(2s,3s,4r,9e)-2-[(2′r)-2′-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1,3,4-三醇及其制備方法 ...的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種源于東洋參的新化合物(2S,3S,4R,9E)?2?[(2′R)?2′?羥基?二十九碳酰胺]?十八碳?1,3,4?三醇，其結構式為該化合物對膽固醇酰基轉移酶具有選擇性抑制的作用，能夠有效用于預防和治療血脂、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病，具有良好的研究開發和應用前景；該化合物的制備方法步驟少及操作簡便，得到的化合物天然無毒性。
【專利說明】
(2S, 3S,4R,9E)-2-[ (21234567 R)-21 -羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1 ,3,4-二酵及其制備方法和應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及中藥有效成分提取技術領域，特別涉及源于東洋參的（2S，3S，4R，9E)-24(24)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 東洋參藥材是比較名貴的一種中藥，可用于風熱感冒、咳嗽痰多、麻疹風疹、咽喉 腫痛等疾病；東洋參藥材中的對人體有益成分很多，但價格昂貴，且食療效果并不顯著，近 些年相關學者對東洋參進行了大量的研究，研究表明東洋參藥材的提取物在心血管疾病中 發揮，具有調血脂、預防動脈粥樣硬化、防治冠心病等作用，目前成功分離出的有效化合物 很少，因此，研究從東洋參藥材分離出藥效高且持久穩定和價格低廉的藥物迫在眉睫。
【發明內容】
[0003] 本發明要解決的技術問題是提供一種源于東洋參的（SSJSJRJE)Kd)-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇的化合物，還提供了該化合物作為制備調血 月旨、預防動脈粥樣硬化、防治冠心病方面藥物的用途，還提供了該化合物的制備方法。
[0004] 為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為：
[0005] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (24)-2^羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4-三醇的結構 式為：
[0006] 本發明提供的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (24)-2^羥基-二十九碳酰胺]-十八碳_1，3， 4-三醇的制備方法，包括如下步驟： 2 (a)將東洋參藥材飲片用乙醇浸泡，獲得東洋參乙醇溶液； 3 (b)將步驟(a)得到的東洋參乙醇溶液用水浴回流提取，提取2次，合并2次得到東 洋參提取液； 4 (C)對步驟(b)得到的東洋參提取液進行減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參 浸膏； 5 (d)向步驟(C)得到的東洋參浸膏中加入適量水混合分散，得到東洋參水溶液； 6 (e)將步驟⑷得到的東洋參水溶液依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍 體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁醇進行萃取提純，得到4個不同極性的萃取液； 7 (f)將步驟(e)中得到的乙酸乙酯萃取液，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以 氯仿-甲醇（100: 〇-〇: 100)系統梯度洗脫，通過TLC檢測，將洗脫液為50:50時的相似餾分合 并后濃縮，得到濃縮液π，進一步用Sepadex-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶 液，共得到3段餾分，將第1段經減壓濃縮、重結晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的 混合物，即（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' IOl -羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸。
[0014] 2-羥基二十五烷酸化合物的結構式為：
[0015]
[0016]作為進一步的技術方案，步驟(a)中乙醇的濃度為90~95 %。
[0017]作為進一步的技術方案，步驟(b)中水浴的溫度為60°C~80°C，回流提取的時間為 5h ~8tu
[0018] 作為優選的技術方案，步驟(b)中水浴的溫度為70°C，回流提取的時間為6h。
[0019] 發明人發現本發明的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八 碳-1，3,4-三醇和2-羥基二十五烷酸對ACAT具有選擇性抑制的作用，可以作為制備調血脂、 預防動脈粥樣硬化、防治冠心病的藥物。
[0020] 本發明提供的藥物組合物，該組合物含有治療有效量的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' IO-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇或2-羥基二十五烷酸化合物，以及它們藥 學上可接受的載體。
[0021] 本發明的有益效果：
[0022] 1，本發明成功從東洋參藥材中制備出了一種結構新穎的（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-〗'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_二醇化合物，并首次從東洋參藥材制備出2-輕 基二十五烷酸化合物。制備方法簡單易行，可應用于實驗室、工業化并具有環保型的制備方 法;該制備方法步驟少及操作簡便，得到的兩個化合物的產率高、天然無毒性。
[0023] 2,本發明提取的化合物(2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2 /-羥基-二十九碳酰胺]-十八 碳-1，3，4-三醇化合物和2-羥基二十五烷酸化合物具有抑制膽固醇酰基轉移酶的活性，能 夠有效用于預防和治療血脂、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病，具有良好的研究開發和應用前 景。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發明化合物I和化合物Π 的ESI-MS(負極性)圖；
[0025]圖2為本發明化合物I和化合物Π 的ESI-MS(負極性)圖；
[0026]圖3為本發明化合物I和化合物Π 的ESI+MS(正極性）圖；
[0027] 圖4為本發明化合物I和化合物Π 的1H-NMR全圖；
[0028] 圖5為本發明化合物I和化合物Π 的1H-NMR局部放大圖；
[0029] 圖6為本發明化合物I和化合物Π 的13C-NMR全圖；
[0030] 圖7為本發明化合物I和化合物Π 的13C-NMR局部放大圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步說明。在此需要說明的是，對于 這些實施方式的說明用于幫助理解本發明，但并不構成對本發明的限定。此外，下面所描述 的本發明各個實施方式中所涉及的技術特征只要彼此之間未構成沖突就可以相互組合。
[0032] 實施例1
[0033] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0034] 將東洋參藥材飲片20kg，用90 %乙醇浸泡，用60°C水浴回流提取8h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進行萃取提純，得到4個不同極性部位的萃取液，經減壓濃縮后，得到石油醚部位90g，氯 仿部位90g，乙酸乙酯部位78g，正丁醇部位290g。
[0035] 將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統梯度洗脫，通過TLC檢測，將洗脫液為50:50時的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經減壓濃縮、重結晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0036] 實施例2
[0037] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0038] 將東洋參藥材飲片20kg，用95 %乙醇浸泡，用70°C水浴回流提取6h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進行萃取提純，得到4個不同極性部位的萃取液，經減壓濃縮后，得到石油醚部位98g，氯 仿部位l〇〇g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位300g。
[0039] 將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統梯度洗脫，通過TLC檢測，將洗脫液為50:50時的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經減壓濃縮、重結晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0040] 實施例3
[0041 ] (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇和2-羥 基二十五烷酸的制備
[0042] 將東洋參藥材飲片20kg，用95 %乙醇浸泡，用80°C水浴回流提取5h，提取2次，合并 2次得到東洋參提取液;經減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏。加入適量水將浸膏 水混懸后；依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積的乙酸乙酯、3倍體積的正丁 醇進行萃取提純，得到4個不同極性部位的萃取液，經減壓濃縮后，得到石油醚部位95g，氯 仿部位95g，乙酸乙酯部位80g，正丁醇部位296g。
[0043]將乙酸乙酯部位，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100 : 0-0 : 100)系統梯度洗脫，通過TLC檢測，將洗脫液為50:50時的相似餾分合并后濃縮，得到濃縮液 Π ，進一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共得到3段餾分，將第 1段經減壓濃縮、重結晶方法得到白色粉末化合物I和化合物Π 的混合物。
[0044] 實施例4
[0045] 化合物I和化合物Π 的結構表征 [0046] 化合物I的結構確證：
[0047] 為白色無定形粉末(醋酸乙酯）。如圖1和圖2所示，ESI-MS給出m/z750.2[M-H] +的 準分子離子峰，結合NMR的碳譜和氫譜數據，確定該化合物的相對分子質量為751，分子式為 C47H93〇5N，不飽和度為2。依據其1H NMR和13C NMR圖譜特征，推測該化合物為神經酰胺類化合 物。
[0048]如圖4和圖5所示，在1H NMR(C5D5N，600MHz)圖譜中，δ:8·58(1Η，(1，Ν-Η)，5·52(2Η, m,H-9,10),5.12(lH,m,H-2),4.61(ΙΗ,??,Η^7),4.51(lH,dd,Ha-1),4.42(lH,dd,Hb-I), 4.34(1!1，111，!1-3)，4.28(1!1，111，!1-4)，1.28(111，長鏈(：!12)，0.84(6!1，^ = 6.6,〇13\2)。如圖6和 圖7所示，130匪以〇5〇5叱15冊抱）3:175.1((：-1 /)，，130.7((：-9)，130.6((：-10)，76.7((：-3)， 72.8(0-4),72.3(0-2 7),61.9(0-1),52.8(0-2),35.6(0-37),33.7(C-5),26.6(C-6),25.7 (C-f )，HJ(CH3)131H NMR譜中δ?. 22~1.36的強的質子信號、δ〇. 84處的2個端甲基質子信 號以及13C匪R譜中δ22.8~33.7的碳信號提示含兩個長鏈脂肪烷基；信號68.58(1!1，(1，^ Η)、δ175· I(CONH2)、δ52·8((：Η-ΝΗ)和δ5.12( lH，m)以及四個連氧碳信號δ76·7、72·8、72.3、 61.9顯示有酰胺鍵和四個羥基存在。以上數據表明，該化合物為梢氨醇類的神經酰胺，堿基 鏈部分為含有一個雙鍵的1，3，4-三羥基梢氨醇。分子式為C47H93O5N，扣除長鏈堿部分，分子 的長鏈酸應為2-羥基二十九烷酸。考慮到生源途徑和神經酰胺類化合物的立體位阻，確定 絕對構型為SSJSdRJl [0049] 化合物Π 的結構確證：
[0050]白色粉末(醋酸乙酯）；白色粉末(醋酸乙酯）。如圖1、圖2和圖3所示，ESI-MS給出m/ z399.3[M+H] +、421.2[M+Na] +、397.2[M-H]-的準分子離子峰，結合NMR的碳譜和氫譜數據，確 定該化合物的相對分子質量為398,分子式為C 25H5qO3,不飽和度為1。依據其1H NMR和13C NMR 圖譜特征，推測該化合物為長鏈脂肪酸類化合物。
[0051 ]如圖4和圖5所示，在1H NMR(C5D5N，600MHz)圖譜中，δ: 1 · 29(m，長鏈CH2)，0 · 84(3H， ^ = 7.2,013)。如圖6和圖7所示，130匪1?(〇5〇5115010^)3:178.1((：-1)，71.3((：-2)，35.4 (C-3) ,25.8(04) ,29.5~29.9(長鏈CH2)，29.4(022) ,32.0(023) ,22.8(024) ,14.2 (CH3)131H匪R譜中δ?. 22~1.36的強的質子信號、δ〇. 84處的1個端甲基質子信號以及13C 匪R譜中δ22.8~33.7的碳信號提示該化合物為長鏈脂肪酸類化合物，并含有一個羥基。因 13C NMR譜中除δ32.0(Ο23)外在δ35附近僅有一個碳信號，即35.4(C-3)。由此鑒定化合物為 2_羥基二十五烷酸。
[0052] 實施例5
[0053]化合物I和化合物Π 對ACAT影響的實驗
[0054] 酰基輔酶A:膽固醇酰基轉移酶(ACAT)是細胞內唯一合成膽固醇酯的酶，在細胞和 生物體膽固醇代謝平衡中起非常重要的作用。ACAT合成的膽固醇酯主要以脂滴形式儲存于 胞漿中。
[0055] RAW264.7細胞以細胞數2\105/孔鋪于24孔板，于37°(：、5%〇)2條件下過夜培養后， 換為無血清DMEM培養基（IOOyL/孔）。將細胞分為空白對照組(不加 Ox-LDL和待測樣品）、模 型組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL和IOOyg · mL-1 的Ac-LDL)，加藥組（加入80yg · mL-1 的Ox-LDL 和IOOyg · ml/1的Ac-LDL以及待測化合物），細胞貼壁后，加入終濃度為80yg · ml/1的〇X-LDLlOOyg · mL-1的Ac-LDL到模型組和加藥組，作用24h后，裂解細胞，收集蛋白。BCA試劑盒 進行蛋白定量。ACATl檢測試劑盒測定ACATl含量。ACATl含量=實測ACATl濃度/總蛋白含量 ACATl抑制率=(模型組含量-加藥組含量)/(模型組含量-空白組含量)*100%。
[0056]數據結果如下表所示：
[0058] 從上表中可以看出，（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_三醇化合物和2-羥基二十五烷酸化合物的混合物的細胞活性為119.13%，ACAT抑制 率為65.95 % ;結果表明，（2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' 10-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3， 4-三醇和2-羥基二十五烷酸的混合物對ACAT具有選擇性抑制的作用，能夠調血脂、預防動 脈粥樣硬化、防治冠心病。
[0059]以上結合附圖對本發明的實施方式作了詳細說明，但本發明不限于所描述的實施 方式。對于本領域的技術人員而言，在不脫離本發明原理和精神的情況下，對這些實施方式 進行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. (2S，3S，4R，9E)-2-[ (2' 10-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-I，3，4-三醇的結構式 為：2. 根據權利要求l所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇的制備方法，其特征在于，包括如下步驟： (a) 將東洋參藥材飲片用乙醇浸泡，獲得東洋參乙醇溶液； (b) 將步驟(a)得到的東洋參乙醇溶液用水浴回流提取，提取2次，合并2次得到東洋參 提取液； (c) 對步驟(b)得到的東洋參提取液進行減壓濃縮，回收乙醇，得到較純的東洋參浸膏； (d) 向步驟(c)得到的東洋參浸膏中加入適量水混合分散，得到東洋參水溶液； (e) 將步驟(d)得到的東洋參水溶液依次用3倍體積的石油醚、3倍體積的氯仿、3倍體積 的乙酸乙酯、3倍體積的正丁醇進行萃取提純，得到4個不同極性的萃取液； (f) 將步驟(e)中得到的乙酸乙酯萃取液，拌樣，上柱，采用硅膠柱色譜法分離，以氯仿-甲醇（100:0-0:100)系統梯度洗脫，通過TLC檢測，將洗脫液為50:50時的相似餾分合并后 濃縮，得到濃縮液Π ，進一步用SepadeX-LH20色譜柱分離，洗脫劑為15%的甲醇水溶液，共 得到3段餾分，將第1段經減壓濃縮、重結晶方法得到白色粉末化合物IS P(2S，3S，4R，9E)-2-[(2'IO-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3，4-三醇，同時和化合物Π 的混合物，和2-羥 基二十五烷酸。 2_羥基二十五烷酸化合物為：3. 根據權利要求2所述的（2S，3S，4R，9E)_2_[ (2' R)-2'-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-1，3,4_三醇的制備方法，其特征在于，步驟(a)中所述乙醇的濃度為90~95%。4. 根據權利要求2所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇的制備方法，其特征在于，步驟(b)中所述水浴的溫度為6(rC~8(rC，所述回流 提取的時間為5h~8h。5. 根據權利要求4所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇的制備方法，其特征在于，步驟(b)中所述水浴的溫度為7(rC，所述回流提取的 時間為6h。6. 根據權利要求1所述的（2S，3S，4R，9E)-2-[(2/R)-2/-羥基-二十九碳酰胺]-十八碳-l，3,4-三醇和權利要求2所述的2-羥基二十五烷酸在制備調血脂、預防動脈粥樣硬化、防治 冠心病的藥物中的應用。7. -種藥物組合物，其特征在于，含有權利要求1所述的化合物和藥學上可接受的載 體。8. -種藥物組合物，其特征在于，含有權利要求2所述的2-羥基二十五烷酸和藥學上可 接受的載體。
【文檔編號】A61K31/164GK106008252SQ201610322020
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】韓彥弢, 王春波, 朱莉, 陳雪紅
【申請人】青島大學