也是寥寥無幾，且高昂的藥費也絕非是 普通人可以承受的。MS治療藥物的告急，讓尋找療效好、價格低廉的藥物成為了一場激烈的 國際角逐戰，因此研究治療多發性硬化的藥物具有顯著的社會效益和經濟效益。
[0004] 類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵蝕性關節炎為主要表現的 全身性自身免疫病。我國大陸地區的RA患病率約為0.2%~0.4%。其主要結局是殘疾，在類 風濕關節炎自然病程中，5-10年的致殘率為60%，病程30年的致殘率為90%。壽命縮短10-15年，而伴關節外表現者的5年生存率僅為50%，極大影響了患病人群的生活質量，常規治 療本病雖有一定的療效，但存在毒副作用多，如胃腸道反應、肝腎功能損傷、骨髓抑制、皮疹 等不良反應，患者依從性差。生物制劑雖療效顯著，但經濟成本頗高，因此開發治療類風濕 性關節炎的藥物具有巨大的市場前景和社會價值。
[0005]查爾酮類化合物分子結構獨特，含有多個反應中心，可以與多種受體結合，從而表 現出廣泛的生物活性，是一類非常重要的有機合成及藥物合成中間體。從天然產物中提取 分離以及通過化學、生物等方法合成的查爾酮類化合物，表現出抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗菌 和免疫調節等多種藥理學性質，尤其在免疫調節方面對T、B淋巴細胞、巨噬細胞和抗原遞程 細胞等具有廣泛的調節作用，因此，查爾酮類化合物的研究與開發已成為藥物化學的一個 熱點研究領域。氮雜環化合物因其廣泛的生物活性和較好的有機催化活性，一直頗受人們 的青睞。哌嗪作為含氮雜環體系中的重要一員，具有優良的生物活性和低毒性的特點，其環 上的N原子可以參與生物體中氫鍵的形成，增加藥物與受體的親和力和選擇性，使該類化合 物在新藥研發方面顯示出越來越重要的作用。
[0006] 然而在免疫調節方面，單用查爾酮類化合物對免疫細胞缺乏特異性，目前查爾酮 類化合物對自身免疫性疾病動物模型缺乏深入評價，免疫調節和抗炎活性作用強度有限。 為進一步提高免疫調節和抗炎活性，我們采用亞結構拼接方法，再將查爾酮和哌嗪拼接，合 成一系列含有哌嗪的查爾酮類衍生物。經體外活性篩選及體內自身免疫性疾病動物模型評 價，首次發現含有哌嗪查爾酮類衍生物顯著抑制T淋巴細胞的增殖功能和炎癥因子的產生， 對風濕關節炎、多發性硬化等以T細胞反應為主自身免疫性疾病具有較好的治療效果，使該 類化合物在制備自身免疫性疾病藥物中具有較好的應用前景。
【發明內容】
：
[0007] 針對上述情況，本發明的發明目的是提供一種治療自身免疫性疾病的藥物及其制 備方法與應用。為解決本發明的技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0008] -種查爾酮衍生物的結構如式I所示：
[0009：
所述的式I中，R可以為4-二甲氨基、3-二 甲氨基、二甲氨基、4-二乙氨基、3-二乙氨基或2-二乙氨基。
[0010] 所述的查爾酮衍生物的制備方法為：取4-氟苯乙酮與對-二甲氨基苯甲醛或3-二 甲氨基苯甲醛或2-二甲氨基苯甲醛或對-二乙氨基苯甲醛或3-二乙氨基苯甲醛或2-二乙氨 基苯甲醛為原料，于反應容器中，加入乙醇和20 %Κ0Η，室溫靜置10-24小時；加水，抽濾，所 得固體依次用水和30%乙醇洗滌2次，干燥后得橙黃色固體;將上述固體和碳酸鉀置于反應 容器中，加入六水合哌嗪和DMF，在120°C反應1-24小時;冷卻后將反應物倒入水中，用DCM萃 取3次;有機相經無水硫酸鈉干燥后濃縮，殘余物經硅膠柱層析，以2 % CH30H/DCM為洗脫劑， 分離得到黃色固體，即為所述的查爾酮衍生物。
[0011] 所述的查爾酮衍生物的應用在于制備治療自身免疫性疾病的免疫抑制藥物或抗 炎藥物的應用。
[0012]進一步地，所述的自身免疫性疾病為:多發性硬化癥。
[0013] 進一步地，所述的自身免疫性疾病為:類風濕關節炎。
[0014] 進一步地，所述的自身免疫性疾病為:系統性紅斑狼瘡。
[0015] 有益效果：
[0016]本研究采用活性亞結構拼接的方法，形成含氟查爾酮衍生物，再將含氟查爾酮衍 生物與哌嗪片段連接起來，最后合成得到6個新的4'-(1_哌嗪基)查爾酮衍生物。基于體外 免疫活性和抗炎篩選及2個自身免疫性疾病(多發性硬化疾病動物模型和關節炎模型)為篩 選平臺。首次發現這6個化合物具有顯著的免疫抑制作用，顯著降低多發性硬化癥經典模 型-實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎的發病率，減少疾病臨床評分。6個化合物口服給藥顯著 減少關節炎的臨床評分。6個新的4 ' -(1-哌嗪基)查爾酮衍生物在治療自身免疫性疾病(如： 多發性硬化、類風濕關節炎和系統性紅斑狼瘡等)顯示出較好的藥物開發前景。
【附圖說明】
[0017] 圖1:對實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠模型發病率的影響
[0018] 圖2:對實驗性自身免疫腦脊髓炎小鼠模型臨床神經障礙評分的影響
【具體實施方式】
[0019] 實施例1:制備方法
[0020] 4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基)查爾酮(結構式如下式Π ，簡稱化合物1)的合成方法 為:稱取4-氟苯乙酮(2.76g，20mmo 1)和對-二甲氨基苯甲醛(3.28g，22mmo 1)于100mL圓底燒 瓶中，加入30mL乙醇和20mL 20 %Κ0Η，室溫攪拌過夜。加入50mL水，抽濾，固體依次用50mL水 和50mL 30%乙醇-水洗滌2次，干燥后得橙黃色固體。將上述固體和5.48g(40mmol)碳酸鉀 置于100mL圓底燒瓶中，加入5.8g(30mmo 1)六水合哌嗪和60mL DMF，在120°C反應過夜。冷卻 后將反應物倒入150mL水中，DCM萃取(30mL X 3)。有機相經無水硫酸鈉干燥后濃縮，殘余物 經柱層析（以2%CH30H/DCM為洗脫劑)分離得到黃色固體即為4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基） 查爾酮，兩步收率70%。波譜數據如下：
[0021]
[0022] 式II :4-二甲氨基-4二（1-呢嗪基）查爾酮化字結構式
[0023] Yellow solid ^HMlRUOOMHz，CDC13) δ: 8.01(d，J = 9.0Hz，2H)，7.80((1, J = 15.3Hz，lH)，7.56(d，J = 9.0Hz，2H)，7.41(d，J=15.6Hz，lH)，6.92(d，J = 9.0Hz，2H)，6.70 (d,J = 9.0Hz,2H) ,3.33(t,J = 4.8Hz,4H) ,3.01-3.04(m,10H,NCH2) ,2.12(s,lH) ；13C NMR (75MHz,CDC13)5 :188.3,154.2,151.8,144.1,130.3,130.1,129.1,123.0,116.8,113.6, 111.8,48.5,45.9,40.2；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070,found 336.2072.
[0024] 3-二甲氨基-4 ' -(1 -哌嗪基)查爾酮(結構式如下式ΙΠ，簡稱化合物2)的合成方法 為：以4-氟苯乙酮和3-二甲氨基苯甲醛為原料，其余合成方法同4-二甲氨基哌嗪 基)查爾酮。
[0025]
12 式m : 3-二甲氨基-4' _(1-哌嗪基)查爾酮化學結構式 2 Yellow solid;m.p.l61 ~NMR(300MHz，CDCl3)S:8.00(d，J = 8.7Hz，2H)， 7.81(d,J=15.4Hz,lH) ,7.55(d,J = 9.0Hz,2H) ,7.43(d,J=15.4Hz,lH) ,7.02(s,lH), 6·74-6.83(m，3H)，3.31-3.39(m，4H)，3.00-3.06(m，4H)，3.02(s，6H)，2.ll(s，1H); 13C NMR (75MHz,CDC13)5:188.5,155.6,152.2,144.0,131.3,129.1,128.1,126.4,123.0,121.7, 116.8,112.9,111.6,48.5,45.7,40.3；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070, found 336.2067.
[0028] 2-二甲氨基-4 ' -(1-哌嗪基)查爾酮(結構式如下式IV，簡稱化合物3)的合成方法 為：以4-氟苯乙酮和2-二甲氨基苯甲醛為原料，其余合成方法同4-二甲氨基哌嗪 基)查爾酮。
[0029]
[0030] 式IV: 2-二甲氨基-4 '_(1-哌嗪基)查爾酮化學結構式
[0031] Pale red solid;m.p. 165~167Γ 5^^^(30010^,0)(:13)6:7.98((1,1 = 8.4^, 2H) ,7.82(d,J=15.3Hz,lH),7.55(d,J = 8.7Hz,2H),7.42(d,J=15.4Hz,lH) ,7.13(d,J = 6.8Hz,lH),7.05-7.12(m,lH),6.77-6.88(m,2H),3.34(s,4H),3.03(s,4H),3.01(s,6H), 2.10(s，lH) ;13C 匪R(75MHz，CDC13)S :188.9,155.1,152.8,141.6,134.7,132.2,130.3, 126.8,126.2,123.1,121.7,116.8,112.9,111.5,48.8,45.9,40.2；HRMS:m/z calcd for C2iH26N30(M+H)+336.2070,found 336.2071.
[0032] 4-二乙氨基-4'-(l-哌嗪基)查爾酮(結構式如下式V，簡稱化合物4)合成方法為： 以4-氟苯乙酮和對-二乙氨基苯甲醛為原料，其余合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基） 查爾酮。
[0033]
[0034] 式V:4-二乙氨基-4'-(l-哌嗪基)查爾酮化學結構式
[0035] Pale brown solid;m.p. 166~NMR(300MHz，CDCl3)S:8.01(d，J = 9.0Hz， 2H) ,7.86(d,J=15.3Hz,lH),7.57(d,J = 8.7Hz,2H),7.45(d,J=15.3Hz,lH) ,7.03(d,J = 8.7Hz,2H),6.82(d ,J = 9.0Hz,2H),3.37(t ,J = 4.7Hz,4H),3.34(t ,J = 4.8Hz,4H),3.05(t, J = 4.9Hz，4H) ,2. ll(s, 1H)，1.24(t，J = 6.8Hz，6H) ;13C NMR(75MHz，CDC13)S: 187.7,153.6， 140.1,134.1,130.3,126.0,122.4,120.8,116.8,112.9,111 .5,48.5,46.1,45.12,12.64; HRMS:m/z calcd for C23H29N30Na(M+Na)+386.2208,found 386.2209.
[0036] 3-二乙氨基-4 ' _(1-哌嗪基)查爾酮(結構式如下式VI，簡稱化合物5)合成方法為： 以4-氟苯乙酮和3-二乙氨基苯甲醛為原料，合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基）查爾 酮。
[0037]
[0038] 式VI: 3-二乙氨基-4' _(1-哌嗪基)查爾酮化學結構式
[0039] Brown solid;m.p.l69~ΠΙΓ;1!! NMR(300MHz，CDCl3)S:7.98(d，J = 8.9Hz，2H)， 7.85(d,J=15.4Hz,lH) ,7.56(d,J = 8.7Hz,2H) ,7.44(d,J=15.3Hz,lH) ,7.11(d,J = 6.9Hz,lH) ,7.01-7.09(m,2H),6.84(t,J = 5.4Hz,lH) ,3.37(t,J = 4.9Hz,4H) ,3.34(t,J = 4·8Ηζ，4H)，3.06(t，J = 4.7Hz，4H) ,2.12(s，lH) ,1.25(t，J = 6.8Hz，6H) ;13C 匪R(75MHz, CDC13)δ :188.9,155.1,152.8,141.6,135.2,132.6,131.1,126.3,125.0,122.9,121.4, 116.8,111.8,48.7,45.9,45.16,12.65；HRMS:m/zcalcdforC23H 3〇N3ONa(M+H)+364.2389, found364.2391.
[0040] 2-二乙氨基-4'-(1-哌嗪基)查爾酮(結構式如下式W，簡稱化合物6)合成方法為： 以4-氟苯乙酮和2-二乙氨基苯甲醛為原料，合成方法同4-二甲氨基-4'-(l-哌嗪基）查爾 酮。
[0041]
[0042] 式W: 2-二乙氨基-4' _(1-哌嗪基)查爾酮化學結構式
[0043] Pale yellow solid;m.p.l67~匪R(300MHz，CDCl3)S:7.99(d，J = 8·7Ηζ，2Η)，7.84(d，J=15.4Hz，lH)，7.56(d，J = 8.7Hz，2H)，7.42(d，J=15.4Hz，lH)，7.13 (d，J = 6 · 7Hz，1H)，7 · 07(t，J = 5 · 3Hz，1Η)，6· 74-6.82(m，2H)，3.36(t，J = 4.8Hz，4H) ,3.34 (t，J = 4.8Hz，4H)，3.05(t，J = 4.7Hz，4H)，2.12(s，lH)，1.23(t，J = 6.9Hz，6H) ;13C 匪R (75MHz,CDC13)5 :188.9,155.1,152.8,141.6,134.7,132.2,130.3,126.8,126.2,123.1, 121.7，116.8，112.9，111.5,48.8,46.0,45.14，12.63;HRMS:m/z calcd for C23H29N3ONa(M+ Na)+386.2208,found 386.2210.
[0044] 實施例2:體外免疫活性篩選
[0045] 1.建立篩選模型
[0046] BALB/C小鼠脾臟淋巴細胞在有絲分裂原ConA的刺激下，細胞的形態和代謝可發生 一系列的變化，轉化為母細胞，并分化增殖。本實驗加入ConA (刀豆蛋白A) 5μg/ml誘導T淋巴 細胞增殖。以MTT法定量測定細胞的增殖。活細胞內線粒體脫氫酶能將MTT有黃色還原成藍 色的甲肷，甲肷產量與活細胞成正比。用有機溶劑溶解后，可用酶標儀檢測0D值。
[0047]結果評定：淋巴細胞的增殖采用被測樣品0D值減對照孔0D值，除對照孔0D值乘 以％〇
[0048] 百分比前有負號表示此樣品對T細胞有抑制作用。
[0049] 百分比前沒有負號表示此樣品對T細胞有增強作用。
[0050]淋巴細胞毒性的判斷"有"，"無"，在無細胞毒的情況下，T淋巴細胞的增強/抑制百 分比在±15%以上，就表示有作用。
[0051 ] 2.體外免疫活性篩選的結果
[0052]實驗結果如下表1中所示:6個4'-(1_哌嗪基)查爾酮衍生物濃度依賴性抑制絲裂 原ConA誘導的T淋巴細胞增殖，體外顯示出對T淋巴細胞有較好的免疫抑制效應。
[0053] 表1.查爾酮衍生物對絲裂原ConA誘導的T淋巴細胞增殖功能的影響(mean 土 SD，η =3)
[0054]
[0056] a'_'表明樣品有抑制活性，彡15%顯示樣品是有作用； 1 b表明細胞毒性實驗；
[0058] e表明絲裂原ConA誘導T淋巴細胞增殖實驗；
[0059]實施例3:體外抗炎活性篩選 [0060] 1.建立篩選模型
[00611 小鼠巨噬細胞株Raw 264.7細胞購自美國細胞庫（41'(：0，培養于含10%?83的 RPMI-1640培養液中。Raw264.7細胞（1X105個/孔)接種于24孔板，同時加入不同濃度的本 發明所得的查爾酮衍生物，在lμg/ml LPS刺激作用下培養24h，另設溶劑對照及無刺激劑本 底對照。離心收集培養上清(5000rpm，4°C，5min)，采用Griess法檢測上清中N(V的含量。
[0062] 表2.查爾酮衍生物抗炎活性篩選結果
[0063]
[0064]抗炎活性篩選結果如表2所示，6個查爾酮衍生物顯著抑制LPS誘導巨噬細胞 RAW264.7炎癥因子N0,體外顯示出良好的抗炎活性。
[0065]實施例4:實驗性自身免疫腦脊髓炎模型的建立及藥物干預 [0066] 1.實驗性自身免疫腦脊髓炎建模
[0067]將髓磷脂少突細胞糖蛋白35-55肽段(縮寫為:MOG35-55)(2mg/ml)，用PBS配置相應 濃度，與等體積CFA(含4mg/ml H37Ra)用玻璃注射器充分乳化，用異氟醚麻醉小鼠，分三點 給小鼠注射乳化液，背部兩肩正中、后背部中心兩側各50μ1，最終每只小鼠皮下注射MOG 35-55 和H37Ra分別150yg和300yg。同時在第0和第2天每只小鼠腹腔注射400yg PTX。模型制備后， 按體重隨機分為EAE模型組和6個化合物給藥組(20mg/kg)，每天給藥1次。EAE的疾病評分采 用5分制。評分標準如下:0分，沒有明顯疾病癥狀；1尾巴張力消失或后肢無力；2分，尾巴張 力消失和后肢無力；3分，后肢部分癱瘓;4分，后肢完全癱瘓;5分，瀕死狀態或者死亡。免疫 后記錄小鼠狀態和疾病評分，并且每天稱體重。
[0068] 2.藥物干預的結果
[0069] 結果如說明書附圖1、圖2所示，與EAE(實驗性自身免疫性腦脊髓膜炎）模型組比 較，4'-(1_哌嗪基)查爾酮衍生物(20mg/kg)給藥顯著降低疾病的發病率，減少神經障礙評 分，顯示出對多發性硬化病的治療效果。
[0070] 實施例5:膠原關節炎模型的建立及藥物干預
[0071] 1.建模
[0072] 牛II型膠原加入0.1M的醋酸，濃度10mg/ml，提前4天4°C冰箱溶解，膠原與等體積 的弗氏完全佐劑充分乳化，待雄性DBA/1小鼠麻醉后，于其尾根部進行致敏，每只50μ1/只，3 周后以相同劑量進行再次免疫攻擊，肉眼觀察小鼠四肢，對關節炎的嚴重程度進行0-4級評 分，每組小鼠四肢評分總和除以小鼠只數，取平均值作為臨床評分。[0-4級評分系統:0 =正 常；1 = 一個或多個趾關節紅或紅腫；2 =踝關節以下中度紅腫；3 =包括膝關節在內的嚴重 紅腫;4 =包括膝關節在內的完全紅腫，關節變形、殘廢。每只小鼠最多評分為16分]。第0天 即為攻擊當天。模型制備后，按臨床評分隨機分為CIA模型組和6個化合物給藥組（20mg/ kg)，每天給藥1次。
[0073] 2.藥物干預結果
[0074]結果見表3所示：與關節炎模型組比較，4'-(1_哌嗪基）查爾酮衍生物口服(20mg/ kg)顯著降低DBA/1小鼠膠原關節炎的臨床評分，顯示出對關節炎的治療效果。
[0075] 表3對膠原關節炎小鼠臨床評分的影響(mean土SD，n = 8)
[0076]
【主權項】
1. 一種查爾酮衍生物，其特征在于:化合物的結構如式I所示：沂述的式I中，R可以為4-二甲氨基、3-二甲氨 基、2_二甲氛基、4_二乙氛基、3_二乙氛基或2_二乙氛基。2. -種如權利要求1所述的查爾酮衍生物的制備方法，其特征在于：取4-氟苯乙酮與 對-二甲氨基苯甲醛或3_二甲氨基苯甲醛或2-二甲氨基苯甲醛或對-二乙氨基苯甲醛或3-二乙氨基苯甲醛或2-二乙氨基苯甲醛為原料，于反應容器中，加入乙醇和20%K0H，室溫靜 置10-24小時;加水，抽濾，所得固體依次用水和30%乙醇洗滌2次，干燥后得橙黃色固體;將 上述固體和碳酸鉀置于反應容器中，加入六水合哌嗪和DMF，在120°C反應1-24小時;冷卻后 將反應物倒入水中，用DCM萃取3次;有機相經無水硫酸鈉干燥后濃縮，殘余物經硅膠柱層 析，以2%CH 3OH/DCM為洗脫劑，分離得到黃色固體，即為所述的查爾酮衍生物。3. -種如權利要求1、2所述的查爾酮衍生物的應用，其特征在于制備治療自身免疫性 疾病的免疫抑制藥物或抗炎藥物的應用。4. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為:多發性硬化癥。5. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為:類風濕關節炎。6. 如權利要求3所述的應用，其特征在于所述的自身免疫性疾病為:系統性紅斑狼瘡。
【文檔編號】A61P37/06GK106008400SQ201610382524
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】萬春平, 毛澤偉, 鄭喜, 祁燕, 李小絲
【申請人】云南省中醫醫院