冰結構蛋白質的制作方法

冰結構蛋白質的制作方法
【專利摘要】本發明涉及核酸構建體，其包含：編碼冰結構蛋白質(ISP)的核酸序列，所述ISP包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者與其至少80％同一的序列，或者包含在SEQ ID NO:1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者與其至少80％同一的序列；以及有效連接至所述冰結構蛋白質的核酸序列的控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在絲狀真菌宿主細胞中表達。所述構建體可在產生ISP的方法中使用，其中所述ISP在絲狀真菌宿主細胞中表達。CBS 12490320090701
【專利說明】冰結構蛋白質 發明領域
[0001 ] 本發明涉及包含編碼冰結構蛋白質（ice structuring protein，ISP)的核酸序列 的核酸構建體。本發明還涉及包含所述核酸的表達載體并且涉及包含所述核酸構建體或者 所述表達載體的絲狀真菌宿主細胞。本發明還涉及一種用于產生ISP的方法，涉及通過這樣 的方法可獲得的ISP，涉及ISP，涉及包含這種ISP的食物組合物，涉及一種使用所述ISP制備 食物組合物的方法，以及涉及所述ISP在食物組合物中的用途。
[0002] 發明背景
[0003] 具有潛在許多應用可能性的一組受關注蛋白質是冰結構蛋白質（ISP)，其通常被 稱為抗凍蛋白質（antifreeze protein，AFP)。
[0004] Warren等人(US5118792)已經建議在冷凍前將經純化的ISP直接加入食物產品中 以改善冷凍儲存期間的保藏特征。W090/13571A1教導了通過使用分離形式的抗凍多肽抑制 冰晶生長或者抑制冰再結晶，來改善食物產品的耐冷凍性的方法。在過去已經提出了ISP在 食物和非食物中的大量應用，例如Griff ith和Vanya Ewart(1995)Biotechnology Advances 13: 375-402和EP2602263A2中所例示的。然而，由于使用ISP的高成本，許多應用 當前在經濟上是不可行的。
[0005] 使用此類ISP的成本必須盡可能低，以允許開發許多不同的應用。雖然當前使用源 自大洋鯰(ocean pout)的AFP III型HPLC12進行工業規模的冰淇淋生產，但是與以經濟上 有吸引力的價格大量生產ISP相關聯的困難阻礙了其在其它工業應用中的使用。可在不同 應用中使用的理想ISP將在低濃度時具有高活性，低成本，輕易可得并且使用簡單。
[0006] 通過選擇每摩爾蛋白質具有高冰結構活性的ISP來獲得低成本的ISP使用。最深入 研究和工業使用的ISP (源自大洋鯰的III型AFP)用于在-6 °C下的30 %蔗糖溶液中獲得再結 晶抑制的最小濃度已經被報告為>700nM(Smallwood等（1999)Biochem.J. 340: 385-391; Tomczak等（2003)Biochem. Biophys · Res · Comm.311:1041-1046)。因此，在應用中需要相對 高的ISP濃度來獲得令人滿意的結果。聯合利華公司(Unilever)已經報導冰淇淋應用中ISP (III型AFP)的濃度為約50mg/kg(w/w)(Lewis(2006)Application for the Approval of Ice Structuring Protein Type III HPLC 12 Preparation for use in Edible Ices, Regulation(EC)No 258/97 of the European Parliament and of the Council of 27th January 1997 Concerning Novel Foods and Novel Food Ingredients)，此等效于7μΜ的 此ISP。還有已經報導的是，可用3-25μΜ的III型AFP來抑制冰晶生長（Li和Hew( 1991) Protein engineering 4:1003-1008)。以更低的所需劑量產生類似效果的ISP將有益地降 低這些蛋白質的使用成本并且將開拓開發另外應用的可能性。
[0007] 此外，每kg發酵液中ISP的高度表達將導致降低的成本價格和低使用成本。高度表 達還將產生僅需要最少純化的更純產品，從而進一步降低成本價格。
[0008] 然而目前在文獻中描述的ISP的生產率低。來自大洋鯰的III型AFP在發面酵母 Saccharomyces cerevisiae中的表達已經被報導為困難的（US 6914043 B1)并且當培養液 的上清液未稀釋時僅為可檢測到，這暗示了低水平表達。
[0009]此外，Leucosporidium的ISP(LelBP)在Escherichia coli或者Pichia pastoris 中的表達被描述為在搖瓶中介于2. 1和61 .2毫克/升培養液之間（Park等（2012) Cryobiology 64:286-296)，雖然這兩種微生物過去的記錄是成功地以高水平表達異源蛋 白。
[0010] 近來Lee等人已經匯總了關于已知ISP的表達的所有文獻，并且總結出表達水平不 超過 175mg/l(Lee等（2013)Appl .Microbiol .Biotechnol .97:3383-3393)。他們提出ISP應 用極大地受到經濟實惠的生產系統的缺乏的阻礙。
[0011]相同的作者通過分批補料和在降低的溫度下加入甲醇來誘導生產的組合將LelBP 的生產率增大到了約300mg/l。由于發酵中的低生產率，蛋白質必須在其可用于進一步實驗 之前濃縮和純化，從而導致了非常不良的產率和最終的高成本價格。此類措施可有助于實 驗室規模的發酵，但是對于工業生產來說并不經濟實惠。由于當前描述的ISP的使用成本 高，因此ISP在工業中的使用是有限的。
[0012]除了使用成本以外，還重要的是終產品具有關于食物產品中ISP應用的GRAS(-般 被認為是安全的)狀態。在文獻中描述的許多ISP是在微生物體中表達或者是使用缺乏此狀 態的工藝生產的，并且因此不能用于食物應用中。舉例來說，LelBP當前是在Pichia pastoris中表達的，Pichia pastoris是一種需要加入有毒甲醇來誘導LeIBP表達的酵母 (Lee 等人（2013))〇
[0013]因此，存在對高活性、低成本、可以食品級形式輕易獲得并且使用簡單的ISP的需 要。
[0014] 發明概述
[0015] 本發明基于來自Leucosporidium sp.的冰結構蛋白質(AFP19)在絲狀真菌中的成 功表達。AFP19在絲狀真菌中的表達水平驚人地、異常地高，比文獻中描述的在細菌或者酵 母中的表達要高得多。
[0016]此外，在絲狀真菌中表達的AFP19在極低濃度下表現出了非常良好的冰再結晶抑 制活性。此ISP表現為在約20nM對冰再結晶具有活性，比所發現的來源于大洋鯰的當前工業 標準III型AFP的濃度低35倍。
[0017]驚人地，AFP19在絲狀真菌中的生產率在搖瓶規模下高于lg/Ι。相同蛋白質在搖瓶 規模下于酵母或者細菌中的生產率已經在文獻中被報導為低15-500倍(命名為LelBP)。因 此，在絲狀真菌中表達的AFP19的使用成本將比所有目前已知的ISP低得多。因此，相較于目 前已知的ISP，使用在絲狀真菌中表達的AFP19將使很多工業應用成為經濟上可行的。
[0018]此外，看起來在絲狀真菌中產生的ISP是穩定的蛋白質:可能的穩定化特性是N-糖 基化或者〇-糖基化和/或在N末端由焦谷胺酸封閉。
[0019] 根據本發明，由此提供了核酸構建體，其包含：
[0020] 編碼冰結構蛋白質（ISP)的核酸序列，所述ISP包含SEQ ID N0:1所示的序列或者 與其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID N0:1中的第21至261位氨基酸所示的序列或者 與其至少80%同一的序列；以及有效地連接至此序列的
[0021] 控制序列，其允許所述核酸序列在絲狀真菌宿主細胞中表達。
[0022]本發明還提供了：
[0023]-表達載體，其包含本發明的核酸構建體；
[0024]-絲狀真菌宿主細胞，其包含本發明的核酸構建體或者表達載體；
[0025]-用于產生冰結構蛋白質（ISP)的方法，所述方法包括：
[0026] -提供絲狀真菌宿主細胞，所述絲狀真菌宿主細胞包含編碼ISP的核酸序列，所述 ISP包含SEQ ID NO: 1所示的序列或者與其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID NO: 1中 的第21至261位氨基酸所示的序列或者與其至少80%同一的序列，
[0027] 其中所述核酸序列有效地連接至控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在絲 狀真菌宿主細胞中表達；
[0028] -在適用于產生冰結構蛋白質的條件下培養絲狀真菌宿主細胞；以及任選地
[0029] -回收冰結構蛋白質；
[0030] -能夠通過本發明方法獲得的冰結構蛋白質；
[0031] -冰結構蛋白質，所述冰結構蛋白質包含SEQ ID NO: 1所示的序列或者與其至少 80%同一的序列，或者包含SEQ ID N0:1中的第21至261位氨基酸所示的序列或者與其至少 80%同一的序列，其中：
[0032] 至少一個氨基酸是經修飾的氨基酸；
[0033] 至少一個氨基酸是0-甘露糖基化的;或者
[0034]所述蛋白質具有除2GlcNac和2個己糖單元以外的糖基化模式；
[0035] -食物組合物，其包含本發明的冰結構蛋白質；
[0036] -用于制備食物組合物的方法，所述方法包括將根據本發明的冰結構蛋白質與一 種或多種食物成分組合；
[0037] -本發明的冰結構蛋白質在食物組合物中的用途;以及
[0038] -本發明的食物組合物或者用途，其中所述食物組合物是冷凍糖食產品，諸如冰淇 淋或冰糕(sorbet)。
[0039] 附圖簡述
[0040] 圖1示出用于AFP19基因克隆的pGBT0P-16載體的物理圖譜。pGBT0P-16載體衍生自 在W02011/009700中描述的pGBT0P-12載體。除了pGBT0P-12以外，其還含有來源于E. coli、 用于正向選擇EcoRI和Pac I克隆位點之間的插入的存在的ccdB基因。Pac I限制性位點替代 了 pGBTOP-12中存在的SnaBI限制性位點。
[0041 ] 圖2示出在PNG酶F(PNGase F)處理前和后，對來源于Aspergillus niger的AFP19 的LC MS/MS大小測定。
[0042]圖3示出在用PNG酶f進行去糖基化前后的AFP形式的檢測質量。C末端截短形式的 焦谷胺酸化AFP在圖中用灰色矩形指示。162Da代表己糖的質量。
[0043] 圖4示出用來源于Aspergillus niger的AFP19生產的冰沙（sorbet ice)的融化行 為。
[0044] 圖5示出用來源于Aspergillus niger的AFP19生產的冰淇淋的融化行為。
[0045] 序列表描述
[0046] SEQ ID NO: 1示出Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白質序列。此序列由用于 Leucosporidium中有效分泌的20個氨基酸的信號序列和推定的241個氨基酸的成熟蛋白質 序列組成。Leucosporidium的AFP19的氨基酸序列還示出為Swiss-Prot/TrEMBL (登記號： C7F6X3)和基因庫登記號ACU30807.1。
[0047] SEQ ID NO:2示出用于在Aspergillus niger中表達SEQ ID NO: 1的密碼子適應的 DNA序列。
[0048] SEQ ID NO:3示出用于在Aspergillus niger中表達SEQ ID NO: 1的密碼子適應的 DNA序列，該密碼子適應的DNA序列含有用于在Aspergillus表達載體中亞克隆的附加限制 性位點。
[0049] 發明詳述
[0050] 貫穿本說明書和所附權利要求書，詞語"包含"、"包括"和"具有"及其變體可解釋 為包含性的。也就是說，這些詞語意指可能包括上下文允許但沒有具體描述的其它要素或 整數。
[0051] 本文中不使用數量詞修飾時是指一個(種)或者一個(種）以上（即，一個(種)或至 少一個(種））語法上的物品對象。舉例來說，"要素"可意指一個要素或者一個以上的要素。 [0052] 本發明涉及例如來源于Leucosporidium sp.的冰結構蛋白質（ISP)(諸如AFP19) 在絲狀真菌中的表達，AFP19的全長氨基酸序列示出于SEQ ID NO: 1中。此類蛋白質在絲狀 真菌中的表達水平已經表現為出乎意料和異常地高；比在文獻中描述的細菌或者酵母中的 表達水平要高得多。
[0053]此外，使用絲狀真菌表達的本發明的ISP可在化學水平上與從野生型來源分離的 等價蛋白區分或者與在細菌或者酵母中表達的等價蛋白區分。
[0054]本發明的ISP可用于制備食物組合物，例如冰淇淋或冰糕。
[0055] 本發明的ISP的使用向最終食物組合物或者此類組合物的制備賦予了大量優點。
[0056] 例如關于食物組合物的制備，本發明的ISP的使用使得在冷凍食物組合物的制備 中（例如在冰淇淋或冰糕的制備中）硬化減緩。這可允許使用較大的包裝尺寸和/或在氣流 冷凍中的硬化期間使用較少的功率輸入。此外，本發明的ISP的使用甚至可導致冰淇淋和冷 凍點心生產期間硬化步驟的省略，從而允許具有更少能量成本的更快生產工藝。此外，本發 明的ISP的使用可使得能夠減少食物組合物(諸如冰淇淋或冰糕)制備期間穩定劑的使用。 [0057]對于使用本發明的ISP制備的食物組合物本身，此類食物組合物可具有增長的貨 架期而沒有品質損失(相較于未使用本發明的ISP制備的相應食物組合物）。特別地，使用本 發明的ISP制備的食物組合物可比不是使用此類ISP制備的食物組合物更抗熱擊，并且有可 將此類食物組合物存儲在比不使用此類ISP制備的食物組合物的更高的溫度下。此類食物 組合物的質量可為較不易受到伴隨此類食物產品的運輸和零售處理發生的溫度波動的影 響。
[0058] 此外，使用本發明的ISP制備所得的食物組合物可具有改善的質地特性，例如所得 食物組合物可更緊實(firm)且具有更高的膨脹率(overrun)，從而使得此類食物組合物的 制備需要更少的成分，并且融化可減少而使得滴出更少（同樣與不是使用本發明的ISP制造 的等價食物組合物相比較）。
[0059] 因此，本發明涉及核酸構建體，所述核酸構建體包含:編碼冰結構蛋白質（ISP)的 核酸序列，以及有效連接至所述核酸序列的控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在 絲狀真菌宿主細胞中表達。可將核酸構建體并入載體(諸如表達載體)和/或宿主細胞中，以 便實現ISP的表達。
[0060] 術語"核酸構建體"在本文中指核酸分子，所述核酸分子是單鏈或雙鏈的，是從天 然存在的基因中分離出來的，或者更典型地已經被修飾而含有以不是天然存在的方式組合 和鄰接(juxtaposed)的核酸區段。也就是說，根據本發明的核酸構建體是重組構建體，SP非 天然存在的核酸構建體。當核酸構建體含有表達編碼序列所需的所有控制序列時，術語核 酸構建體與術語"表達盒"同義，其中所述控制序列有效連接至所述編碼序列。
[0061 ]本發明的核酸構建體包含編碼冰結構蛋白質（ISP)的核酸序列。
[0062]出于本發明的目的，"冰結構蛋白（ISP)"或者替代地"抗凍蛋白（AFP)"或者"冰結 合蛋白"是指能夠結合小冰晶以便抑制冰晶的生長和再結晶的多肽。可如實施例4中所描述 地測量再結晶抑制（1?1)(參見1'〇111〇2&1<:等人（2003)13;[0(3116111.13;[(^115^.1^8· Comm .311:1041-1046) 0
[0063] ISP還可以為或者為相較于不包含ISP的相同溶液能夠造成或者增大溶液的熔點 和冰點之間的差異的多肽，即為能夠增大溶液的熱滯后的多肽。可使用克利夫頓納升滲透 壓儀（Clifton nanolitre osmometer)來測量熱滯后。
[0064]核酸序列(包括在本發明的核酸構建體中）編碼包含以下的ISP:
[0065]在SEQ ID NO: 1中示出的氨基酸序列或者與其至少80%同一的序列；或者，
[0066] 在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的氨基酸序列或者與其至少50%、 60%、70%或者80%同一的序列。
[0067] SEQ ID NO: 1示出Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白質序列。此序列由用于使 得在Leucosporidium中進行有效分泌的20個氨基酸的信號序列和推定的241個氨基酸的成 熟蛋白質序列組成。
[0068]在本發明的核酸構建體中，核酸序列可編碼這樣的ISP，所述ISP包含在SEQ ID NO: 1中示出的序列或者與其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的 序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者與其至少85%、至 少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。
[0069]也就是說，在本發明的核酸構建體中使用的核酸序列可與在SEQ ID N0:1中示出 的氨基酸序列或者SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的氨基酸序列共享至少50%、 60 %、70 %、80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %的序列同 一性。
[0070] 在本發明的核酸構建體中，核酸可編碼包含可從Leucosporidium屬的北極酵母 (arctic yeast)獲得的氨基酸序列的ISP。
[0071] 出于本發明的目的，在本文中限定，為了確定兩個氨基酸序列或者兩個核酸序列 的序列同一性百分比，出于最佳比較目的而比對所述序列。為了最佳化兩個序列之間的比 對，可在所比較的兩個序列中的任意一者中引入空位。此類比對可在所比較序列的全長上 進行。或者，所述比對可在較短的長度上進行，例如在約20、約50、約100或者更多個核酸/堿 基或氨基酸上。序列同一性是在所報告的比對區域中兩個序列之間的相同匹配百分比。 [0072]在絲狀真菌中實際表達的ISP的氨基酸序列可不包含理論上由所述核酸序列編碼 的所有那些氨基酸。舉例來說，氨基酸序列可比理論上由所述核酸序列編碼的氨基酸序列 更短，例如由于從ISP的N末端和/或C末端缺失氨基酸(相較于所預測的序列）。舉例來說，所 述氨基酸序列可比所預測的SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸的成熟序列短一個、兩個、 三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或者十二個或者更多個氨基酸。在這 種情況下，同一性可以在排除那些理論上存在但是實際上不存在的氨基酸的比對的基礎上 計算。
[0073]因此，核酸序列(包括在本發明的核酸構建體中）可編碼包含以下的ISP:
[0074] 在SEQ ID NO: 1的第21至260位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至259位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至258位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至257位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至256位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至255位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至254位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至253位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至252位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至251位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至250位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至249位氨基酸中示出的氨 基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第21至248位氨基酸中示出的氨基酸序列、在SEQ ID NO: 1的第 21至247位氨基酸中示出的氨基酸序列，或者在SEQ ID NO: 1的第21至246位氨基酸中示出 的氨基酸序列，或者與上述任一序列至少50 %、至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。
[0075] 在另一優選方案中，ISP的氨基酸序列已根據如在W02010/102982描述的方法進行 了修飾，從而產生了在絲狀真菌中進一步改善的表達。
[0076]兩個序列之間的序列比較和序列同一性百分比的確定可使用數學算法實現。技術 人員將了解到該事實，若干不同的計算機程序可用來比對兩個序列和確定兩個序列之間的 同一性（Kruskal，J·B·(1983)An overview of sequence comparison，D·Sankoff和 J·B·Kruskal編，Time warps , string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison,第1-44頁Addison Wesley)。兩個氨基酸序列之間或 者兩個核苷酸序列之間的序列同一性百分比可使用用于比對兩個序列的Needleman和 Wunsch算法計算（Needleman，S.B.和Wunsch，C.D. (1970)J.Mol .Biol ·48,443-453)。氨基酸 序列和和核苷酸序列兩者均可通過算法比對。已經在計算機程序NEEDLE中實施了 Needleman-Wunsch算法。出于本發明的目的，使用來自EMBOSS程序包的NEEDLE程序(2.8.0 版或更高版本，EMB0SS:The European Molecular Biology Open Software Suite(2〇00) Rice,P.Longden，I.和Bleasby，A.Trends in Genetics 16,(6)第276-277,頁〈http:// emboss. bio informat ics .nl/>)。對于蛋白質序列，使用EBL0SUM62作為取代矩陣。對于核苷 酸序列，使用EDNAFULL。所使用的可選參數為空位開放罰分10和空位延伸罰分0.5。技術人 員將理解，所有這些不同的參數將得到稍有不同的結果，但是當使用不同算法時，兩個序列 的總體同一 1性百分比并未顯著改變。
[0077]用如上所述的程序NEEDLE進行比對之后，查詢序列和本發明序列之間的序列同一 性百分比計算如下:將比對中顯示出兩個序列中的相同氨基酸或者相同核苷酸的相應位置 的數目除以減去比對中的空位總數之后的比對總長度。在本文中定義的同一性可通過使用 N0BRIEF選項從NEEDLE中獲得并且在程序的輸出中標記為"最長同一性"。
[0078]本發明的核酸序列和蛋白質序列還可用作"查詢序列"以執行對公共數據庫的檢 索，從而例如識別其它家族成員或相關序列。此類檢索可使用Altschul，等.（1990) J .Mol · Biol · 215:403-10的NBLAST和XBLAST程序(2 · 0版本)來執行。BLAST核苷酸檢索可用 NBLAST程序，得分=100、字長=12來執行，以獲得與本發明的核酸分子同源的核苷酸序列。 BLAST蛋白質檢索可用XBLAST程序，得分= 50、字長=3來執行，以獲得與本發明的蛋白質分 子同源的氨基酸序列。為了獲得出于比較目的的空位比對，可使用如在Altschul等，（1997) Nucleic Acids Res.25(17) :3389-3402中描述的空位化BLAST(Gapped BLAST)。當利用 BLAST和空位化BLAST程序時，可使用相應程序（例如，XBLAST和NBLAST)的默認參數。參見 http: //www · nebi · nlm · nih · gov/的國家生物技術信息中心的主頁。
[0079] 編碼ISP的核酸序列有效地連接至控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在 絲狀真菌宿主細胞中表達。
[0080] 術語"有效連接"在本文中被定義為以下構造:其中控制序列放置在相對于ISP編 碼序列適當的位置處，以使得所述控制序列指引RNA或者mRNA的產生和任選地從所述(m) RNA翻譯的多肽的產生。
[0081] 術語"控制序列"在本文中被定義為包括mRNA和/或多肽在體外或者宿主細胞內表 達所需或者對所述表達有利的所有組件。每一控制序列對于編碼多肽的核酸序列來說可為 天然的或外源的。此類控制序列包括但不限于：前導序列、夏因-達爾加諾序列（Shine-Del garno sequence) 、 最佳的 翻譯起始序列 （如在Kozak ,1991 ，J.Biol. Chem. 266:19867-19870中所描述的）、多聚腺苷酸化序列、肽原序列、前肽原序列、啟動子、信號序列，以及轉 錄終止子。用于優化表達的信號序列描述于W02010/121933中。控制序列至少包括啟動子， 以及轉錄終止信號和翻譯終止信號。控制序列可經優化以用于其特定目的。在本發明中使 用的優選的經優化控制序列是在W02006/077258中描述的那些，其以引用方式并入本文。 [0082] 一個或多個控制序列可為在Leucosporidium(例如，ISP從其中初始分離的 Leucosporidium)并非天然存在的控制序列。
[0083] 控制序列可具有接頭以引入特定的限制性位點，從而促進控制序列與編碼多肽的 核酸序列的編碼區的連接。
[0084] 控制序列可為合適的啟動子序列（啟動子）。術語"啟動子"在本文中定義為結合 RNA聚合酶并且指引所述聚合酶到編碼ISP的核酸序列的正確下游轉錄起始位點的DNA序 列。RNA聚合酶有效地催化與編碼區的合適DNA鏈互補的信使RNA的組裝。術語"啟動子"還將 被理解為包含：用于在轉錄到mRNA后進行翻譯的5 '非編碼區（在啟動子和翻譯起始之間）， 順式作用轉錄控制元件如增強子，以及能夠與轉錄因子相互作用的其它核苷酸序列。
[0085] 本發明的核酸構建體可為這樣的核酸構建體，其中控制序列包含與編碼ISP的核 酸并非天然相關聯的啟動子。
[0086] 啟動子可為適用于絲狀真菌宿主細胞的任何合適的啟動子序列，其表現出轉錄活 性，包括突變、截短和雜合啟動子，并且可從編碼與絲狀真菌宿主細胞同源(天然的）或者異 源的（外源的)胞外或者胞內多肽的多核苷酸獲得。啟動子可為組成型啟動子或者誘導型啟 動子。
[0087] 啟動子可為誘導型啟動子。啟動子可為碳水化合物誘導型啟動子。可使用的碳水 化合物誘導型啟動子為淀粉、纖維素、半纖維素(諸如木聚糖和/或木糖誘導型）啟動子。另 一些誘導型啟動子是銅誘導型啟動子、油酸誘導型啟動子。適用于絲狀真菌的啟動子是可 選自以下組的啟動子，包括但不限于：從編碼以下的多核苷酸獲得的啟動子:A. 〇ryZae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸穩定 α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖內切酶 (xlnA)或者β-木糖酶(xlnd)、T.reesei纖維二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂酶、A. oryzae 堿性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖異構酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡 糖苷酶（WO 00/56900)、Fusarium venenatum Daria(W0 00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(W0 00/56900)、Fusarium oxysporum 膜蛋白酶樣蛋白酶（WO 96/00787)、 Trichoderma reeseiP-葡糖苷酶、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶I、Trichoderma reesei纖維二糖水解酶II、Trichoderma reesei葡聚糖內切酶I、Trichoderma reesei葡聚 糖內切酶II、Trichoderma reesei葡聚糖內切酶III、Trichoderma reesei葡聚糖內切酶 IV、Trichoderma reesei葡聚糖內切酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II、Trichoderma reeseiP-木糖酶，以及NA2_tpi啟動子（來源于編碼 A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖異構酶的多核苷酸的啟動子的雜合體），及其突 變、截短和雜合啟動子。啟動子的另一些示例是在W02006/092396和W02005/100573中描述 的啟動子，它們以引用方式并入本文。啟動子的使用的再一些示例描述于W02008/098933和 PCT/EP2-13/062490中。啟動子還可為組成型啟動子。
[0088] 控制序列還可為合適的轉錄終止子(終止子)序列，即藉由絲狀真菌細胞識別以終 止轉錄的序列。終止子序列有效連接至編碼多肽的核酸序列的3'末端。在本發明中可使用 在所述細胞中有功能的任意終止子。本領域中的技術人員已知何種類型的終止子可用于如 本文所描述的微生物宿主細胞。
[0089] 用于絲狀真菌細胞的優選終止子序列是從絲狀真菌基因的任意終止子序列獲得 的，更優選地來自Aspergillus基因，甚至更優選地來自A.oryzaeTAKA淀粉酶的基因，編碼 A.niger葡糖淀粉酶(glaA)的基因，編碼A.nidulans氨基苯甲酸合酶的基因、編碼A.niger α_葡糖苷酶的基因，編碼trpC和/或Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶的基因。
[0090] 控制序列還可為最佳的翻譯起始序列（如在Kozak，1991，J.Biol.Chem.266: 19867-19870中所描述），或者5'非翻譯序列，其為對通過絲狀真菌宿主細胞進行翻譯來說 重要的mRNA的非翻譯區域。翻譯起始序列或者5'非翻譯序列有效連接至編碼多肽的編碼序 列的5'末端。每一控制序列可為對于編碼多肽的核酸序列天然或外源的。控制序列可經優 化以用于其特定目的。
[0091] 合適的5'非翻譯序列可為在真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因之前，在A.oryzae TAKA 淀粉酶和Aspergillus磷酸丙糖異構酶基因之前，以及在A.niger葡糖淀粉酶glaA、a-淀粉 酶、木聚糖酶和植酸酶編碼基因之前的那些多核苷酸。
[0092] 控制序列還可為對通過絲狀真菌宿主細胞翻譯來說重要的mRNA的非翻譯區域。
[0093] 前導區（或者信號)序列可有效連接至編碼多肽的核酸序列的5'末端。在本發明中 可使用在所述細胞中有功能的任意前導區。前導序列可為來源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基 因 （glaA--18個氨基酸和24個氨基酸兩個版本，例如來源于Aspergillus)，α-因子基因 (酵母，例如Saccharomyces和 Kluyveromyces)或者α-淀粉酶（amyE、amyQ 和 amyL)和喊性蛋 白酶aprE以及中性蛋白酶基因（Bacillus)的那些，或者如在W02010/121933中所描述的信 號序列。
[0094] 用于絲狀真菌細胞的優選前導區（或者信號序列）是從在A.oryzaeTAKA淀粉酶和 A.niger glaA以及植酸酶之前的多核苷酸獲得的。
[0095] 另一些控制序列可從Penicillium IPNS基因或者pcbC基因、β微管蛋白基因中分 離。在W0 01/21779中提及的所有控制序列由此以引用方式并入本文。
[0096] 控制序列還可為多聚腺苷酸化序列，其為有效連接至核酸序列的3'末端并且當轉 錄時被微生物宿主細胞(突變體或親本)識別為添加多聚腺苷酸殘基到經轉錄mRNA中的信 號的序列。在本發明中可使用在所述細胞中有功能的任意多聚腺苷酸化序列。
[0097] 用于絲狀真菌細胞的優選多聚腺苷酸化序列是從編碼A.oryzae TAKA淀粉酶、 A.niger葡糖淀粉酶、A.nidulans氨基苯甲酸合酶、Fusarium oxysporum胰蛋白酶樣蛋白酶 以及A.nigera-葡糖苷酶的多核苷酸獲得的。
[0098] 為了促進表達，編碼ISP的核酸序列可為合成的多核苷酸。合成的多核苷酸可在密 碼子使用方面經過優化，優選地根據在W02006/077258和/或PCT/EP2007/055943(公開為 TO2008/000632)中描述的方法，它們以引用方式并入本文。PCT/EP2007/055943提出了密碼 子對優化。密碼子對優化是其中編碼多肽的核苷酸序列已經在其密碼子使用方面，尤其是 在所使用的密碼子對方面經修飾以獲得編碼ISP的核苷酸序列的改善表達和/或所編碼ISP 的改善生產的方法。密碼子對被定義為編碼序列中的一組兩個連續三聯體(密碼子）。
[0099] 因此，本發明的核酸構建體可為其中編碼ISP的核酸為經密碼子對優化以用于絲 狀真菌宿主細胞中表達的核酸構建體。
[0100] 為了促進ISP的表達和/或翻譯，編碼ISP的核酸序列可包含在表達載體中，以使得 編碼ISP的基因有效連接至合適的控制序列，以用于體外或者在絲狀真菌宿主細胞中表達 和/或翻譯。也就是說，本發明提供包含本發明的核酸構建體的表達載體。
[0101] 表達載體可為任意載體(例如，質粒或者病毒），其可便利地經受重組DNA程序并且 可導致編碼多肽的多核苷酸的表達。載體的選擇將通常取決于載體與載體將引入其中的細 胞的相容性。載體可為線性或者閉環質粒。載體可為自主復制載體，即，作為染色體外的實 體存在，其復制不依賴于染色體復制的載體，例如質粒、染色體外元件、微小染色體，或者人 工染色體。自主保持的克隆載體可包含AMA1序列（參見例如Aleksenko和Clutterbuck (1997),Fungal Genet.Biol.21:373-397)〇
[0102] 或者，載體可為當引入絲狀真菌宿主細胞中時，整合到基因組中并與其已經整合 至其中的染色體一起復制的載體。整合型克隆載體可整合于宿主細胞的染色體中的隨機或 者預定靶基因座處。在本發明的一個優選實施方案中，整合型克隆載體包含與宿主細胞的 基因組中的預定靶基因座中的DNA序列同源的DNA片段，以用于將克隆載體靶向整合至此預 定基因座。為了促進靶向整合，克隆載體優選地在細胞轉化之前為線性化的。線性化優選地 執行以使得克隆載體的至少一端但是優選地任一端側接與靶基因座同源的序列。側接靶基 因座的同源序列的長度優選地為至少30bp，優選地至少50bp，優選地至少O.lkb，甚至優選 地至少0.2kb，更優選地至少0.5kb，甚至更優選地至少lkb，最優選地至少2kb。優選地，靶向 整合到絲狀真菌宿主細胞的基因組中（即，整合于預定靶基因座中）的效率是隨著宿主細胞 的同源重組能力的增大而增大的。
[0103] 優選地，克隆載體中同源側接的DNA序列是與靶基因座同源的，其來源于高度表達 的基因座，意味它們來源于能夠在宿主細胞中以高水平表達的基因。能夠高水平表達的基 因，即高度表達基因，在本文中被定義為在例如誘導條件下，其mRNA可構成總細胞mRNA的至 少0.5 % (w/w)的基因，或者，其基因產物可構成總細胞蛋白質的至少1 % (w/w)的基因，或 者，在分泌基因產物的情況下，其可分泌達到至少ο. lg/1的水平(如在EP357 127B1中所描 述的）。
[0104] 給出了大量優選高度表達的真菌基因，例如：來源于Aspergilli、Chrysosporium 或Trichoderma的淀粉酶基因、葡糖淀粉酶基因、醇脫氫酶基因、木聚糖酶基因、甘油醛磷酸 脫氫酶基因，或者纖維二糖水解酶(cbh)基因。出于這些目的，最優選的高度表達基因為葡 糖淀粉酶基因，優選地A.niger葡糖淀粉酶基因、A.oryzae TAKA淀粉酶基因、A.nidulans gpdA基因 、Trichoderma reesei cbh基因，優選地cbhl，Chrysosporium lucknowense cbh 基因，或者來源于P.chrysogenum的cbh基因。
[0105] 可將本發明的核酸構建體的多于一個的拷貝插入絲狀真菌宿主細胞中以增加由 包含在所述核酸構建體中的核酸序列編碼的ISP的產生(過表達）。這可通過以下方式完成： 優選地通過整合到所述DNA序列的其基因組拷貝中，更優選地通過將所述DNA序列靶向整合 于在先前段落中所定義的高度表達基因座之一處。或者，這可通過包含與核酸序列一起的 可擴增選擇性標記基因來進行，當細胞含有經擴增拷貝的選擇性標記基因從而含有額外拷 貝的所述核酸序列時，可以通過在合適選擇性試劑的存在下培養細胞來進行選擇。為了增 加待過表達的DNA序列的甚至更多的拷貝數，可使用如在W098/46772中描述的基因轉換技 術。
[0106] 載體系統可為單一載體或質粒，或者兩種或更多種載體或質粒，所述載體或者質 粒合起來含有待引入宿主細胞的基因組中的總DNA，或者轉座子。
[0107] 載體優選地含有一種或多種選擇性標記，所述選擇性標記允許容易地選擇轉化細 胞。選擇性標記是一種基因，其產物提供了殺生物劑抗性或者病毒抗性、重金屬抗性，使得 原養型轉化為營養缺陷型，等等。選擇性標記可在為表達盒的表達載體上引入細胞中，或者 可在單獨的表達載體上引入細胞中。
[0108] 用于絲狀真菌細胞的選擇性標記可選自以下組:包括但不限于:amdS(乙酰胺酶）、 argB(鳥氨酸氨甲酰基轉移酶）、bar(草胺膦乙酰轉移酶）、bleA(腐草霉素結合酶）、hygB(潮 霉素磷酸轉移酶）、niaD(硝酸還原酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺苷酰 轉移酶）、NAT或者NTC(諾爾絲菌素)和trpC(氨基苯甲酸合酶），以及來源于其它物種的等同 物。用于Aspergi 1 lus和Penicil 1 ium細胞中的優選為amdS(參見例如EP 635574 B1、 EP0758020A2、EP1799821A2、W0 97/06261A2)，和A.nidulans或A.oryzae的pyrG基因，以及 Streptomyces hygroscopicus的bar基因。更優選地使用amdS基因，甚至更優選地使用來自 八.11丨(11113118或4.11丨861'的3111(13基因。一個最優選的選擇性標記基因是融合至A.nidulans gpdA啟動子的A.nidulans amdS編碼序列（參見EP 635574 B1)。另一些優選的AmdS標記是 在W02006/040358中描述的那些。還可以使用來源于其它絲狀真菌的AmdS基因（W0 97/ 06261)。
[0109] 優選地，在引入表達構建體之后從經轉化的絲狀真菌宿主細胞中使任何選擇標記 缺失，以便獲得不含選擇標記基因、能夠產生ISP的經轉化宿主細胞。
[0110]用于連接如上所述的元件以構建本發明的表達載體的程序是本領域中的技術人 員熟知的（參見例如，Sambrook&Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3 版，CSHL Press，Cold Spring Harbor, NY, 2001;和 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley InterScience，NY,1995)〇
[ΟΙ11 ]此外，標準分子克隆技術如DNA分離、凝膠電泳、核酸的酶限制性修飾、Southern分 析、細胞轉化等是本領域中的技術人員已知的并且例如由Sambrook等（1989) "Molecular Cloning:a laboratory manual^,Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor ,New York和Innis等（1990)〃PCR protocols,a guide to methods and applications〃Academic Press，San Diego描述。
[0112] 適用于本發明的核酸可根據標準PCR擴增技術，使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作 為模板和合適的寡核苷酸引物來擴增。如此擴增的核酸可克隆到合適的載體中并且通過 DNA序列分析來表征。
[0113] 優選地，靶向整合到宿主細胞的基因組中（即，整合到預定靶基因座中）的效率隨 著宿主細胞的同源重組能力的增大而增大。細胞的此類表型優選地涉及如在W02005/ 095624中描述的缺陷hdfA或者hdfBc3W02005/095624公開了一種用于獲得包含增大效率的 靶向整合的絲狀真菌細胞的優選方法。
[0114] 本發明由此提供了包含本發明的核酸構建體或者表達載體的絲狀真菌宿主細胞。
[0115] 絲狀真菌宿主細胞可為Eumycota和Oomycota亞門的任意絲狀形式細胞（如 Hawksworth等人在Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK中所定義的）D絲狀真菌的特征為菌絲壁 由幾丁質、纖維素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖，以及其它復合多糖構成。營養生長通過菌絲 伸長而進行并且碳代謝是專性需氧的。
[0?16] 絲狀真菌宿主細胞可為Trichocomaceae類的任意絲狀形式的細胞（如Houbraken 和Samson在Studies in Mycology 70:1-51.2011中所定義的）D在另一個優選實施方案中， 絲狀真菌宿主細胞可為Aspergillaceae、Thermoascaceae和Trichocomaceae三個科中任意 一個科的任意絲狀形式的細胞，它們適應Trichocomaceae分類 D合適的絲狀真菌宿主細胞 可為在Houbraken和Samson，2011(同上）中的圖1中所描述的分支2: Aspergillus中的那些。
[0117] 適用于本發明的合適的絲狀真菌宿主細胞包括但不限于以下的細胞： Acremonium、Agaricus、Aspergillus、Aureobasidium、Chrysosporium、Coprinus、 Cryptococcus、Filibasidium、Fusarium、Humicola、Magnaporthe、Mucor、Myceliophthora、 Neocallimastix、Neurospora、Paecilomyces、Penicillium、Piromyces、Panerochaete、 Pleurotus、Schizophy1lum、Talaromyces、Rasamsonia、Thermoascus、Thielavia、 Tolypocladium^PTrichoderma〇
[0118] 優選的絲狀真菌細胞屬于以下物種:Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、 Myceliophthora、PeniciIlium、Talaromyces、Rasamsonia、Thielavia、Fusarium或 Trichoderma屬，并且最優選地屬于以下物種：Aspergillus niger、Acremonium alabamense、Aspergi1lus awamori、Aspergillus foetidus、Aspergillus sojae、 Aspergillus fumigatus^Talaromyces emersonii>Rasamsonia emersonii>Aspergillus oryzae、Chrysosporium lucknowense、Fusarium oxysporum、Fusarium venenatum、 Myce1iophthora thermophila、Trichoderma reesei、Thielavia terrestris或 Penicillium chrysogenunu更優選的宿主細胞屬于Aspergillus屬，更優選地宿主細胞屬 于Aspergillus niger物種。當根據本發明的宿主細胞是Aspergillus niger宿主細胞時， 所述宿主細胞優選地是CBS 513.88、CBS124.903,或其衍生株。
[0119] 公眾可從大量菌種保藏單位輕易獲得若干絲狀真菌菌株，所述菌種保藏單位為諸 如：美國模式培養物保藏所(ATCC)、德國布朗施維格的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSM)、皇家科學院真菌生物多 樣性研究中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)、美國北方農業研究所培養 物保藏中心（Agricultural Research Service Patent Culture Col lection, Nor them Regional Research Center，NRRL)，以及俄國莫斯科的俄羅斯科學院的全俄羅斯微生物保 藏中心（俄文縮寫為VKM，英文縮寫為RCM)。可用于本發明的情形中的菌株可為： Aspergillus niger CBS 513.88、CBS124.903、Aspergillus oryzae ATCC 20423、IF0 4177、ATCC 1011、CBS205.89、ATCC 9576、ATCC14488-14491、ATCC 11601、ATCC12892、 P· chrysogenum CBS 455 ·95、P· chrysogenum威斯康星54-1255(ATCC28089)、PeniciIlium citrinum ATCC 38065、Penici11ium chrysogenum P2、Rasamsonia emersoni i ATCC16479、CBS393.64、IF031232、IMI116815、Thielavia terrestris NRRL8126、 Talaromyces emersonii CBS 124.902、Acremonium chrysogenum ATCC 36225或ATCC 48272、Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921'Aspergillus sojae ATCC11906、Myceliophthora thermophila Cl、Garg 27K、VKM_F 3500 D、Chrysosporium lucknowense Cl、Garg 27K、VKM-F 3500 D、ATCC44006,以及它們的衍生株。
[0120] 優選的絲狀真菌宿主細胞如A.niger宿主細胞，例如可含有一個、多個或所有以下 修飾:非核糖體肽合酶缺陷，優選地非核糖體肽合酶npsE缺陷（參見W02012/001169)，pepA 缺陷，葡糖淀粉酶（glaA)缺陷，酸穩定的α-淀粉酶(amyA)缺陷，中性α-淀粉酶(amyBI和 amyBII)缺陷，草酸水解酶(oahA)缺陷，一種或多種毒素缺陷，優選地赭曲毒素和/或伏馬菌 素，prtT缺陷，hdfA缺陷，包含為S376W突變的SEC 61修飾，其中用色氨酸取代絲氨酸376和/ 或包含改變的擴增子，如在W02005/123763和/或W02011/009700中所定義的。這些和其它可 行的宿主修飾還描述于 W02012/001169、W02011/009700、W02007/062936、W02006/040312S 恥2004/070022、恥2013/135729、恥2014/013074、恥2014/013073中。
[0121] 本領域中的技術人員知曉如何用本發明的一種或多種核酸構建體或者表達載體 來轉化細胞。
[0122] 絲狀真菌宿主細胞的轉化可通過任何適當已知的方法來進行，包括例如電穿孔方 法、粒子轟擊或者微粒轟擊、原生質體法和農桿菌(Agrobacterium)介導轉化(AMT)。用于轉 化的程序由 J · R · S · Fincham，Transformat ion in fungi . 1989,Microbiological reviews · 53,148-170 中描述。
[0123] 轉化可涉及由以下組成的過程：原生質體形成，原生質體轉化，以及細胞壁再生， 以本來已知的方式。用于Aspergillus細胞轉化的合適程序描述于EP 238 023和Yelton等 人，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470-1474中。用 于使用Agrobacterium tumefaciens轉化Aspergillus和其它絲狀真菌宿主細胞的合適程 序描述于例如De Groot等人，Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi.Nat Biotechnol.1998,16:839-842中。勘誤發表于Nat Biotechnol 1998 16:1074。用于轉化Fusarium物種的合適方法由Malardier等，1989,Gene 78:147156 或者在W0 96/00787中描述。可應用的另一些方法例如使用基因槍轉化的方法，如在 Christiansen等，Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus，Erysiphe graminis f.sp.hordei.l995，Curr Genet.29:100_102中所描述的。
[0124] 本發明還提供了一種用于產生冰結構蛋白質（ISP)的方法，所述方法包括：
[0125] a.提供絲狀真菌宿主細胞，所述絲狀真菌宿主細胞包含編碼ISP的核酸序列，所述 ISP包含SEQ ID NO: 1中示出的序列或者與其至少80%同一的序列，或者包含SEQ ID NO: 1 的第21至261位氨基酸中示出的序列或者與其至少80%同一的序列，
[0126] 其中所述核酸序列有效連接至控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在絲狀 真菌宿主細胞中表達；
[0127] b.將絲狀真菌宿主細胞在適合于產生冰結構蛋白質的條件下培養;以及任選地
[0128] c.回收冰結構蛋白質。
[0129] 通常，ISP是例如在培養步驟期間從宿主細胞中分泌出來的。
[0130] 在步驟a.中，突變微生物宿主細胞可為如本文所描述的本發明的絲狀真菌宿主細 胞。
[0131] 在步驟b.中，步驟a.的絲狀真菌宿主細胞是在有助于ISP表達的條件下培養的。突 變微生物細胞是使用本領域中已知的方法在適用于產生ISP的營養培養基中培養的。例如， 細胞可通過搖瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連續發酵、分批發酵、補料分批發酵，或者 固態發酵），在合適培養基中并且在允許ISP產生和/或分離的條件下運行的實驗室或者工 業發酵罐中培養。培養使用本領域中已知的程序，在包含碳和氮源以及無機鹽的合適營養 培養基中發生（參見例如，Bennett, J.W.和 LaSure，L·，編，More Gene Manipulations in Fungi，Academic Press，CA, 1991)。合適的培養基可從商業供應商商購獲得或者可使用公 開的組合物(例如，在美國模式培養物保藏所的目錄中）制備。
[0132] 如果ISP分泌到營養培養基中，則ISP可從培養基中直接分離。如果ISP未分泌，則 其可從細胞裂解液中分離。
[0133] 在步驟c.中，可任選地分離ISP。ISP可通過本領域中已知的方法分離。例如，ISP可 通過常規程序從營養培養基分離，所述常規程序包括但不限于離心分離、過濾、提取、噴霧 干燥、蒸發，或者沉淀。然后可將分離的ISP通過本領域中已知的多種程序進一步純化，所述 程序包括但不限于層析法（例如，離子交換、親和層析、疏水層析、聚焦層析，以及尺寸排 阻）、電泳程序（例如，制備式等電聚焦）、差異溶解(例如，硫酸銨沉淀），或者提取(參見例 如，Protein Purification，J.-C.Janson和Lars Ryden,編VCH Publishers,New York, 1989)。在一些應用中，ISP可在基本上不從培養液中分離的情況下使用;培養基與生物質分 離可為足夠的。
[0134] 在本發明的方法中，ISP的生產率可為至少lg/L、至少2g/L、至少5g/L，諸如10g/L 或者更高。
[0135] 本發明還提供了一種通過如本文所描述的本發明方法能夠獲得的冰結構蛋白質。
[0136] 本發明還提供了冰結構蛋白質，所述冰結構蛋白質包含在SEQ ID NO: 1中示出的 序列或者與其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出 的序列或者與其至少80%同一的序列，其中：
[0137] 至少一個氨基酸是經修飾的氨基酸，例如包含在其N末端的焦谷氨酸修飾；
[0138] 至少一個氨基酸是0-甘露糖基化的，例如包含一個、兩個、三個、四個或者更多個 〇-甘露糖基化；
[0139] 蛋白質具有不同于2GlcNac和2個己糖單元的糖基化模式，例如2GlcNac和三個、四 個、五個、六個、七個、八個、九個、十個或者更多個己糖單元;或者
[0140] 所述蛋白質在C末端缺失 VVQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和KRSNARQWL。
[0141] 也就是說，所述蛋白質可具有相對于SEQ ID N0:1中示出的蛋白質，在C末端的一 個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個、十一個或者十二個或者更多個氨 基酸截短。
[0142] 在此類冰結構蛋白質中，經修飾的氨基酸可為焦谷氨酸，任選地存在于蛋白質的N 末端（即，在對應于SEQ ID NO: 1中的第21位氨基酸的氨基酸處）。
[0143] 本發明的冰結構蛋白質可包含2個N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和10個己糖(Hex)單元。 本發明的冰結構蛋白質可在對應于參照SEQ_ID NO: 1的S80和/或T84的位置處被0-甘露糖 基化。最豐富形式的AFP19含有一個0-甘露糖基團。
[0144] 本發明的ISP可包含在SEQ ID NO: 1中示出的氨基酸序列或者與其至少85%、至少 90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261 位氨基酸中示出的序列或者與其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同 一的序列。
[0145] 例如可通過本發明的方法獲得的本發明的ISP可在食物組合物制備中使用。因此， 本發明提供包含例如可通過本發明的方法獲得的本發明的ISP的食物組合物。
[0146] 優選的食物組合物是冷凍糖食產品，諸如冰淇淋、冷凍酸奶、速凍點心、雪糕、冰 糕、冰乳、乳凍、冰棍、格蘭尼它冰糕和冷凍果泥、軟雪糕、冰鎮飲料(frappg)、雪泥、思慕雪、 刨冰、雪花冰、半凍冰糕、奶昔或者意式冰激凌。
[0147] ISP的水平可為以最終組合物的重量計從0.00001 %至0.5%。
[0148] 本發明的食物組合物，諸如冷凍糖食產品，所述冷凍糖食中固體(例如，糖、脂肪、 調味劑等等）的水平可以重量計大于4%，例如以重量計大于20%，諸如從20%至60%，例如 以最終組合物的重量計30 %至45 %。
[0149] 在冰淇淋組合物的情況下，例如，示例性成分和其量如下：
[0150] 水可為以組合物的重量計從40%至80%。
[0151] 甜味劑可為以所述組合物的重量計5%-30%，10%-25%，或者15%-20%。低熱量 甜味劑諸如三氯蔗糖、糖精或者阿斯巴甜可用作甜味劑，也可使用一種或多種糖。術語糖包 括單糖、二糖、多糖、糖醇，或者它們的混合物，單糖是通式為C nH2n〇n的化合物，其中η = 3-7， 并且二糖是任意兩種相同或者不同單糖的縮合產物。合適的單糖包括葡萄糖和果糖。合適 的二糖是蔗糖。甜味劑還包括玉米糖漿(也被稱為葡萄糖漿），其為單糖、二糖和高級糖類以 及糖醇的混合物。
[0152] 乳固體可為以組合物的重量計5%至40%。乳固體包括非脂乳固體(乳糖、乳蛋白 和礦物質）和乳脂肪（也被稱為乳脂）。乳固體可以組合物的重量計至少10%，諸如至少 15%，例如20%的量存在。所述組合物可包含至多35%，至多30%或者至多25%的乳固體。 乳固體可以奶粉形式加入組合物中。或者，可將鮮奶或者巴氏滅菌牛奶加入組合物中以提 供必需量的乳固體。
[0153] 冰淇淋組合物可包含脂肪。在這種情況下，脂肪以組合物的重量計可為2%_20%， 4%-18%，或者6%-16%。脂肪可為植物性脂肪和/或乳脂肪。
[0154] 冰淇淋組合物可包含1 %-10%，諸如2%-9%，例如3%-8%的蛋白質。蛋白質可為 小麥蛋白、大豆蛋白，或者乳蛋白。
[0155] 冰淇淋組合物可包含其它任選的成分，包括調味劑、水果/蔬菜，以及巧克力。
[0156] 本發明的ISP可與一種或多種食物成分組合以便制備本發明的食物組合物。也就 是說，本發明提供一種用于制備食物組合物的方法，所述方法包括:將本發明的冰結構蛋白 質與一種或多種食物成分組合，從而制備食物組合物。
[0157] 根據本發明的冷凍糖食產品可用適用于生產冷凍糖食品的任意方法生產。通常， 組合物的所有成分在冷凍工藝開始之前充分混合。冷凍工藝可有利地涉及硬化步驟，例如 硬化至_30°C或更低的溫度。
[0158] 本發明還提供了本發明的冰結構蛋白質在食物組合物中的用途。.
[0159] 在本文中對專利文獻或者作為現有技術給出的其它事物的引用不應被視為承認 文獻或事物為在權利要求書中任一項的優先權日時為已知的或者其所含有的信息在權利 要求書中任一項的優先權日時為公知常識的部分。
[0160] 本文提出的每一參考文獻的公開內容以引用方式整體并入本文。
[0161] 本發明通過以下實施例進一步說明： 實施例
[0162] 實施例1:AFP19基因的克隆和表達
[0163] Leucosporidium的ISP(AFP19)的蛋白質序列是根據公開的基因序列推定的并且 在SEQ ID N0:1中示出。此序列由用于在Leucosporidium中有效分泌的20個氨基酸的信號 序列和推定的241個氨基酸的成熟蛋白質序列組成。
[0164]用于使此蛋白質在Aspergillus niger中表達的密碼子適應的DNA序列被設計為 含有附加的限制性位點以用于在Aspergi 1 lus表達載體中亞克隆。密碼子適應是如W02008/ 000632中描述地執行的。編碼SEQIDN0:1的ISP蛋白的基因的DNA序列在SEQIDN0:2中示 出。
[0165] 葡糖淀粉酶glaA啟動子的翻譯起始序列已經修飾成5'-CACCGTCAAA ATG-3'并且 在表達構建體的產生中使用最優的翻譯終止序列5'-TAAA-3'（如W02006/077258所詳述）。 將含有葡糖淀粉酶啟動子的部分和ISP編碼基因等的DNA片段(SEQ ID N0:3)完全合成，純 化，并且用EcoRI和PacI消化。pGBT0P-16載體（圖1)通過EcoRI/PacI消化而線性化，并且隨 后將線性化的載體片段通過凝膠提取純化。將DNA片段克隆到pGBT0P-16載體中，并且將所 得載體命名為PGBT0PAFP-19。隨后，用此pGBT0PAFP-19載體，按照使用pGBAAS-4的共轉化方 案，使用在W0 2011/009700和其中的參考文獻中所描述的菌株和方法來轉化A.niger GBA 306,并且在含乙酰胺的培養基上選擇，以及根據標準程序進行菌落純化。A.niger GBA306 最終來源于CBS124.903(保藏在荷蘭真菌培養物保藏中心，荷蘭烏得勒支）。轉化和選擇是 如W0 98/46772和W0 99/32617中所描述地執行的。使用特異于AFP19基因的引物，通過PCR 選擇含有AFP19基因的菌株，以驗證pGBT0PAFP-19表達盒的存在。選擇單一轉化體，將其命 名為AFP19-3,并進一步影印培養(replicaplated)以獲得單一菌株接種體。
[0166] 實施例2:AFP19在Aspergillus niger中的發酉孝和純化
[0167] 制備新鮮的A.niger AFP19-3芽孢。向含有100ml發酵培養基l(10%W/v的玉米浸 漬固體，1 %w/v 的葡萄糖·Η2〇,0· 1 %w/v 的 NaH2P〇4.H2〇,0.05%w/v 的 MgSCU. 7H2〇,0.025%w/ v的Basildon，pH 5.8)、具有擋板的4個50〇1111搖瓶中接種107個芽孢。將這些預培養物在34 °C下和170rpm下孵育16-24小時。從所述預培養物中取50ml用于接種到含有1升發酵培養基 2( 15%w/v麥芽糖，6%w/v細菌大豆蛋白胨，1 · 5%w/v(NH4)2S〇4,0 · 1 %w/v NaH2P〇4.H2〇， 0.1%w/v MgS〇4.7H2〇,0.1%w/v L-精氨酸，8%〇w/v Tween_80,2%〇w/v Basildon，2%w/v MES，pH 5.1)的4個5升大小的搖瓶中并且在34°C和170rpm下振蕩培養。培養四天后，通過添 加3.5g/l的苯甲酸鈉并在30°C下保持六小時來進行細胞滅活。隨后，將10g/l CaC12和45g/ 1珍珠巖C25加入培養液中。使用濾布和過濾器DE60/EKS P和K250(Pall)進行一步過濾。將 殘留在過濾器中的濾餅用1.1L的無菌milliQ水沖洗。然后使用0.22m GP Express PLUS膜 (Mi 11 ipore)進行無菌過濾。在Pel 1 icon 2"迷你"超濾系統上使用Biomax5k盒(Mi 11 ipore) 進行超濾，并用50mM pH 5.6的乙酸鈉沖洗。在所有步驟中純化樣品的蛋白質組合物是用4-12%SDS-PAGE控制的并且發現其為>90%的純AFP19。通過測量A260/A280來在所有步驟中 控制蛋白質濃度。所述濃度是根據公式c(mg/ml) = (1.55*A280)-(0.76*A260)確定的。最終 獲得蛋白質濃度為30.8mg/ml的150ml樣品，這指示AFP19的生產率為>lg/kg發酵液。將最終 制品凍干并且在使用前一直貯藏在_20°C下。
[0168] 實施例3:AFP19基因在Aspergillus oryzae中的表達和發酉孝
[0169] 將Aspergillus oryzae菌株CBS205.89(保藏在荷蘭真菌培養物保藏中心，荷蘭烏 得勒支，并且為公開可得的）用作宿主，并且將在實施例1中描述的環狀載體pGBTOPAFP-19 載體和pGBAAS-4按照共轉化方案使用。如W0 98/46772和W0 99/32617中所描述地進行轉 化，并且在含有乙酰胺、添加有20mM氯化銫的培養基上進行選擇。根據標準程序純化菌落。 使用特異于AFP 19基因的引物，通過PCR選擇含有AFP 19基因的菌株，以驗證pGBTOPAFP-19表 達盒的存在。選擇單一轉化體，將其命名為AFPao-7,并進一步影印培養以獲得單一菌株接 種體。作為對照，用質粒pGBT0P-16代替pGBT0AFP-19轉化Aspergillus oryzae菌株，并且通 過影印培養來獲得單一菌株接種體。如實施例2中所描述地制備和培養新鮮的A. oryzae AFPao-7芽胞。在30°C和170rpm在搖瓶中培養72小時。通過離心收獲上清液并且在進一步分 析之前將其一直貯藏在-20 °C下。
[0170] 使用上清液的SDS-PAGE分析來確定由Aspergillus oryzae AFPao-7產生的AFP19 蛋白質的濃度，并與來自實施例2的來源于Aspergillus niger的相對較純的AFP19的連續 稀釋液進行比較。在相同凝膠上平行分析缺乏AFP19基因的對照菌株的培養上清液。在用考 馬斯亮藍染色凝膠之后，定量分析染色并且將其與來源于A.niger的AFP19的連續稀釋液進 行比較。由Aspergillus oryzae產生的AFP19的量估計為0.4g/l，明顯大于在搖瓶中于 Pichia pastoris內產生的61.2mg/l的LeIBP(Park等人，2012年，同上）。此量是通過在推定 對照菌株上清液的染色強度后使用布拉德福(Bradford)蛋白染色法測量上清液中的總蛋 白濃度來確認的。
[0171] 實施例4:對來源于Aspergillus niger的AFP19的分析
[0172] 使用LC-MS/MS進一步鑒定在實施例2中從Aspergillus niger中分離出來的 AFP19。為此，將在實施例2中分離的lmg AFP19蛋白質在100mM NH4HCO3中稀釋至100μg/ml。 為了去糖基化，將1〇〇μ1此溶液在90°C下加熱10分鐘。加入15μ1 PNG酶F(Sigma，lUAU)，然 后在lOOOrpm和37 °C的恒溫混勻儀中孵化4小時。在測量前將1 %甲酸加入樣品中。作為對 照，分析未經處理的AFP19蛋白質。
[0173] 關于LC-MS/MS分析，在Acquity I-class-Synapt G2_S(Waters)上，使用以下參數 來分析樣品：柱:Waters Acquity UPLC BEH300 C4 1·7μπι3〇〇Α孔徑，2.1X50mm柱。柱溫： 75°C。注入體積:5μ1。流動相A: 0.1 %的甲酸水溶液。流動相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通過 改變相A和B來施加梯度至柱，從而分離不同形式的AFP19蛋白質。
[0174] MS檢測器設置為:采集質量范圍是500-3500m/z，掃描時間1秒，正ESI，TOF MS分辨 率模式，使用在運行期間即時施加的Leu-Enk進行數據校正。數據頻譜反褶積、電荷態剝離 是用Waters MassLynx MaxEntl軟件工具執行的：輸出質量分辨率=lDa/通道。損傷模型： 高斯型(FWHH=0.750Da;最小強度比= 33%左和右）。迭代至收斂。
[0175] 使用此技術在酶促去糖基化前和后測定AFP19的質量，并且將結果描繪在圖2中。
[0176] 可從這些結果中得出若干結論：
[0177] · PNG酶F處理后最小形式的AFP19的大小為23446Da。此大小小于以SEQ ID N0:1 中描繪的蛋白質序列為基礎所計算的分子量，假設在殘基20之后除去了前序列。這表明在 A.niger中產生的AFP19缺失了部分蛋白質序列。因為所述大小并非恰好與任何氨基酸缺失 的大小符合，因此我們無法排除在A.niger中產生AFP19期間可已經發生的其它修飾。例如 可能AFP19在其N末端含有焦谷氨酸修飾。
[0178] · AFP19在大小上是異質的，甚至在PNG酶F處理后也是如此。在PNG酶F處理之后發 現有四個具有162Da的增量(一個己糖單元的大小）的峰，并且最豐富的形式是23770Da。這 指示在A. n i ger中產生的AFP 19含有附加的糖基化，所述糖基化并未被PNG酶F除去。AFP 19可 以經0-甘露糖基化為每AFP19分子多至4個甘露糖基殘基，其中最豐富的形式具有2個甘露 糖基團。對于在現有技術中研究的不同形式的LelBP尚未檢測到0-甘露糖基化(Lee等人， 2012，Journal of Biological Chemistry 287，11460_11468;Lee等人，2013年，同上）〇
[0179] ?最豐富的N-糖基化形式和最豐富的去糖基化形式之間的大小差異為2026Da，這 指示主要的N-糖基化形式除2個0-甘露糖之外，還含有2個N-乙酰葡糖胺(GlcNac)和10個己 糖(Hex)單元。N-糖基化AFP19和經PNG酶F處理的AFP19之間的最小尺寸差異為892Da，代表2 個GlcNac和3個Hex單元。這個結果指示，在A.niger中產生的所有AFP19形式是相較于在 P.pastoris中產生的LelBP不同地N-糖基化的（并且0-甘露糖基化的），在P.pastoris中產 生的LelBP示出為含有僅2個GlcNac和2個Hex(Bma和Man)單元(Lee等人，2012年）。
[0180] ?通過使用此方法，變得顯見的是，在Aspergillus niger中產生的最豐富形式的 AFP19的分子量是25796Da。此大小不同于通過MALDI-T0F測量的天然LelBP和在E.coli或 P.pastoris中產生的非糖基化和N-糖基化形式兩者的大小(Lee等人，2013年）。
[0181] 這些結果指示，AFP19明顯地不同于在現有技術中研究的不同形式的LelBP。
[0182] 實施例5:對來源于Aspergillus niger和Aspergillus oryzae的AFP19的分析
[0183] 使用LC-MS/MS進一步表征在實施例2 (Aspergillus niger)和實施例3 (Aspergillus oryzae)中分離出來的AFP19。為此，將lmg △??19蛋白質在10〇1111顯411(1)3中 稀釋至100μg/ml。將100μ1此溶液在90°C下加熱10分鐘。在用PNG酶F去糖基化之后，在用 LysC消化之后并且在用AspN消化之后，分析AFP19本身。為了去糖基化，加入15μ1 PNG酶F (Sigma，lUAU)，然后在lOOOrpm和37°C的恒溫混勻儀中孵化16小時。在測量前將1%甲酸加 入樣品中。作為對照，分析未經處理的AFP19蛋白質。
[0184] 關于LC-MS/MS分析，在Acquity I-class-Synapt G2_S(Waters)上，使用以下參數 來分析樣品：柱:Acquity UPLC BEH300C4 1·7μπι3〇〇Α孔徑，2.1X50mm柱(Waters)。柱溫： 75°C。注入體積：ΙμL。流動相A: 0.1 %的蟻酸水溶液。流動相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通過 改變相A和B來施加梯度至柱，從而分離不同形式的AFP19蛋白質。
[0185] MS檢測器設置為:采集質量范圍是500-3500m/z，掃描時間1秒，正ESI，TOF MS分辨 率模式，使用在運行期間即時施加的Leu-Enk進行數據校正。數據頻譜反褶積、電荷態剝離 是用Waters MassLynx MaxEntl軟件工具執行的：輸出質量分辨率=lDa/通道。損傷模型： 高斯型（FWHH=0.750Da;最小強度比=33 %左和右）。迭代至收斂。用MassLynx MaxEnt3軟 件工具針對7個電荷中的最大電荷來執行ETD的數據頻譜反褶積:集合成員的數目：2并且每 集合成員的迭代次數:50。
[0186] 為了消化AFP19,平行使用Lys C和Asp N。分別將20yl(2yg)Lys C或者Asp N加入 至100yl(100yg)AFP19和400yl(100yg)AFP19中。通過在37°C下孵化過夜來執行消化。將樣 品用MilliQ水稀釋兩次并且在LC-MS/MS分析之前將樣品酸化成1%甲酸。經消化的AFP19樣 品的LC-MS/MS分析是在Ultimate RS 3000 Orbitrap Fusion(Thermo Fisher)上使用以下 參數進行的：柱：Zorbax XDB-C18 1.8μπι，2.1 X 50mm;窄孔保護柱2.1 X 12.5mm，5微米， Phoroshel 1 300SB-C3(Agilent)。柱溫：50°C。注入體積：25μ1。流動相A: 0 · 1 % 甲酸水溶液。 流動相B: 0.1 %的甲酸乙腈溶液。通過改變相A和B來施加梯度至所述柱。
[0187] 對照AFP19序列檢索數據(FDR 0· 1 % )。在Proteome Discoverer 1.4· 1 · 14上執行 數據庫檢索。
[0188] PNG酶F去糖基化前和后完整AFP19的反褶積質譜示出于圖3中。
[0189] 這些數據顯示，在A.niger中表達的AFP19在氨基末端具有焦谷氨酸。此觀測結果 通過對完整酶的電子轉移解離(ETD)以及通過在AFP19的LysC消化之后鑒定N末端肽來確 認。焦谷氨酸可對酶穩定性起重要作用并且尚未在關于LelBP的先前文獻中描述(Lee等人， 2012年，同上；Lee等人，2013年，同上）。
[0190] 完整AFP19在去糖基化前后的LC-MS數據的比較顯示:主要的N糖基化形式含有2個 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和10個己糖(Hex)單元，如圖3中所指示。去糖基化的AFP19顯示出 162Da的質量增量，從而指示緊接著N-糖基化，酶也經0-甘露糖基化了。這些發現通過AFP19 的AspN消化確認，其中0-甘露糖基化是在SEQ_ID NO: 1中的位置S80和T84上鑒定的。最豐富 形式的AFP19含有一個0-甘露糖基團。除了氨基末端的焦谷氨酸之外，0-甘露糖基化也可對 酶穩定性具有正向作用。同樣，這些發現尚未在關于AFP的先前文獻中描述(Lee等人，2012 年，同上;Lee等人，2013年，同上）。對N-糖基化和0-甘露糖基化的觀測顯示，在本文中描述 的AFP19的糖基化模式明顯不同于天然LelBP或者在Pichia pastoris中產生的LeIBP(Lee 等人，2012年，同上）。
[0191] 關于完整AFP19在去糖基化前后的LC-MS分析進一步顯示，在A.niger中表達的酶 具有C末端截短。所觀測到的質量23444Da、23543Da和23770Da分別對應于在N末端具有焦谷 氨酸且在 C 末端缺失VVQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和 KRSNARQWL 的AFP19。
[0192] 還對在Aspergillus oryzae中表達的AFP19(樣品產生于實施例3中）進行上述實 驗。這些數據確認在A. oryzae中表達也導致AFP在N末端具有焦谷氨酸，并且N-糖基化和0-甘露糖基化模式高度類似于在A.niger中表達的AFP19的N-糖基化和0-甘露糖基化模式。此 外，在我們的樣品中既沒有檢測到來自E. coli的天然LelBP的質量(25565Da)，也沒有檢測 到來自先前報告的P.past〇ris(Lee等人，2013年）的糖基化LelBP的質量（26198Da)和非糖 基化LelBP的質量（25150Da)。
[0193] 實施例6:使用來自Aspergillus niger的AFP進行冰再結晶抑制
[0194] 來源于大洋鯰的III型AFP在30%蔗糖中的RI終點由兩個不同作者報告為>700nM (511^11￥〇〇(1等人，1999年，同上;1'〇11^231^等人，2003年，同上）。1?1終點是低于其就不再能夠 檢測到RI活性的濃度。因為RI終點是用于測定ISP在抑制冰重結晶方面的有效性的重要參 數，我們決定在30 %鹿糖中使用經修改、基本上如在Tomczak等人，2003年，同上中描述的一 樣的激冷板測定(splat assay)來測定AFP 19的RI終點。
[0195] 向30%(w/v)蔗糖溶液補充作為對照的100mg/l乳清蛋白分離物(WPI--墨林斯 (Mul 1 ins)乳清），或者補充根據實施例2制備的來自Aspergillus niger的4000、80和20nM 的八??19。關于此實驗，將231^六?？19溶于4.61111蒸餾水中，并且從此溶液在30%蔗糖溶液中 制備50倍、2500倍、10000倍的稀釋液。
[0196] 將10微升這些溶液用來制備顯微樣品并且安放到裝備有冷凍臺的Zeiss Axiophot顯微鏡上。使用裝備在所述顯微鏡上的CCD攝像機進行成像。放大倍數是6.3倍并 且隨著時間跟蹤樣品中的晶體形成。
[0197] 首先，將所述樣品以每秒90°C的速率冷卻直至-60 °C。在此之后以相同的速率將此 樣品加溫至-6 °C，并且隨著時間跟蹤冰晶形成。在0分鐘、3分鐘、9分鐘和60分鐘之后，攝像 并將所述圖像用于使用Linksys32軟件（Linkam Scientific Instruments)測量平均冰晶 大小。此實驗的結果示出于表1中，表1清楚地顯示AFP19抑制冰再結晶。隨著時間變化未檢 測到冰晶生長，即使當AFP19的濃度僅為20nM時也是如此。然而，具有WPI的對照樣品隨著時 間推移表現出晶體大小的明顯升高。
[0198] 這些結果顯示，在30%蔗糖中，AFP19的RI終點明顯低于20nM。此值比所報道的來 自大洋鯰的III型AFP的RI終點（Tomczak等人，2003年，同上：780nM)要低得多。因此，在抑制 冰再結晶方面，AFP19比當前行業標準的III型HPLC12AFP有效得多。
[0199] 表1:隨著時間推移，冰晶的最小尺寸和最大尺寸(微米)
[0201 ] 實施例7:用來自Aspergillus niger的AFP19生產的冰糕
[0202]冰糕是通過混合100克糖、400ml水和60克檸檬汁生產的。將對照蛋白質(WPI)或者 根據實施例2制備的來源于Aspergillus niger的AFP19以40nM或者400nM加入。冰糕是通過 將此混合物在標準設置下的Gel5桌上式制冰機(CRM/Telme)中以560g批量處理而產生的。 在生產后，將所述冰糕從機器取出并立即以每部分100克冷凍和貯藏在-30°c下達到分析前 所需的天數(最多4周）。
[0203] 實施例8:對用來自Aspergillus niger的AFP19生產的冰糕的感官分析
[0204] 在評定前的15分鐘將部分如在實施例7中描述的冰糕從冰箱中取出并使其在室溫 下溫熱。通過5人組成的專家小組執行感官分析并且評定冰糕的可勺取性(800(^313；[1；^7)、 顏色、口感、風味和整體外觀。所有評定員同意，用根據實施例2制備的來源于Aspergillus niger的AFP19制造的冰糕顯著不同于對照冰糕。發現相較于對照冰糕，AFP19冰糕在外觀上 更白、用勺子挖取時更緊實，并且具有更順滑的口感。未在風味感覺中發現明顯差異。
[0205] 實施例9:用來自Aspergillus niger的AFP19生產的冰糕的融化行為
[0206] 使在實施例6中生產的冰糕在25 °C的控制溫度下在1mm的網篩上融化。收集融化物 并不斷地在天平上測量重量。此實驗的結果可參見圖4。在用根據實施例2制備的來源于 Aspergillus niger的AFP19制造的冰糕和對照冰糕之間觀察到明顯的融化行為差異。用 AFP19制造的冰糕保持冷凍更長的時間段。此效應在40nM AFP19和400nM AFP19兩者均可以 觀測到。
[0207] 實施例10:用來自Aspergillus niger的AFP19生產的冰淇淋
[0208] 冰淇淋是通過混合以下物質生產的： 乳奶油 286g
[0209] 脫脂奶粉 206g 糖 240g
[0210] 葡萄糖漿 80g
[0211] 使用熱水達到總共2kg。
[0212] 通過在設置于95°C下的水浴中加熱30分鐘來對混合物進行巴氏滅菌。將混合物冷 卻并且在4 °C下熟化16h。將混合物均化并過濾，然后分離成各650g的3部分:一個是沒有添 加的對照，一個部分獲得了根據實施例2制備的來源于Aspergillus niger的40nM AFP19， 以及一個部分獲得了根據實施例2制備的來源于Aspergillus niger的400nM AFP19。冰淇 淋是通過將批料在標準設置下的Gel5桌上式制冰機(CRM/Telme)中處理而產生的。在生產 后，將所述冰淇淋從機器取出并立即以每部分100克冷凍和貯藏在_30°C下達到分析前所需 的天數(最多4周）。
[0213] 對使用AFP19生產的冰淇淋的感官分析得到了如針對在實施例8中的冰糕的生產 所描述的相同的結論:相較于對照冰淇淋，用AFP19制造的冰淇淋均在用勺子挖取時更緊實 并且具有更順滑的口感。
[0214] 實施例11:用來自Aspergillus niger的AFP19生產的冰淇淋的融化行為
[0215]使在實施例10中生產的冰淇淋在25 °C的控制溫度下在1mm的網篩上融化。收集融 化物并不斷地在天平上測量重量。此實驗的結果可參見圖5。在用根據實施例2制備的來源 于Aspergillus niger的AFP19制造的冰淇淋和對照冰淇淋之間觀察到明顯的融化行為差 異。用AFP19制造的冰淇淋保持冷凍更長的時間段。此影響在40nM AFP19和400nM AFP19兩 者均可以觀測到，這比冰淇淋中來源于大洋鯰的III型HPLC12AFP的推薦劑量(7μΜ)要低得 多（Lewis，2006年，同上）。
[0217] 與被保藏的微生物相關的說明
[0218] (PCT Rule 13bis)
[0219]
[0220] 表 PCT/R0/134(1992年7月）。
【主權項】
1. 核酸構建體，其包含： 編碼冰結構蛋白質（ISP)的核酸序列，所述冰結構蛋白質包含在SEQ ID NO: 1中示出的 序列或者與其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出 的序列或者與其至少80%同一的序列；以及有效連接至所述核酸序列的 控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在絲狀真菌宿主細胞中表達。2. 根據權利要求1所述的核酸構建體，其中所述核酸序列編碼ISP，所述ISP包含在SEQ ID NO: 1中示出的序列或者與其至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同 一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的所述序列或者與其至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%或者至少99%同一的序列。3. 根據權利要求1或2所述的核酸構建體，其中所述核酸編碼ISP，所述ISP具有能夠從 Leucosporidium屬的北極酵母中獲得的氨基酸序列。4. 根據前述權利要求中任一項所述的核酸構建體，其中所述控制序列包含不與編碼 ISP的核酸天然相關聯的啟動子。5. 根據前述權利要求中任一項所述的核酸構建體，其中所述核酸是經密碼子對優化以 用于在所述絲狀真菌宿主細胞中表達的。6. 包含根據權利要求1到權利要求5中任一項所述的核酸構建體的表達載體。7. 絲狀真菌宿主細胞，其包含根據權利要求1到權利要求5中任一項所述的核酸構建體 或者根據權利要求6所述的表達載體。8. 根據權利要求7所述的絲狀真菌宿主細胞，其中所述絲狀真菌宿主細胞是 Acremonium、Aspergillus、Chrysosporium、Myceliophthora、Penicillium、Talaromyces、 Rasamsonia、Thielavia、Fusariuml^Trichode;rmaj^9〇9. 根據權利要求7或8所述的絲狀真菌宿主細胞，其中所述絲狀真菌宿主細胞是 Aspergillus niger、Aspergillus oryzae、Fusarium venenatum和Trichoderma reesei。10. -種用于產生冰結構蛋白質（ISP)的方法，所述方法包括： -提供絲狀真菌宿主細胞，所述絲狀真菌宿主細胞包含編碼ISP的核酸序列，所述ISP包 含在SEQ ID N0:1中示出的序列或者與其至少80%同一的序列，或者包含在SEQ ID N0:1的 第21至261位氨基酸中示出的序列或者與其至少80%同一的序列， 其中所述核酸序列有效連接至控制序列，所述控制序列允許所述核酸序列在所述絲狀 真菌宿主細胞中表達； -將所述絲狀真菌宿主細胞在適用于產生所述冰結構蛋白質的條件下培養；以及任選 地 -回收所述冰結構蛋白質。11. 根據權利要求10所述的方法，其中所述絲狀真菌宿主細胞是根據權利要求7到權利 要求9中任一項所述的絲狀真菌宿主細胞。12. 根據權利要求10到11中任一項所述的方法，其中所述ISP是從所述宿主細胞分泌 的。13. 根據權利要求10到權利要求12中任一項所述的方法，其中所述ISP是以至少lg/Ι的 量產生的。14. 能夠通過根據權利要求10到權利要求13中任一項所述的方法獲得的冰結構蛋白 質。15. 冰結構蛋白質，所述冰結構蛋白質包含在SEQ ID NO:1中示出的序列或者與其至少 80%同一的序列，或者包含在SEQ ID NO: 1的第21至261位氨基酸中示出的序列或者與其至 少80%同一的序列，其中 至少一個氨基酸是經修飾的氨基酸； 至少一個氨基酸是〇-甘露糖基化的； 所述蛋白質具有除2GlcNac和2個己糖單元外的糖基化模式;或者 所述蛋白質在 C 末端缺失 WQKRSNARQWL、VQKRSNARQWL 和 KRSNARQWL。16. 根據權利要求15所述的冰結構蛋白質，其中所述經修飾的氨基酸是在氨基末端存 在的焦谷氨酸。17. 食物組合物，其包含根據權利要求14到權利要求16中任一項所述的冰結構蛋白質。18. -種用于制備食物產品的方法，所述方法包括:將根據權利要求14到權利要求16中 任一項所述的冰結構蛋白質與一種或多種食物成分相組合。19. 根據權利要求14到權利要求16中任一項所述的冰結構蛋白質在食物組合物中的用 途。20. 根據權利要求17所述的食物組合物，根據權利要求18所述的方法或者根據權利要 求19所述的用途，其中所述食物組合物是冷凍糖食產品，例如冰激凌或冰糕。
【文檔編號】C12N15/81GK105992822SQ201480065622
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年12月2日
【發明人】芮妮·馬賽爾·鐘·德, 彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾
【申請人】帝斯曼知識產權資產管理有限公司