經由鄰氨基苯甲酸鹽生產苯胺的制作方法

經由鄰氨基苯甲酸鹽生產苯胺的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于生產苯胺的方法，其包括以下步驟：a)提供鄰氨基苯甲酸鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適的陽離子，b)在存在或不存在催化劑下通過熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺，c)將在步驟b)中產生的苯胺用有機溶劑萃取至少一次，和d)通過蒸餾純化在步驟b)和c)中產生的苯胺，其中所述蒸餾產生苯胺和水相。
【專利說明】經由鄰氨基苯甲酸鹽生產苯胺
[0001] 本發明涉及由可再生資源的原材料(例如生物質)經由合適的微生物宿主隨后將 中間產物化學轉化為苯胺來生產苯胺的領域。
[0002] 目前以每年幾百萬噸由化石原材料生產苯胺，例如生產聚氨酯。基于可再生資源 的苯胺源(也被稱為"生物苯胺"）被強烈期望用于化工工業，以變得獨立于化石資源。更重 要的是，存在對于化學方法以及通過增加原材料中的可再生資源的使用兩者而言減少二氧 化碳(co 2)排放量的強烈期望。生物苯胺具有節省co2排放量的高潛力。
[0003] 本發明進一步涉及微生物工程和由其生產芳族化合物。具體地，本發明涉及由可 再生資源(例如在合適的重組微生物宿主中的生物質）生產鄰氨基苯甲酸鹽(〇AB)的領域。 典型地，使用包含顯著比例的可發酵糖的來源。這些糖可以包括多糖，例如二糖如蔗糖，或 三糖如蔗果三糖，以及C-6單糖，例如葡萄糖、果糖或甘露糖和C-5單糖，例如木糖和阿拉伯 糖。能夠將糖轉化為鄰氨基苯甲酸鹽(2-氨基苯甲酸鹽，or ?Α〇-氨基苯甲酸鹽，〇-氨基苯 甲酸鹽，〇ΑΒ)的重組微生物菌株將能夠實現由廣泛的可再生資源(包括甜菜和甘蔗，含淀粉 的植物，例如玉米、小麥和黑麥，以及木質纖維素，例如來自稻草、木材或甘蔗渣)生產鄰氨 基苯甲酸鹽。
[0004] 目前，不存在可再生或生物衍生的鄰氨基苯甲酸鹽的來源或可商購的相應的酸， 并且已知的大規模生物生產鄰氨基苯甲酸鹽的實例還沒有被描述。鄰氨基苯甲酸鹽是莽草 酸途徑的天然中間體和用于芳族氨基酸L-色氨酸的生物合成的前體。鄰氨基苯甲酸鹽的生 物合成途徑在原核生物和真核生物兩者中是相對好理解的。可以實現將鄰氨基苯甲酸鹽化 學轉化為苯胺。當前的苯胺的生產方法依賴于由石油衍生的原材料的化學合成。與可再生 的原材料(例如可再生資源"生物質"）相反，這樣的石油衍生的原材料不是可再生的。在化 學合成中所涉及的多個化學步驟導致化學品的高生產成本。苯胺的常規化學合成可能與危 險的中間體、溶劑和廢產物相關聯，其可以對環境造成重大影響。在芳環上的非特異性副反 應導致產物收率的降低。石油衍生的原材料受到由全球石油價格導致的成本波動的影響。
[0005] W0 2013/103894 Α1公開了經由生物衍生的對氨基苯甲酸(4-氨基苯甲酸鹽)生產 芳族胺的方法。然而，該文獻公開了在大腸桿菌或釀酒酵母中生產對氨基苯甲酸，但是沒有 認識到谷氨酸棒狀桿菌作為宿主的優點。此外，該文獻也沒有公開如何成功地使發酵方法 與將生物衍生的對氨基苯甲酸轉化為芳族胺如苯胺的下游化學方法組合。關于如何化學或 生物轉化產生的對氨基苯甲酸的下游化學方法技術，該文獻僅僅提及蒸餾方法而沒有認識 到使該部分與提供對氨基苯甲酸的上游部分以連續方法形式組合的有利技術益處。
[0006] 將糖直接發酵為苯胺作為一步轉化被認為是最具成本效益的，如果基于包括鄰氨 基苯甲酸鹽至苯胺的酶催化體內脫羧作用作為最后的反應步驟的生物合成途徑的話。因為 氨基苯甲酸鹽脫羧酶無法成功地通過蛋白質工程確定或開發，所以將鄰氨基苯甲酸鹽脫羧 反應成苯胺不能通過純的酶催化手段來進行。因為這樣的一步方法在技術上是不可行的， 所以進行將鄰氨基苯甲酸鹽脫羧為苯胺的最終反應步驟作為最終反應步驟的方法替代方 案被考慮在內，例如通過化學步驟，不同于酶催化步驟。
[0007] 因此，提供一種基于化學起始產物或基于可再生資源生產苯胺的方法已經成為本 發明的技術問題，所述方法優于現有的化學和發酵方法并且實現了二氧化碳排放量的大量 減少、獨立于化石資源以及相比于已經建立的基于石油的生產方法的相似或更低的生產成 本。
[0008] 本發明已經通過提供一種生產苯胺的方法來進一步解決了所述問題，所述方法包 括以下步驟： a) 提供鄰氨基苯甲酸鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適 的陽咼子， b) 在存在或不存在催化劑下通過熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺， c) 將在步驟b)中產生的苯胺用有機溶劑萃取至少一次，和 d) 通過蒸餾純化在步驟b)和c)中產生的苯胺，其中所述蒸餾產生苯胺和水相。
[0009] 基于可再生資源(例如生物質或可發酵的碳源）的苯胺生產的變化提供了顯著地 減少C02排放量的優點，允許獨立于化石資源，并且可能實現生產成本的降低。本發明的進 一步優點是將危險化學品的使用和所得的廢物保持在最低限度。此外，可以產生生物衍生 的鄰氨基苯甲酸鹽，并在對環境的總體影響小得多的方法中將其轉化為苯胺。
[0010] 在下文中，對用于描述本發明的一些術語進行了定義。
[0011] 根據本發明的術語"生物苯胺"是指基于來自可再生資源的原材料的苯胺，例如甜 菜，甘蔗，含淀粉的植物，優選玉米、小麥和黑麥，以及木質纖維素，優選稻草、木材和甘蔗 渣，甘油和C1化合物，優選C0，或例如可發酵的糖，優選C-5單糖、C-6單糖、二糖和三糖，其中 所述C-5單糖優選為木糖和阿拉伯糖，并且其中所述C-6單糖優選為葡萄糖、果糖或甘露糖， 并且其中所述二糖優選為蔗糖，并且其中所述三糖優選為蔗果三糖。
[0012] 根據本發明的"鄰氨基苯甲酸鹽"是指ord〇-氨基苯甲酸鹽（〇-氨基苯甲酸鹽， "oAB"，"2-AB"）。鄰氨基苯甲酸鹽可以包含鄰氨基苯甲酸根陰離子C 6H4C0(T和合適的陽離子 如NH4+或Na+的鄰氨基苯甲酸鹽的形式或作為鄰氨基苯甲酸的形式存在，其為兩性離子 C6H4C00- NH3+和C6H4C00- NH2。"鄰氨基苯甲酸鹽"（"oAB"，"2-AB"）不同于其中氨基在C4-位 (對位）上連接至苯環的"4-氨基苯甲酸鹽"（"para-AB"，>-AB"），這與在鄰氨基苯甲酸鹽 ("〇AB"）的情況下的C 2-位(鄰位)不同。根據本發明的"鄰氨基苯甲酸鹽"可以通過常規的化 學方法來提供或作為可商業獲得的化學品，或者其可以借助于能夠通過發酵產生鄰氨基苯 甲酸鹽的重組微生物宿主來生物學地提供。對于化學品的一個實例，可商業獲得的鄰氨基 苯甲酸鹽是購自Sigma Aldrich的目錄號A89855的oAB。
[0013] 在本發明的含義內的術語"宿主"可以包括能夠通過發酵產生鄰氨基苯甲酸鹽的 任何宿主，其天然存在或僅在作為"重組微生物宿主"的轉變之后存在，或除天然存在的鄰 氨基苯甲酸鹽之外，在轉變之后以鄰氨基苯甲酸根陰離子的形式或作為鄰氨基苯甲酸存 在。根據本發明的"微生物宿主"可以選自細菌、酵母和真菌。所述宿主可以選自細菌、酵母 和真菌，其中所述細菌優選為大腸桿菌coii)菌株、棒狀桿菌 (Cor//? c i eri u?)菌株或假單胞菌(Pseuc/offio/jas)菌株，其中所述棒狀桿菌菌株優 選為谷氨酸棒狀桿菌（Coir/? c i eri 以u ia?i cuffi)，并且其中所述假單胞菌菌株 優選為惡臭假單胞菌(/^ e u oWo/3 a s /7 u i i c/a)。優選地，所述微生物宿主可以是重組微生 物宿主。這樣的重組微生物宿主可以是如實施例1中所示的大腸桿菌W3110 之3， 或者其可以是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032或者也可以是惡臭假單胞菌KT2440。
[0014] 在本發明的含義內的術語"遺傳修飾"是指相比于野生型序列，在微生物宿主的給 定基因的核酸序列中的變化。這樣的遺傳修飾可以包括缺失以及一個或多個脫氧核糖核酸 的插入。這樣的遺傳修飾可以包括部分或完全缺失以及通過微生物宿主的基因組中的轉變 來引入的插入。這樣的遺傳修飾可以產生重組微生物宿主，其中所述遺傳修飾可以包括相 比于各個微生物宿主的野生型序列的至少一個、兩個、三個、四個或多個單核苷酸的變化。 例如，遺傳修飾可以是至少一個、兩個、三個、四個或多個單核苷酸的缺失或插入，或至少一 個、兩個、三個、四個或多個單核苷酸的轉變。根據本發明的遺傳修飾可以具有例如降低的 各個基因的表達或例如增強的各個基因的表達的效果。在根據本發明的這樣的遺傳修飾的 一個實例中，重組微生物宿主，例如大腸桿菌，可以包含編碼酶鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉 移酶的i rp基因的遺傳修飾，其中所述遺傳修飾可以具有降低的修飾i r/7 基因的表達的 效果。這樣的重組微生物宿主可以包括如實施例1中所示的大腸桿菌W3110 3。
[0015] 在本發明的含義內的術語"分批發酵"是指具有限定的起點和限定的終點的單發 酵反應。在其中微生物的生產速率在連續發酵模式中不能保持在高速率的情況下，分批發 酵可以用于根據本發明的方法的步驟a)中。
[0016] 在本發明的含義內的術語"補料分批發酵"被定義為生物技術方法中的操作技術， 其中將一種或多種營養物(底物)在培養過程中進料(供應)至生物反應器，并且其中將一種 或多種產物保留在生物反應器中直到運行結束。在其中微生物的生產速率在連續發酵模式 中不能保持在高速率的情況下，"補料分批發酵"，可以用于根據本發明的方法的步驟a)中。
[0017] 在本發明的含義內的術語"連續發酵"是指其中在根據本發明的方法的步驟a)中 的發酵期間連續添加底物并且除去產物(即鄰氨基苯甲酸鹽，〇AB)的發酵方法。
[0018] 在下文中，對本發明進行更詳細地描述。
[0019] 本發明提供了一種生產苯胺的方法，所述方法包括以下步驟： a) 提供鄰氨基苯甲酸鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適 的陽咼子， b) 在存在或不存在催化劑下通過熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺， c) 將在步驟b)中產生的苯胺用有機溶劑萃取至少一次，和 d) 通過蒸餾純化在步驟b)和c)中產生的苯胺，其中所述蒸餾產生苯胺和水相。
[0020] 在根據本發明的方法的一個優選實施方案中，提供鄰氨基苯甲酸鹽的步驟a)中的 所述鄰氨基苯甲酸鹽通過化學方法提供或生物學地產生，優選通過包含至少一種可發酵 的碳底物的原材料的發酵來生物學地產生，其使用能夠通過發酵將包含可發酵的碳底物的 所述原材料轉化為鄰氨基苯甲酸鹽的重組微生物宿主細胞，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含 鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適的陽離子。這樣的步驟a)的合適的陽離子可以是包含在例如 NH40H溶液和NaCl溶液中的NH4+或Na+。
[0021] 在根據本發明的方法的進一步實施方案中，產生鄰氨基苯甲酸鹽的步驟a)的發酵 可以是分批發酵、補料分批發酵或連續發酵。這樣的發酵可以在發酵反應器中實施，其中培 養能夠通過發酵將包含可發酵的碳底物的原材料轉化為鄰氨基苯甲酸鹽的重組微生物宿 主細胞。這樣的培養可以在合適的碳源的存在下進行，例如玉米糖漿、甘蔗汁、糖蜜等。這樣 的培養也可以在合適的氮源的存在下進行，例如在所述重組微生物宿主細胞的存活所需的 微量營養物的存在下的氨氣、氫氧化銨溶液、硫酸銨、硝酸銨、玉米漿等。這樣的發酵中的pH 可以在添加堿(例如氨氣、氫氧化銨、氫氧化鈉等)的情況下保持為6.5-7.5的值。
[0022] 在本發明的方法的步驟a)中生物學地產生鄰氨基苯甲酸鹽可通過連續發酵來實 施，優選在連續操作的發酵罐中。在這樣的根據本發明的連續發酵中，將發酵液連續地從發 酵罐中取出并通過設備進行處理以分離出生物質，例如通過過濾、離心、膜等。
[0023] 可以將充足的氧添加到在步驟a)中使用的發酵反應器中，所述氧是純氧、作為空 氣或作為富氧空氣。不含細胞的發酵液實質上是具有鄰氨基苯甲酸根陰離子和抗衡陽離子 鄰氨基苯甲酸鹽(〇AB)的溶液。所述oAB溶液可以具有5g/升-500g/升、優選20g/升-200g/ 升、且最優選50g/升-150g/升的oAB鹽的濃度。
[0024] 在根據本發明的方法的一個優選實施方案中，步驟a)至步驟d)可連續運行。
[0025]產生鄰氨基苯甲酸鹽的步驟a)的合適的陽離子可以是NH4+或Na+。
[0026] 在根據本發明的方法的一個特別優選的實施方案中，可以在隨后通過步驟b)中的 熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺之前，將產生鄰氨基苯甲酸鹽的步驟a)的 重組微生物宿主除去。優選可以將這樣的除去的重組微生物宿主再進料至產生鄰氨基苯甲 酸鹽的步驟a)的發酵。這意味著，在吹掃小部分的包含所述重組微生物宿主的生物質之后， 可以將包含所述重組微生物宿主的生物質再循環至步驟a)的發酵罐和發酵。來自生物質的 這樣的吹掃物流可以用于避免生物質積聚。因此，可以除去在發酵罐中繁殖的一部分微生 物宿主細胞和死細胞以使發酵步驟a)的反應器中的活宿主細胞的濃度保持在限定的限值 內，最優選為恒定的。這在補料分批發酵的情況下是不同的，其中所述重組宿主細胞和一種 或多種發酵產物保留在生物反應器中直到運行結束，其因此不是連續發酵而是補料分批發 酵。
[0027] 當在根據本發明的方法的步驟b)中在存在或不存在催化劑下通過熱脫羧實施將 所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺時，所述催化劑(如果使用的話)可以是非均相酸催 化劑，優選沸石，最優選沸石H-Y、沸石H-Y(G0257)，例如獲自Zeolyst International的目 錄號CBV600。所述酸催化劑沸石H-Y(G0257，Si02/Al 203=5.5)具有特別強的酸性特征，并且 具有比例如ZSM5-27更寬的孔徑(0.7-0.8nm)，所述ZSM5-27也具有酸性特征，但其具有較小 的孔徑(〇.5nm)，使得AA分子不能滲透進入它們，并因此無法進入所述酸性催化劑的活性位 點。
[0028] 在進一步實施方案中，當在根據本發明的方法的步驟b)中在存在或不存在催化劑 下通過熱脫羧實施將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺時，所述催化劑(如果使用的 話)也可以是非均相堿催化劑，優選層狀雙氫氧化物，最優選Mg-Al水滑石，其具有堿性特征 (HTC，Mg 6Al2(C〇3)(OH)i6. 4H20)。
[0029] 當實施根據本發明的方法的步驟b)的熱脫羧時，可以將包含鄰氨基苯甲酸根陰離 子和合適的陽離子的步驟a)的鄰氨基苯甲酸鹽溶液進料至可以在150°C-250°C、優選160 °C -220 °C、最優選180 °C -200 °C的溫度下操作的化學反應器。
[0030] 實施根據本發明的方法的步驟b)的熱脫羧的反應時間對于在高收率的情況下反 應成苯胺應該是足夠的。更具體地，對于實施步驟a)的熱脫羧的時間要求可為大約0.5小 時-3小時。
[0031] 在其中可以實施熱脫羧步驟b)的反應器中的壓力可以選擇作為多少的水和苯胺 允許在反應期間蒸發和在熱脫羧反應期間與產生的C0 2-起離開反應器的函數。熱脫羧步 驟b)的產物，即反應器流出物，基本上可以是均勻的水苯胺混合物。
[0032] 可以將該步驟b)的反應器流出物直接進料至非均相共沸蒸餾序列，其中將水和苯 胺作為底部產物回收。如果在步驟b)的熱脫羧之后具有高含量(通常如果高于120g/升）的 苯胺，那么可以實施該選項。然而，對于在步驟b)的熱脫羧之后的低濃度(例如120g/升和更 小）的苯胺，在步驟b)之后的直接苯胺分離實際上僅通過蒸餾是不可行的，因為能量消耗變 得過大。
[0033] 因此，根據本發明的方法包括將在步驟b)的熱脫羧中產生的苯胺用有機溶劑萃取 至少一次的進一步步驟c)，其在進行到通過蒸餾純化苯胺的步驟d)之前。通過這種方式，在 步驟d)中的蒸餾之前，萃取步驟c)用作預濃縮步驟。可以將作為步驟b)的熱脫羧的產物的 苯胺水混合物進料至萃取裝置，例如混合沉降器、脈沖塔等，其中所述苯胺水混合物可以與 對苯胺具有高親和力的非極性有機溶劑接觸，優選具有比苯胺更高的沸點的一種非極性有 機溶劑，例如1-十二烷醇。用于根據本發明的方法中的有機溶劑可以選自醇、酚、酰胺、醚和 芳族烴。在本發明的一個優選實施方案中，用作有機溶劑的醇優選為1-十二烷醇。
[0034] 在根據本發明的方法的進一步實施方案中，在步驟c)中的用有機溶劑萃取苯胺可 以實施多于一次用于在蒸餾之前進一步預濃縮苯胺，以獲得甚至更高收率的產生的苯胺。
[0035] 優選可以回收用于步驟c)的萃取中的有機溶劑。這樣的有機溶劑的回收優選可以 通過蒸餾來完成。優選可以將回收的有機溶劑再進料至所述方法的步驟c)以再次重新用于 萃取在步驟b)中產生的苯胺。這意味著可以蒸餾苯胺-有機溶劑混合物，其中苯胺和夾帶或 溶解在其中的任何水和非極性溶劑可以作為塔頂產物被回收。然后，將包含一定濃度范圍 的苯胺的塔頂物流進料至步驟d)的蒸餾，其可以是非均相共沸蒸餾。
[0036] 在根據本發明的方法的又一實施方案中，所述方法包括將步驟c)中實施的萃取的 水相再進料至步驟a)的發酵的進一步步驟e)。
[0037] 所述方法還可以包括將步驟d)中實施的蒸餾的水相再進料至步驟a)的發酵的附 加步驟。
[0038] 可以在根據本發明的方法的生產步驟a)中用作合適的陽離子的NH4+陽離子可以在 步驟d)的蒸餾之后作為NH3被回收并再進料至步驟a)的發酵。
[0039] 當根據本發明的方法的生產步驟a)包括發酵時，用于步驟a)的發酵中的原材料可 以選自甜菜，甘蔗，含淀粉的植物，優選玉米、小麥和黑麥，以及木質纖維素，優選稻草、木材 和甘蔗渣，甘油和C1化合物，優選C0。
[0040] 當根據本發明的方法的生產步驟a)包括發酵時，包含在用于步驟a)的發酵中的原 材料中的至少一種可發酵的碳底物可以選自C-5單糖、C-6單糖、二糖和三糖，其中所述C-5 單糖優選為木糖和阿拉伯糖，并且其中所述C-6單糖優選為葡萄糖、果糖或甘露糖，并且其 中所述二糖優選為蔗糖，并且其中所述三糖可以優選為蔗果三糖。
[0041] 可用于生產鄰氨基苯甲酸鹽的發酵步驟a)中的重組微生物宿主可以選自細菌、酵 母和真菌，其中所述細菌可以優選為大腸桿菌菌株、棒狀桿菌菌株或假單胞菌菌株，其中所 述棒狀桿菌菌株可以優選為谷氨酸棒狀桿菌，并且其中所述假單胞菌菌株可以優選為惡臭 假單胞菌。
[0042] 在本發明的一個優選實施方案中，可用于步驟a)的發酵中的重組微生物宿主可以 是大腸桿菌，優選大腸桿菌W3110,甚至更優選大腸桿菌W3110 購自耶魯大學 的大腸桿菌遺傳資源中心）。
[0043] 在本發明的一個優選實施方案中，可用于步驟a)的發酵中的重組微生物宿主可以 是谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032,或者是基于該菌株的其它重組微生物宿主。
[0044] 在本發明的一個優選實施方案中，可用于步驟a)的發酵中的重組微生物宿主可以 是惡臭假單胞菌KT2440,或者是基于該菌株的其它重組微生物宿主。
[0045] 本發明進一步提供了根據如本文中所述的和如權利要求中所要求保護的本發明 的方法產生的苯胺用于生產亞甲基二苯胺(MDA)的用途，其中在水和催化劑的存在下用甲 醛將產生的苯胺進一步轉化為亞甲基二苯胺(MDA)。可以用光氣將產生的MDA進一步轉化為 亞甲基二異氰酸酯(MDI)。
[0046] 對于本領域中那些技術人員將明確的是可以對本發明的方法和重組宿主菌株進 行各種修改。因此，其意在的是本發明涵蓋這樣的修改和變體，條件是它們落在所附權利要 求及其等同物的范圍內。
[0047] 圖和表 圖1示出了根據本發明的方法的總體概念，包括在發酵步驟中將原材料轉化為鄰氨基 苯甲酸鹽，隨后在下游處理中化學轉化和純化成苯胺。
[0048] 圖2示出了根據本發明的方法的更詳細的概述。步驟a)的合適的陽離子可以是NH4+ 或Na+，因此NH3或NaOH可以用作發酵罐中的緩沖劑。
[0049]圖3示出了在連續發酵期間用于細胞截留的具有750 kDa的截留值的中空纖維 過濾模塊的集成體（integration) 〇
[0050]圖4示出了在菌株中的鄰氨基苯甲酸產量，菌株大腸桿菌W3110 trpA 9923 Apts Glc+(具有0.51mM，最好的結果），隨后是大腸桿菌W3110 trp Δ 9923(在38小時后具有比Glc +小接近〇.2mM)并且最低的生產速率是大腸桿菌W3110 trpA9923 Apts Glc-(在38小時 后具有小5倍的產生的鄰氨基苯甲酸的濃度）。
[0051 ] 圖5示出了在160°C下在含水緩沖溶液中的A)AA 0.5wt%和B)NH4AA 3 wt%的脫羧 的動力學。
[0052]圖6示出了在不同的催化劑（即沸石H-Y、沸石H-ZSM5和硫酸化的氧化鋯）的情況下 的NH4AA的脫羧的動力學，如實施例3中所述的那樣。
[0053]表1示出了在160 °C和180 °C下在緩沖溶液中的鄰氨基苯甲酸(AA)和NH4AA的脫羧 的反應級數和速率系數，如實施例2中所示的那樣。
[0054]表2示出了金屬交換的沸石Y與ZSM-5和羥基磷灰石的吸收能力的比較，如實施例4 中所示的那樣。 實施例
[0055]實施例1 -用大腸桿菌生產鄰氨基苯甲酸的實驗 菌株大腸桿菌W3110 購自耶魯大學的大腸桿菌遺傳資源中心。菌株已通 過隨機誘變產生并包含被稱為的突變的i r/7 P基因。基因的相關截 短的酶已經失去了其催化鄰氨基苯甲酸磷酸核糖基轉移酶的反應的能力，但保持了其鄰氨 基苯甲酸合酶活性。因此該菌株可以合成鄰氨基苯甲酸鹽，但不能進一步將它代謝為色氨 酸，因此是色氨酸營養缺陷體。這導致了鄰氨基苯甲酸鹽的溢出(overflow)。
[0056] 該菌株生長在28 °C和140rpm下的具有10ml培養體積的50ml搖瓶中。所使用的培養 基是具有色氨酸的礦物培養基M9,定義如下：10g/l葡萄糖、6g/l Na2HP〇4、0.5g/l NaCl、3g/ 1 KH2P〇4、lg/l NH4Cl、246.5mg/l MgS〇4、14.7mg/l CaCl2、10mg/l硫胺（維生素 Bl)、20mg/1 色氨酸。在25.5小時后通過HPLC測得所述菌株產生60mg/l鄰氨基苯甲酸。所比較的菌株為 大腸桿菌 W3110 trpA9923;大腸桿菌 W3110 trpA9923 Apts Glc+;和大腸桿菌 W3110 trp Δ 9923 Apts Glc-。
[0057] 色氨酸營養缺陷被證實在trpD9923菌株中。用包含色氨酸的礦物培養基M9進行發 酵，所述菌株產生60mg/l鄰氨基苯甲酸。
[0058]通過使用基因敲除缺失使磷酸轉移酶系統失活來進一步優化該菌株。使pts缺陷 菌株適應在葡萄糖上生長，并在37°C和150rpm下使用具有10ml的培養體積的25ml搖瓶發酵 測試鄰氨基苯甲酸鹽產量。對于pts陽性菌株使用相同的培養基。在25小時之后通過HPLC測 得其產生69mg/l。在LB培養基中進行預先溫育之后，通過三種菌株大腸桿菌W3110trpA 9923;大腸桿菌 W3110 trpA 9923 Apts Glc+;和大腸桿菌 W3110 trpA 9923 Apts Glc-的鄰氨基苯甲酸的產量可見顯著的改進。最好的鄰氨基苯甲酸的生產菌株是大腸桿菌 W3110 trpA9923 Apts Glc+(具有0.51mM)，隨后是大腸桿菌W3110 trpA9923(在38小時 后具有比Glc+小接近0.2mM)和最差的菌株是大腸桿菌W3110 trpA9923 Apts Glc-(在38 小時后具有小5倍的產生的鄰氨基苯甲酸的濃度），如在圖4中可見的那樣。
[0059]實施例2 -不用催化劑的A) AA 0.5wt%和B)NH4AA的脫羧的動力學 在該實驗中，對根據本發明的方法的步驟b)的熱脫羧的動力學進行了研究。如果將 NH40H溶液添加到鄰氨基苯甲酸(AA)緩沖溶液，那么AA逐漸轉化為鄰氨基苯甲酸銨，其具有 比AA本身高得多的溶解度(高達10%)。在這種情況下，可以將鄰氨基苯甲酸根離子脫羧為苯 胺(ANLKAA或鄰氨基苯甲酸鹽分別通過重組微生物宿主來生物學地提供，如實施例1中 所述的那樣，或者通過化學方法提供，例如可商業上獲得，例如來自Sigma A1 dr ich的目錄 號A89855。
[0060] 制備在蒸餾水中包含(順4)23〇4(2(^/1)、他2冊〇4(18/1)和1012?〇4(18/1)的緩沖溶 液。然后使AA 10wt%懸浮于該溶液中。將NH40H溶液(28-30%NH3)逐滴添加到該懸浮液中，直 至形成澄清的黃色溶液。該鄰氨基苯甲酸銨(NH4AA)溶液的pH約為7。使用該方法還制備了 鄰氨基苯甲酸銨(3wt%)溶液。
[0061 ] 將80mL的上述各溶液轉移到160mL高壓釜中并加熱至160°C或180°C，并且在不同 的時間間隔下取樣以分析苯胺(ANL)形成的速率。
[0062]在160°C下在不使用任何催化劑的情況下實施在含水緩沖溶液中的AA 0.5wt%和 NH4AA 3wt%的脫羧。對于兩個反應，使用模型的研究產生了偽一級動力學。這些反應的曲線 示于圖5中。使用如下的一般反應速率公式建立動力學模型，并考慮實驗數據以分別計算優 化的k和η參數，其分別為速率系數和反應級數。
= k [A ]n X d t = [d]i - k X 4"
[0063]如在下面的表1中所示，這些反應的級數(n)接近于1。在水中的AA 0.5wt%脫羧的 速率系數(k)比NH4AA 3wt%的速率系數大6.8倍。
[0064]還使用實驗數據和模擬模型研究了在160°C和180°C下的NH4AA 10wt%脫羧的動力 學。
[0065] 表1.在160°C和180°C下在緩沖溶液中的AA和NH4AA脫羧的反應級數和速率系數。
[0066]如觀察到的（表1和圖5)，兩個反應遵循偽一級動力學。此外，在180°C下反應的速 率系數比在160°C下反應的速率系數大36倍。該數字與在水中的AA 0.5wt%脫羧的數字是非 常有競爭力的。最重要的是，在NH4AA的情況下存在高20倍的濃度的巨大優勢。實施例2表 明，可以在遵循一級動力學的反應的情況下使〇AB鹽在水溶液中脫羧。因此，可以實現將鄰 氨基苯甲酸根離子幾乎完全轉化為苯胺，例如在活塞流反應器或混合罐的級聯中。
[0067]實施例3 -用催化劑的NH4AA的脫羧的動力學 該實施例遵循與實施例2相同的程序，除了將1.6g(2%)的酸性催化劑添加到80mL的溶 液中。所使用的催化劑是沸石H_Y(Zeolyst International，目錄號CBV600)、沸石H_ZSM5(S iid-Chemie/Clariant，目錄號H-MFI-27)和硫酸化的氧化錯(Mel Chemicals，目錄號MELCat XZO 1720)。在圖6中，將結果與如實施例2中所述的不用催化劑（空白）的實驗進行對比。空 白實驗、硫酸化的氧化鋯和ZSM-5所有三個達到了可比的90-92%的AA的轉化率。僅催化劑 ZSM-5顯示出AA至苯胺的更高的轉化率，即高達99%。
[0068] 實施例4 -在礦物吸收劑上的鄰氨基苯甲酸的吸收/解吸 如從實施例3和圖6可見，盡管具有最高的催化活性和轉化率且幾乎沒有鄰氨基苯甲酸 留下，但是沸石-Y催化劑沒有給出苯胺作為產物的最高收率。該固體的分析顯示出苯胺產 物的缺少部分被強烈地吸收在催化劑本身上。
[0069] 對在不同類型的吸附劑上的AA吸附能力進行了測試。將沸石Y (Zeolyst International，目錄號CBV600)和ZSM5(Sued-Chemie/Clariant，目錄號H-MFI-27)選為沸 石，其功能為用于不同分子的分子篩。羥基磷灰石(Cai〇(P〇4)6(〇H)2) (Sigma-Aldrich，目錄 號289396)由于其在不同溶劑中吸附AA和一些其它類似的化合物的能力而被測試。
[0070] 吸附測試：吸附劑已經在300°C下煅燒3小時以釋放任何殘留的水分。制備AA (0.5wt%)在水中的溶液。將20mL的該溶液轉移到包含0.2g吸附劑的50mL燒瓶中。在攪拌下 一段時間后，通過HPLC分析AA在水中的濃度。在水中的AA濃度的減少被認為是吸附的AA。
[0071] 金屬交換的沸石的合成:考慮到并入Ca的沸石的改進的吸附能力，通過離子交換 制備待在AA的吸附中測試的Ca交換的沸石。將3g作為粉末的沸石H-Y添加懂啊Ca(N0 3) 2.4H20(0.5M)的溶液中。將該漿料攪拌4小時，然后將該溶液替換為新鮮的溶液，并將該程序 重復兩次以上。最后，通過離心分離出固體并將其在80°C下干燥和在300 °C下煅燒3小時。用 如上所述的相同方法制備使用1(、似、1%、？6的四種其它金屬交換的沸石￥樣品。然后將樣品 標記為 κ-γ、Na-γ、Ca-γ、Mg-Y 和 Fe-Y。
[0072]吸收研究的結果總結于下表2中： 表2:金屬交換的沸石Y與ZSM-5和羥基磷灰石的吸收能力的比較
[0073]相比于ZSM-5和羥基磷灰石，沸石Y的吸收能力是更優越的。這可能是由于較大的 孔徑和不同的孔隙結構。這還可以進一步通過用陽離子交換來增加。陽離子的電荷和尺寸 的趨勢是明顯的，因此吸收過程強烈地取決于吸收劑的表面電荷。
[0074]通過使裝載的吸收劑與80mL的10%Na0H水接觸，可以將吸收的AA提取回溶液中，具 有高達80%的收率。通過使其與80ml的pH為7的緩沖溶液（即用于吸收過程的相同溶液)接 觸，觀察到幾乎沒有解吸(〈10%)。該實施例表明，吸收過程是取決于表面電荷的熱力學平衡 系統。
[0075] 實施例5:用于萃取的溶劑選擇和在水相和溶劑(有機)相之間的苯胺分配系數 溶劑篩選在C0SM0計算的基礎上完成。所用的C0SM0方法具有以下兩個步驟： a) 用量子化學計算確定被良好的導電介質包圍的分子上的表面電荷。 b) 從電荷分布導出溶質在各種溶劑中的化學勢。
[0076] 此外，以下進一步的限制必須被考慮在內：在水中的低溶解度、中等的粘度、能夠 實現舒服的相分離的密度和界面張力、相對于苯胺的高沸點(boiler)。結果是發現了長鏈 醇和長鏈胺及其二者的混合物(7〈C-數〈17)。
[0077] 對于兩種醇的Unifac計算示于下表3中。
[0078] 表 3
[0079] 使用十二烷醇異構體的混合物可以提供低的相互溶度和較低熔點的優勢。
[0080] 實施例6:用于從水中萃取苯胺的設計計算 在該實施例中，進料物流組成是93%水、7%苯胺。所使用的塔是脈沖塔。填料通過具有 500的比表面積的金屬規整填料（由于高通量）來完成（填料的實例：Mellapack 500Y或 Montz B1-500)。材料是不銹鋼。
[0081]尺寸如下：對于60t/h的含水進料的容量（使用F/S=2 wt/wt計算的十二燒醇流 量)： ?塔內有效直徑=1200-1300mm ?有效填料長度=ll-12m ?總塔長度=14-15m。
[0082] 對于200t/h的容量(使用F/S=2 wt/wt計算的十二烷醇流量）： ?塔內有效直徑=2300-2500mm ?填料長度=15-16m ?總塔長度=18-19m。
【主權項】
1. 用于生產苯胺的方法，其包括以下步驟： a) 提供鄰氨基苯甲酸鹽，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適 的陽咼子， b) 在存在或不存在催化劑下通過熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺， c) 將在步驟b)中產生的苯胺用有機溶劑萃取至少一次，和 d) 通過蒸餾純化在步驟b)和c)中產生的苯胺，其中所述蒸餾產生苯胺和水相。2. 權利要求1的方法，其中步驟a)中的所述鄰氨基苯甲酸鹽通過化學方法提供或生 物學地產生，優選通過包含至少一種可發酵的碳底物的原材料的發酵來生物學地產生，其 使用能夠通過發酵將包含可發酵的碳底物的所述原材料轉化為鄰氨基苯甲酸鹽的重組微 生物宿主細胞，其中所述鄰氨基苯甲酸鹽包含鄰氨基苯甲酸根陰離子和合適的陽離子。3. 根據權利要求2的方法，其中步驟a)的所述發酵是分批發酵、補料分批發酵或連續發 酵。4. 根據權利要求1或權利要求2的方法，其中步驟a)至步驟d)連續運行。5. 根據權利要求1-4任一項的方法，其中步驟a)的所述合適的陽離子是MV或Na+。6. 根據權利要求2-5任一項的方法，其中將步驟a)的所述重組微生物宿主在隨后通過 步驟b)中的熱脫羧將所述鄰氨基苯甲酸根陰離子轉化為苯胺之前除去，其中優選將所述除 去的重組微生物宿主再進料至步驟a)的發酵。7. 根據權利要求1-6任一項的方法，其中所述催化劑是非均相酸催化劑，優選沸石，最 優選沸石H-Y。8. 根據權利要求1-6任一項的方法，其中所述催化劑是非均相堿催化劑，優選層狀雙氫 氧化物，最優選Mg-Al水滑石。9. 根據權利要求1-8任一項的方法，其中將在步驟c)中的用有機溶劑萃取苯胺實施多 于一次，用于在蒸餾之前進一步預濃縮苯胺。10. 根據權利要求1-9任一項的方法，其包括回收用于步驟c)的萃取中的有機溶劑，其 中所述回收優選通過蒸餾來完成，其中優選將所述回收的有機溶劑再進料至步驟c)以再次 重新用于萃取在步驟b)中產生的苯胺。11. 根據權利要求1-10任一項的方法，其中所述有機溶劑選自醇、酚、酰胺、醚和芳族 烴，其中所述醇優選為1 -十二烷醇。12. 根據權利要求2-11任一項的方法，其包括將在步驟c)中實施的萃取的水相再進料 和/或將在步驟d)中實施的蒸餾的水相再進料至步驟a)的發酵的進一步步驟e)。13. 根據權利要求5-12任一項的方法，其中在步驟d)的蒸餾之后將所述NH4+陽離子作為 NH3回收并再進料至步驟a)的發酵。14. 根據權利要求2-13任一項的方法，其中步驟a)的所述原材料選自甜菜，甘蔗，含淀 粉的植物，優選玉米、小麥和黑麥，以及木質纖維素，優選稻草、木材和甘蔗渣，甘油和C1化 合物，優選CO。15. 根據權利要求2-14任一項的方法，其中所述可發酵的碳底物選自C-5單糖、C-6單 糖、二糖和三糖，其中所述C-5單糖優選為木糖和阿拉伯糖，并且其中所述C-6單糖優選為葡 萄糖、果糖或甘露糖，并且其中所述二糖優選為蔗糖，并且其中所述三糖優選為蔗果三糖。16. 根據權利要求2-15任一項的方法，其中所述重組宿主選自細菌、酵母和真菌，其中 所述細菌優選為大腸桿菌菌株、棒狀桿菌菌株或假單胞菌菌株，其中所述棒狀桿菌菌株優 選為谷氨酸棒狀桿菌，更優選谷氨酸棒狀桿菌ATCC 13032，并且其中所述假單胞菌菌株優 選為惡臭假單胞菌，更優選惡臭假單胞菌KT2440。17. 根據權利要求1-16任一項產生的苯胺用于產生亞甲基二苯胺(MDA)的用途，其中在 水和催化劑的存在下用甲醛將產生的苯胺進一步轉化為亞甲基二苯胺(MDA)。18. 權利要求17的用途，其中用光氣將產生的MDA進一步轉化為亞甲基二異氰酸酯 (MDI)〇
【文檔編號】C12P7/40GK105992824SQ201580008952
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月19日
【發明人】G.耶格, J.馬格努斯, A.S.穆薩
【申請人】科思創德國股份有限公司