一種阿苯達唑人工抗原及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種阿苯達唑人工抗原及其制備方法與應用。本發明所提供的阿苯達唑人工抗原為將式I所示的阿苯達唑半抗原與載體蛋白偶聯所得的抗原。本發明所提供阿苯達唑人工抗原合成方法簡單，純度高和產率高，對于阿苯達唑抗體的制備，以及阿苯達唑藥物殘留檢測具有重大價值。
【專利說明】
一種阿苯達唑人工抗原及其制備方法與應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥及化學領域，涉及一種阿苯達唑人工抗原及其制備方法與應 用。
【背景技術】
[0002] 阿苯達唑為一高效低毒的廣譜驅蟲藥。臨床可用于驅蛔蟲、蟯蟲、絳蟲、鞭蟲、鉤 蟲、糞圓線蟲等。在體內代謝為亞砜類或砜類后，抑制寄生蟲對葡萄糖的吸收，導致蟲體糖 原耗竭，或抑制延胡索酸還原酶系統，阻礙ATP的產生，使寄生蟲無法存活和繁殖。在動物食 品中的殘留對人體健康有潛在的威脅。
[0003] 目前，獸藥殘留檢測常用的方法有氣相色譜、高效液相色譜以及氣質聯用等理化 分析方法。雖然這些方法特異性強、靈敏度高，但是樣品前處理操作步驟繁瑣，成本較高，也 不適用于大批量樣品的篩選檢測。免疫化學分析鑒于在抗原抗體的定性定量方面獨特的優 勢和操作簡便快速、成本低、靈敏度較高、分析樣本量大的優點彌補了理化分析的不足，在 阿苯達唑的殘留檢測中起著越來越重要的作用。
[0004] 影響免疫化學分析質量的根本因素是抗體的特異性與親和性，這些性質又決定于 免疫半抗原分子的結構，因此免疫半抗原的分子設計與合成是產生特異性抗體和建立小分 子獸藥殘留快速檢測技術的最基礎和最關鍵的步驟。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種阿苯達唑人工抗原及其制備方法與應用。
[0006] 本發明所提供的阿苯達唑人工抗原是在阿苯達唑半抗原的基礎上構建所得的抗 原。
[0007] 所述阿苯達唑半抗原屬于本發明的保護范圍，其結構如式I所示。
[0008]
12 本發明還提供了制備所述阿苯達唑半抗原的方法。 2 本發明所提供的制備所述阿苯達唑半抗原的方法，具體可包括如下步驟:將阿苯 達挫與4-氨基丁酸按照質量比為500mg: 550-580mg (如580mg)的比例進行反應，獲得所述化 合物。
[0011] 其中，所述反應的溫度具體可為70-80°C (如80°C)，時間具體可為4-5h(如5h)。所 述反應的溶劑為二甲基甲酰胺(DMF)。
[0012]具體而言，制備所述阿苯達唑半抗原的方法包括如下步驟:將阿苯達唑溶于二甲 基甲酰胺(DMF)中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯達唑、所述二甲基甲酰胺(DMF)和所述4-氨 基丁酸的配比為 50011^:201111:550-58011^(如58011^)，70-80°(：(如80°(：)反應4-511(如511)，獲 得所述化合物。
[0013] 在所述"70-80°C (如80°C)反應4-5h(如5h)"后還可包括如下步驟：向反應液中加 入冰水，析出白色固體，過濾，水洗干燥，獲得所述化合物。其中，所述阿苯達唑、所述二甲基 甲酰胺（DMF)、所述4-氨基丁酸和所述冰水的配比為500mg :20ml:550-580mgGn580mg): 10ml 〇
[0014] 在阿苯達唑半抗原的基礎上構建所得的阿苯達唑抗原也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 所述阿苯達唑抗原，為將所述阿苯達唑半抗原(式I)與載體蛋白偶聯所得的抗原。 在本發明的一個實施例中，所述載體蛋白具體為牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（0VA)。
[0016] 所述阿苯達唑抗原的制備方法也屬于本發明的保護范圍。
[0017] 所述阿苯達唑抗原的制備方法，具體可包括如下步驟:將所述阿苯達唑半抗原(式 I)與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯，獲得所述阿苯達唑抗原。
[0018] 其中，所述阿苯達唑半抗原(式I)與所述載體蛋白偶聯的摩爾比為13.70:1。
[0019] 在本發明中，所述阿苯達唑抗原具體是按照包括如下步驟的方法制備獲得的：
[0020] (al)將所述阿苯達唑半抗原（式I)溶解于二甲基甲酰胺(DMF)中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)，20-25°C磁力攪 拌反應3h，得到溶液I;
[0021] 其中，所述阿苯達唑半抗原（式I)、所述二甲基甲酰胺(DMF)、所述1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、所述N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的配比為15mg: 1.5ml: 26mg：25mg；
[0022] (a2)將所述載體蛋白置于0.1M碳酸緩沖液中，4000rpm攪拌10mn，充分溶解，得到 溶液II;所述〇. 1M碳酸緩沖液的pH為9.6，溶劑為水，溶質及濃度如下:碳酸鈉0. lmol/L，碳 酸氫鈉〇. lmol/L;所述載體蛋白與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為5〇-67mg: 3.5ml;
[0023] 其中，若所述載體蛋白為牛血清白蛋白（BSA)，則所述牛血清白蛋白（BSA)與所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為50mg:3.5ml;若所述載體蛋白為卵清蛋白（0VA)，則所述卵清蛋白 (0VA)與所述0.1M碳酸緩沖液的配比為67mg: 3.5ml;
[0024] (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件A進行混合，混合后后于20_25°C磁力攪 拌反應24h，得到溶液III;
[0025] 所述條件A為:所述溶液I中的所述阿苯達唑半抗原(式I)與所述溶液II中的所述 0.1M碳酸緩沖液的配比為15mg: 3.5ml;
[0026] 其中，將所述溶液I和所述溶液II混合，具體為在4°C條件下，將所述溶液I逐滴加 入到所述溶液Π 中，邊加邊攪拌；
[0027] (a4)用磷酸鹽緩沖液(0.01M PBS，pH=7.4)，于4°C(對所述溶液III攪拌透析3天， 得到所述阿苯達唑抗原;所述磷酸鹽緩沖液的溶劑為水，溶質為磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、 氯化鈉和氯化鉀;所述磷酸二氫鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為〇. 27g/L，所述磷酸氫二 鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為1.42g/L，所述氯化鈉在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為 8g/L，所述氯化鉀在所述磷酸鹽緩沖液中的濃度為0.2g/L;所述磷酸鹽緩沖液的pH為7.4。 [0028] 所述阿苯達唑半抗原(式I)或所述阿苯達唑抗原在如下(a)或(b)中的應用也屬于 本發明的保護范圍：
[0029] (a)定性或定量檢測阿苯達唑；
[0030] (b)制備阿苯達唑抗體。
[0031]利用所述阿苯達唑抗原制備的抗體也屬于本發明的保護范圍。
[0032 ]所述抗體可為多克隆抗體、單克隆抗體或抗血清。
[0033] 本發明所提供的阿苯達唑半抗原，以及所述阿苯達唑抗原，合成方法簡單，純度高 和產率高，對于阿苯達唑抗體的制備，以及阿苯達唑藥物殘留檢測具有重大價值。
【附圖說明】
[0034] 圖1為阿苯達唑半抗原的質譜檢測結果圖。
[0035] 圖 2 為BSA 的 MALDI-T0F-MAS 圖。
[0036] 圖3為阿苯達唑BSA復合物的MALDI-T0F-MAS圖。。
【具體實施方式】
[0037] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0038] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0039] 阿苯達唑:百靈威科技有限公司，其產品目錄號為282654。
[0040]實施例1、阿苯達唑半抗原的制備 [0041 ] 一、阿苯達唑半抗原的制備
[0042] 在50ml圓底燒瓶中加入阿苯達唑500mg，20ml二甲基甲酰胺(DMF)(作為反應的溶 劑)溶解后加入4-氨基丁酸580mg，80°C反應5h，TLC檢測原料反應完畢后處理，將反應液滴 加到10ml冰水中，析出白色固體，過濾，水洗干燥得320mg產品。
[0043] 反應方程式如下：
[0044]
[0045] 二、阿苯達唑半抗原的結構鑒定
[0046] 對所得 320mg 產品進行質譜檢測，M+:M+H = 337.2，M+Na = 359.2，M-:M-H = 335.4， 如圖1所示。結果顯示其化學結構式如式I所示(Mff=336.4)，即為阿苯達唑半抗原。
[0047] 123 大肥 土八丄-」幾評>μ:_| 2 -、阿苯達唑人工抗原的制備 3 1、免疫原的合成
[0051] (1)將實施例1制備得到的半抗原（式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中， 完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應3h，得到溶液I。
[0052] (2)稱取50mg牛血清白蛋白（BSA)，溶解于3.5mL 0· 1M碳酸緩沖液中，400rpm攪拌 lOmin，充分溶解，得到溶液II。
[0053]其中，所述0. 1M碳酸緩沖液的pH為9. 6,溶劑為水，溶質及其濃度如下： Na2C〇3l.59g/L，NaHC〇3 2.94g/L。
[0054] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )環境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應24h，得到溶液III。
[0055] (4)將所述溶液III裝入1個蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL 0.01M roS(pH = 7.4) 透析3天，4 °C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產物4500rpm離心6min，0.5ml/管分 裝，將抗原編號，-20 °C保存備用。
[0056] 其中，所述0.01M PBS(pH=7.4)的溶劑為水，溶質及其濃度如下：磷酸二氫鉀 0.27g/L，磷酸氫二鈉1.42g/L，氯化鈉8g/L，氯化鉀0.2g/L。
[0057] 2、包被原的合成
[0058] (1)將實施例1制備得到的半抗原（式I)15mg溶解于1.5mL二甲基甲酰胺(DMF)中， 完全溶解后，依次加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)26mg，N-羥基琥 珀酰亞胺(NHS) 25mg，室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應3h，得到溶液I。
[0059] (2)稱取67 · Omg卵清蛋白（0VA)，溶解于3 · 5mL 0 · 1Μ碳酸緩沖液pH = 9 · 6 (配方同 上）中，400rpm攪拌1 Omin，充分溶解，得到溶液II。
[0060] (3)取上述溶液I，在冰水浴(4°C )環境下逐滴加入到上述溶液II中，邊加邊攪拌， 室溫(20-25 °C)磁力攪拌反應24h，得到溶液III。
[0061 ] (4)將所述溶液III裝入1個蒸餾水沖洗干凈透析袋（15cm)，lL0.01M PBS(pH = 7.4) (配方同上)透析3天，4 °C攪拌透析，每天更換透析液3次，透析產物4500rpm離心6min， 0.5ml/管分裝，將抗原編號，-20°C保存備用。
[0062]二、阿苯達唑人工抗原的鑒定
[0063] 免疫原 MALDI-TOF-MS 鑒定結果顯示偶聯比為：R= (70895 · 500-66288 · 367)/336 · 4 = 13.70(圖2和圖3)。即免疫原中，所述阿苯達唑半抗原(式I)與牛血清白蛋白（BSA)偶聯的 摩爾比為13.70:1。
[0064] 實施例3、阿苯達唑人工抗原免疫動物制備抗血清
[0065] 一、動物免疫
[0066]用步驟實施例2獲得的阿苯達唑人工抗原"阿苯達唑-BSA"作為免疫原免疫新西蘭 大白兔。每次免疫劑量為1〇〇~200!^，免疫方式為雙肩部和后大腿皮下多點注射，每個區域 大約用1/4的免疫原。首免時將免疫原用生理鹽水稀釋，然后與弗氏不完全佐劑進行1:1(體 積比）混合制成乳化劑，每間隔2周取相同劑量免疫原加等體積弗氏不完全佐劑混合乳化后 加強免疫一次，采用此方式共加免3次后，間隔3~4周再取相同劑量免疫原加弗式不完全佐 劑進行末次免疫，耳動脈取血檢測抗體效價。末次免疫7-10天后采用頸動脈放血，每只兔子 可得血100-120ml左右，取完的血在4°C冰箱放置5~6小時，然后以5000rpm離心10min，分離 血清。
[0067]二、抗血清效價測定
[0068]采用間接ELISA法測定步驟一所得血清的抗體效價，具體如下：
[0069] 1)包被:在96孔酶標板中加入lOOyL濃度為2yg/mL的"阿苯達唑-OVA"溶液（用包被 緩沖液進行稀釋），同時設置不包被抗原的對照，4°C包被過夜，用PBS緩沖液洗滌3次。
[0070] 包被緩沖液:pH9.6、0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(溶劑為水，溶質及其濃 度如下：Na 2C03 1.59g/L和NaHC03 2.93g/L)。
[0071] 2)封閉：加入150μLν孔的封閉液，在37 °C孵育2h，棄封閉液，洗滌3次，拍干。置于4 °(：冰箱保存備用。
[0072]封閉液:含有0.5% (體積百分含量)小牛血清、3% (3g/100ml)酪蛋白的磷酸鹽緩 沖液，PH7.4。
[0073] 3)加待測樣品：吸取不同稀釋度的待測血清100μΙ，加入對應的酶標板中，37°C孵 育30min，洗板4次，拍干。
[0074]同時設置未經免疫的兔血清的對照；以PBS代替待檢測樣品的對照（陰性對照孔）。
[0075] 4)加酶標二抗:取HRP標羊抗兔IgG抗體(Jackson ImmunoResearch公司，貨號111-035-003)，按體積比1:5000倍稀釋后，100μΙ/孔，37°C孵育20至30min，洗滌4次，拍干。
[0076] 5)顯色:將 20 X TMB 稀釋至1 X TMB，按100μΙ/孔加入，37 °C 顯色 15-30min。
[0077] 6)終止：加入終止液（2M H2S〇4)50yl/孔。
[0078] 7)讀數：以450nm單波長測定各孔0D值，以與陰性對照孔（以PBS代替待測樣品的對 照)0D值的比值(P/N)大于2.1為限，作為判斷為血清效價的臨界點。
[0079] ELISA結果判定方法：以P/N>2.1的血清最大稀釋倍數表示。
[0080] 結果表明血清中的抗體效價為1:20000。
[0081 ]實施例4、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒檢測阿苯達唑
[0082] -、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的組裝
[0083] 1、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的組成包括如下：
[0084] (1)阿苯達唑標準品工作液:6瓶，1 · 5mL/瓶，濃度為0ng/ml、0 · 15ng/ml、0.45ng/ ml、1·35ng/ml、4·05ng/ml、12·15ng/ml;
[0085] (2)阿苯達唑酶標板：1塊(8孔X 12條），為包被了實施例2制備得到的"阿苯達唑-0VA"的酶標板。
[0086] (3)阿苯達唑抗體工作液：1瓶(7mL)，為抗體稀釋液將抗體進行1:8000稀釋，抗體 稀釋液為含6% (體積分數）山羊血清的0.2mol/L PBS，所述阿苯達唑抗體為實施例3制備得 到的抗血清純化所得的抗體。
[0087] (4)酶標記物工作液：1瓶（12mL)，酶標記物具體為經辣根過氧化酶標記的羊抗鼠 的抗體。
[0088] (5)樣品稀釋液：1 瓶（10X，15mL)，為0.01M ρΗ7·4的PBS。
[0089] (6)洗滌液：1 瓶（20Χ，25mL)，為0.01mol/L ρΗ7·4的PBST溶液。
[0090] (7)底物Α液、底物Β液各1瓶(7mL)。其中，底物Α為2%過氧化脲水溶液。底物Β為1 % 四甲基聯苯胺水溶液。
[0091] (8)終止液：1瓶(7mL)，為2mol/L H2S〇4溶液。
[0092] (9)蓋板膜；
[0093] (10)自封袋。
[0094] 2、需要而未提供的設備和材料
[0095] (1)設備
[0096] 酶標儀(檢測波長450nm，參考波長630nm)、天平(精度:0.01g)、漩渦振蕩器、離心 機(4000g)、搖床(300rpm)、氮吹儀、微量移液器、計時器。
[0097] (2)試劑
[0098] 樣品提取液:稱取NaCl 20g，K2HP〇4 · 3H20 26g于干凈燒杯中，加入200mL去離子水 溶解。
[0099] 乙酸乙酯、正己烷。
[0100] 3、貯存
[0101] 該試劑盒貯存于2_8°c，切勿冷凍，有效期1年。
[0102] 未使用完的酶標板條應密封，2_8°C保存。
[0103] 4、試劑盒檢測原理
[0104] 樣品中的阿苯達唑與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標記物，催化 底物顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中阿苯達唑的含量。顯色深，含量少，反之，含量多。
[0105] 二、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的使用方法
[0106] 1、樣品前處理
[0107] (1)雞肉、鴨肉(稀釋系數:1)
[0108] a)取2±0.02g組織樣品于50mL離心管中，加入2mL樣品提取液(見步驟一2)，充分 禍動30s;b)加入8mL乙酸乙酯，禍動lmin;c)搖床300rpm振搖10min;d)4000g以上，離心 1 Omin; e)取4mL上清液于新的4mL離心管中；f)50-60°C水浴中，氮氣吹干;g)加入lmL樣品稀 釋液，再加入2mL正己燒，充分禍動lmin;h)4000g以上，離心5min，完全棄去上層正己燒及中 間層雜質；i)取50yL進行檢測。
[0109] (2)原奶(稀釋系數:2)
[0110] a)取2ml新鮮原奶于50mL離心管中，加入8mL乙酸乙酯，劇烈渦動lmin(如果使用多 管漩禍混合儀則需禍動2min); b)4000g以上，離心10min; c)取2mL上清液于新的4mL離心管 中（注:避免吸入上層漂浮雜質，否則影響檢測結果）；d)50-60°C水浴中，氮氣吹干;e)加入 lmL樣品稀釋液，再加入2mL正己燒，充分禍動lmin;f )4000g以上，離心5min，完全棄去上層 正己烷及中間層雜質;g)取50yL進行檢測。
[0川]2、檢測步驟
[0112] (1)將板條插入酶標板架上，并記錄下各標準品和樣品的位置，建議均做雙孔平 行，未使用的板條用自封袋密封后，立即保存于2_8°C環境中；
[0113] (2)將50yL各濃度的阿苯達唑標準品工作液(或待測樣品溶液)分別加入對應的標 準品(或待測樣品孔)中；
[0114] (3)在每孔中加入50yL阿苯達唑抗體工作液；
[0115] (4)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下（25 ± 2 °C )，避光反應 20min；
[0116] (5)揭開蓋板膜；
[0117] (6)倒掉板孔中液體，在每孔加入260yL洗滌工作液，充分洗滌4次，每次浸泡15-30s ；
[0118] (7)倒掉板孔中液體，將酶標板倒置于吸水紙上，拍干；
[0119] (8)立即在每孔中加入1 OOyL酶標記物工作液；
[0120] (9)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下（25 ±2°C)，避光反應 20min；
[0121] (10)重復步驟(5)-(7);
[0122 ] (11)立即在每孔中加入lOOyL底物A液和底物B液的混合液(底物A液、底物B液按體 積1:1混合，必須充分混勾，混合液在5min內使用，避免使用金屬盛裝、攪拌試劑）；
[0123] (12)蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標板10s，充分混勻，室溫下(25 ± 2 °C )，避光反應15-20min；
[0124] (13)揭開蓋板膜，在每孔中加入50yL終止液，輕輕振蕩酶標板1 Os，充分混勻；
[0125] (14)終止后5min內用酶標儀在雙波長450nm、630nm下讀取酶標板吸光度值。
[0126] 3、結果計算或判定
[0127] (1)各標準品（或待測樣品）的平均吸光度值，除以零標(濃度為Ong/ml的標準品） 吸光度值，乘以100,可以得到各標準品對應的吸光度的百分比，即百分吸光度值：
[0128]
[0129] (2)以各標準品的百分吸光度值為縱坐標，以對應的阿苯達唑濃度為橫坐標繪制 標準曲線。
[0130] (3)將待測樣品的百分吸光度值代入標準曲線方程，可得出待測樣品對應的濃度， 再乘以相應樣品的稀釋倍數，方得待測原樣品中阿苯達唑的實際含量。
[0131 ]三、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒檢測阿苯達唑
[0132] 1、特異性檢測
[0133] 阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的特異性是通過與相應的物質進行交叉反應試驗來確 定的。交叉反應越小，特異性越好。
[0134] 將阿苯達唑及其它類似物奧苯達唑、帕苯達唑、甲苯達唑和環苯達唑分別做系列 稀釋，分別按照如上步驟二2進行操作，以阿苯達唑及其它類似物的系列稀釋液替代其中的 "阿苯達唑標準品工作液"，制作標準曲線，并在曲線上找出各自50%抑制濃度（IC 5Q)，具體 方法如下:得到縱坐標數值等于50%對應的阿苯達唑濃度(ng/mL)，即IC5Q值。用下式計算試 劑盒對阿苯達唑和各類似物的交叉反應率。
[0135]
[0136] 結果如表1所示，從表1中可以看出，阿苯達唑酶聯免疫試劑盒對各種類似物的交 叉反應率均小于1%。這說明阿苯達唑酶聯免疫試劑盒對阿苯達唑具有極高的特異性，可有 效的排除其它類似物的干擾，可專門用于阿苯達唑的檢測。
[0137] 表1阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的特異性
[0138]
[0139] ~2、不同樣品的最低檢測限測定
[0140] 分別測定采用阿苯達唑酶聯免疫試劑盒對雞肉、鴨肉和原奶中阿苯達唑進行檢測 時的最低檢測限。具體方法如步驟二。
[0141] 結果顯示，采用步驟二2(1)中的樣品前處理方法處理雞肉，測得的最低檢測限可 達lng/g(即每g雞肉中含有lng的阿苯達唑即可被檢測到，下同）；采用步驟二2(1)中的樣品 前處理方法處理鴨肉，測得的最低檢測限可達lng/g;采用步驟二2(2)中的樣品前處理方法 處理原奶，測得的最低檢測限可達lng/ml。
[0142] 3、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒板內板間誤差的測定
[0143] 分別測定阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的板內誤差和板間誤差。具體方法如步驟二。
[0144] 結果顯示，試劑盒吸光度的板內誤差小于10%，板間誤差小于15%。
[0145] 4、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒檢測阿苯達唑的回收率測定
[0146] 測定采用阿苯達唑酶聯免疫試劑盒檢測阿苯達唑的回收率。具體方法如下步驟 --〇
[0147] 結果顯示，采用阿苯達唑酶聯免疫試劑盒檢測阿苯達唑的回收率范圍為70-100%〇
[0148] 5、阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的靈敏度測定
[0149] 測定阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的靈敏度。具體方法如步驟二。
[0150] 結果顯示，阿苯達唑酶聯免疫試劑盒的靈敏度為0.15ppb，標準曲線范圍0.15ppb-12.15ppb(注：ppb=yg/kg)。
【主權項】
1. 一種化合物，其結構如式I所示：2. 制備權利要求1所述化合物的方法，包括如下步驟:將阿苯達唑與4-氨基丁酸按照質 量比為500mg:550-580mg的比例進行反應，獲得所述化合物。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述反應的溫度為70-80°C，時間為4-5h; 或 所述反應的溶劑為二甲基甲酰胺。4. 根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述包括如下步驟:將阿苯達唑溶于二 甲基甲酰胺中后，加入4-氨基丁酸，所述阿苯達唑、所述二甲基甲酰胺和所述4-氨基丁酸的 配比為500mg: 20ml: 550-580mg，70-80 °C反應4-5h，獲得所述化合物。5. 阿苯達唑抗原，為將權利要求1所述化合物與載體蛋白偶聯所得的抗原。6. 根據權利要求5所述的阿苯達唑抗原，其特征在于:所述載體蛋白為牛血清白蛋白或 卵清蛋白。7. 權利要求5或6所述的阿苯達唑抗原的制備方法，包括如下步驟:將權利要求1所述化 合物與載體蛋白通過酰胺鍵偶聯，獲得所述阿苯達唑抗原;和/或 權利要求1所述化合物與所述載體蛋白偶聯的摩爾比為13.70:1。8. 根據權利要求7所述的阿苯達唑抗原的制備方法，其特征在于:所述方法包括如下步 驟： (al)將權利要求1所述化合物溶解于二甲基甲酰胺中，然后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，20-25°C反應3h，得到溶液I; 所述化合物、所述二甲基甲酰胺、所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、 所述N-羥基琥泊酰亞胺的配比為15mg: 1.5ml :26mg:25mg; (a2)將所述載體蛋白溶解于0.1 M碳酸緩沖液中，得到溶液II; 所述載體蛋白與所述〇. IM碳酸緩沖液的配比為50-67mg: 3.5ml; (a3)將所述溶液I和所述溶液II按照條件A進行混合，混合后后于20-25Γ反應24h，得 到溶液ΠΙ; 所述條件A為:所述溶液I中的所述化合物與所述溶液II中的所述0.1 M碳酸緩沖液的配 比為15mg:3· 5ml; (a4)用磷酸鹽緩沖液，于4 °C對所述溶液III透析3天，得到所述阿苯達唑抗原。9. 權利要求1所述化合物或權利要求5或6所述阿苯達唑抗原在如下（a)或（b)中的應 用： (a) 定性或定量檢測阿苯達挫； (b) 制備阿苯達唑抗體。10. 利用權利要求5或6所述阿苯達唑抗原制備的抗體。
【文檔編號】C07K14/77GK106008361SQ201610388712
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】劉志萍, 蘇麗芳, 于書英, 吳小平, 王文珺, 溫凱, 秦譽, 王照鵬, 楊柳, 邢維維
【申請人】北京維德維康生物技術有限公司, 西南大學