真菌基因文庫的雙分裂標記物整合的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性染色體整合的方法以及適用于此目的的多核苷酸構建體。
【專利說明】真菌基因文庫的雙分裂標記物整合
[0001] 對序列表的引用
[0002] 本申請包含計算機可讀形式的序列表。該計算機可讀形式通過引用結合在此。 發明領域
[0003] 本發明涉及若干已知特征和技術的組合，當如在此所示一起應用時，其提供一種 用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性染色體整合的改進方法以及適用 于此目的的多核苷酸構建體。
[0004] 發明背景
[0005] 常染色體復制質粒已經被用來成功地轉化真菌宿主細胞，既作為預形成的環狀質 粒又作為線性化質粒與PCR片段一起共轉化，用于在轉化的宿主細胞內進行體內重組的目 的。真菌復制質粒配備有自主復制序列，例如熟知的最初從構巢曲霉分離的AMA1序列或其 已知的功能衍生物之一(參見例如，阿萊克森科(Aleksenko)和克拉特巴克(Clutterbuck)， 分子微生物學(Mol Microbiol ·) 1996年2月；19(3): 565-74) 〇
[0006] 例如由尼爾森(Nielsen)等人(針對構巢曲霉的有效的基于PCR的用可再循環標記 物進行的基因革巴向（Efficient PCR-based gene targeting with a recyclable marker for Aspergillus nidulans)，真菌遺傳學和生物學（Fungal Genetics and Biology)43 (2006)54-64)披露了絲狀真菌宿主中的位點特異性分裂標記物（split-marker)或雙分 (bi-part ite)染色體整合。
【發明內容】
[0007] 眾所周知，常染色體復制質粒的使用改進在絲狀真菌宿主細胞中的轉化效率，并 且提供一致的表達水平，以使得當所述質粒被引入宿主細胞中時，能夠比較自包括在其中 的基因文庫表達的蛋白質。然而，本申請的諸位發明人已經發現用自主復制載體對絲狀真 菌宿主細胞進行轉化，隨后進行包括在所述載體中的編碼脂肪酶的基因的位點特異性分裂 標記物染色體整合，提供了優越的轉化效率加上脂肪酶表達水平的出人意料的增加，如通 過SDS-PAGE評估的（參見圖3)。
[0008] 因此，在第一方面，本發明涉及用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點 特異性染色體整合的方法，所述方法包括以下步驟：
[0009] a)提供一種多核苷酸構建體，該多核苷酸構建體包括自主復制序列和整合盒，所 述盒包括基因文庫和第一選擇性標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部 分并且在另一側側接第三選擇性標記的非功能性部分；
[0010] b)提供一種絲狀真菌宿主細胞，該絲狀真菌宿主細胞在其染色體中包括第二選擇 性標記的非功能性部分以及第三選擇性標記的非功能性部分，其中第二和第三選擇性標記 的染色體非功能性部分與多核苷酸構建體中的對應的非功能性部分之間的正確重組將產 生第二和第三功能性染色體選擇性標記；
[0011] c)用多核苷酸構建體轉化宿主細胞并且針對第一選擇性標記在該宿主細胞中的 存在進行選擇，由此分離出被成功轉化的宿主細胞;并且然后
[0012] d)針對第二和第三功能性選擇性標記的存在進行選擇，由此獲得具有基因文庫的 正確位點特異性染色體整合的宿主細胞。
[0013] 在第二方面，本發明涉及用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性 染色體整合的多核苷酸構建體，所述構建體包括自主復制序列和整合盒，所述盒包括基因 文庫和第一選擇性標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部分并且在另一 側側接第三選擇性標記的非功能性部分。
[0014] 定義
[0015] 編碼序列：術語"編碼序列"意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列 的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架從起始密碼子(如ATG、GTG或TTG)開始并 且以終止密碼子(如TAA、TAG或TGA)結束。編碼序列可以是基因組DNA、cDNA、合成DNA或其組 合。
[0016] 控制序列：術語"控制序列"意指對于表達編碼本發明的成熟多肽的多核苷酸所必 需的核酸序列。每個控制序列對于編碼該多肽的多核苷酸來說可以是天然的（即，來自相同 基因）或外源的（即，來自不同基因），或相對于彼此是天然的或外源的。此類控制序列包括 但不限于前導子、多腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列、以及轉錄終止子。至少， 控制序列包括啟動子以及轉錄和翻譯終止信號。出于引入有利于將這些控制序列與編碼多 肽的多核苷酸的編碼區連接的特異性限制酶切位點的目的，這些控制序列可以提供有多個 接頭。
[0017] 表達:術語"表達"包括涉及多肽產生的任何步驟，包括但不限于，轉錄、轉錄后修 飾、翻譯、翻譯后修飾、以及分泌。
[0018] 表達載體:術語"表達載體"意指線性或環狀DNA分子，該分子包括編碼多肽的多核 苷酸并且該多核苷酸可操作地與提供用于其表達的控制序列相連接。
[0019]宿主細胞:術語"宿主細胞"意指易于用包含本發明的多核苷酸的核酸構建體或表 達載體轉化、轉染、轉導等的任何細胞類型。術語"宿主細胞"涵蓋由于復制期間發生的突變 而與親本細胞不同的親本細胞的任何后代。
[0020] 分離的：術語"分離的"意指處于自然界中不存在的形式或環境中的物質。分離的 物質的非限制性實例包括（1)任何非天然存在的物質，（2)包括但不限于任何酶、變體、核 酸、蛋白、肽或輔因子的任何物質，該物質至少部分地從與其本質相關的一種或多種或所有 天然存在的成分中去除；（3)相對于天然發現的物質通過人工修飾的任何物質；或(4)通過 增加該物質相對于與其天然相關的其他組分的量而修飾的任何物質（例如，宿主細胞中的 重組體產生;編碼該物質的基因的多個拷貝；以及使用比編碼該物質的基因天然相關的啟 動子強的啟動子）。
[0021] 核酸構建體：術語"核酸構建體"或"多核苷酸構建體"意指單鏈或雙鏈的核酸分 子，該核酸分子是從天然存在的基因中分離的，或以本來不存在于自然界中的方式被修飾 成含有核酸的區段，或是合成的，該核酸分子包括一個或多個控制序列。
[0022] 可操作地連接:術語"可操作地連接"意指如下的構造，其中，控制序列相對于多核 苷酸的編碼序列安置在適當位置，從而使得該控制序列指導該編碼序列的表達。
[0023] 序列一致性:用參數"序列一致性"來描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列 之間的相關性。出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學開放軟件 套件，賴斯(Rice)等人，2000，遺傳學趨勢(Trends Genet ·) 16:276-277)(優選5 · 0 · 0版或更 新版本)的尼德爾(如6(116)程序中所實施的尼德爾曼-翁施(如6(1161]^11-￥11118〇11)算法(尼德 爾曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970,分子生物學雜志（J.Mol .Biol .)48:443-453)來確 定兩個氨基酸序列之間的序列一致性。所使用的參數是空位開放罰分10,空位延伸罰分 0.5，以及EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版)取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸 出(使用-非簡化選項獲得)被用作百分比一致性，并且計算如下：
[0024](一致的殘基X 100)/(比對長度-比對中的空位總數）
[0025]出于本發明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:歐洲分子生物學開放軟件套件， 賴斯等人，2000,同上）（優選5.0.0版或更新版本)的尼德爾程序中所實施的尼德爾曼-翁施 算法(尼德爾曼和翁施，1970,同上)來確定兩個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列一致性。所 使用的參數是空位開放罰分1 〇，空位延伸罰分〇 . 5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS 版)取代矩陣。尼德爾標注的"最長的一致性"的輸出（使用-非簡化選項獲得)被用作百分比 一致性，并且計算如下：
[0026](一致的脫氧核糖核苷酸X 100)/(比對長度-比對中的空位總數）
[0027]變體:術語"變體"意指在一個或多個(例如，若干個)位置處包括改變(即，取代、插 入和/或缺失）的多肽。取代意指用不同的氨基酸置換占據一個位置的氨基酸;缺失意指去 除占據一個位置的氨基酸;并且插入意指在鄰接并且緊隨占據一個位置的氨基酸之后添加 一個氨基酸。
[0028]附圖簡要說明
[0029] 圖1示出了在實例1中構建的質粒pBAC3155。
[0030] 圖2示出了在實例1中構建的質粒pBGMH0021。
[0031]圖3示出了 SDS-PAGE的照片；泳道卜3示出了通過具有攜帶在附加型基于AMA1質粒 上的表達盒的菌株(BGMH1000)表達的脂肪酶條帶（由箭頭指示），然而泳道4-6示出了通過 具有整合到宿主菌株(BGMH1001;C0LS1300)的染色體中的表達盒的菌株表達的顯著更粗的 脂肪酶條帶，如在此的實例2中概述的。
[0032] 發明詳述
[0033] 本發明的第一方面涉及用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性 染色體整合的方法，所述方法包括以下步驟：
[0034] a)提供一種多核苷酸構建體，該多核苷酸構建體包括自主復制序列和整合盒，所 述盒包括基因文庫和第一選擇性標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部 分并且在另一側側接第三選擇性標記的非功能性部分；
[0035] b)提供一種絲狀真菌宿主細胞，該絲狀真菌宿主細胞在其染色體中包括該第二選 擇性標記的非功能性部分以及該第三選擇性標記的非功能性部分，其中該第二和第三選擇 性標記的染色體非功能性部分與該多核苷酸構建體中的對應的非功能性部分之間的正確 重組將產生第二和第三功能性染色體選擇性標記；
[0036] c)用多核苷酸構建體轉化宿主細胞并且針對第一選擇性標記在該宿主細胞中的 存在進行選擇，由此分離出被成功轉化的宿主細胞;并且然后
[0037]針對第二和第三功能性選擇性標記的存在進行選擇，由此獲得具有基因文庫的正 確位點特異性染色體整合的宿主細胞。
[0038] 在第二方面，本發明涉及用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性 染色體整合的多核苷酸構建體，所述構建體包括自主復制序列和整合盒，所述盒包括基因 文庫和第一選擇性標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部分并且在另一 側側接第三選擇性標記的非功能性部分。
[0039] 在本發明的一個優選實施例中，該基因文庫包括編碼感興趣的親本多肽的基因的 修飾的、突變的或變體版本或由其組成;優選地，該感興趣的親本多肽是一種酶;更優選地， 其是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、 糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移 酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 變位酶(mutanase )、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酸氧化酶、蛋白水解酶、核 糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。
[0040] 本發明的絲狀真菌宿主細胞優選地是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗霉屬、煙管霉屬 (Bjerkandera)、擬臘菌屬(Ceriporiopsis)、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬(Coriolus)、隱 球菌屬、線黑粉菌科(Filibasidium)、鐮孢屬、腐質霉屬、梨孢菌屬(Magnaporthe)、毛霉屬、 毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌屬、射脈菌屬(Phlebia)、瘤胃 壺菌屬、側耳屬(Pleurotus)、裂裙菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉屬、栓 菌屬(Trametes)或木霉屬細胞;更優選地，該絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲 霉、日本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌(Bjerkandera adusta)、干擬錯菌 (Ceriporiopsis aneirina)、卡內基擬錯菌（Ceriporiopsis caregiea)、淺黃擬錯菌 (Ceriporiopsis gilvescens) Ceriporiopsis pannocinta)、環帶擬錯 菌（Ceriporiopsis rivu lo sa)、微紅擬錯菌（Ceripori ops is subrufa)、蟲擬錯菌 (Ceriporiopsis subvermispora)、狹邊金抱子菌（Chrysosporium inops)、嗜角質金抱子 菌（Chrysosporium keratinophilum)、盧克諾文思金抱子菌（Chrysosporium lucknowense)、奠狀金抱子菌（Chrysosporium merdarium)、租金抱子菌（Chrysosporium pannicola)、昆士蘭金孢子菌（Chrysosporium queenslandicum)、熱帶金孢子菌、褐薄金孢 子菌（Chrysosporium zonatum)、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌（Coriolus hirsutus)、桿孢狀鐮孢 (Fusarium bactridioides)、谷類鏡抱（Fusarium cerealis)、庫威鏡抱（Fusarium crookwellense)、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢(Fusarium graminum)、異孢鐮孢、合歡木 鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮孢、硫色鐮孢、圓鐮 抱(Fusarium torulosum)、擬絲抱鏡抱(Fusarium trichothecioides)、鑲片鏡抱、特異腐 質霉、柔毛腐質霉、米黑毛霉、嗜熱毀絲霉、粗糙鏈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌、射脈菌 (Phlebia radiata)、刺序側耳（Pleurotus eryngii)、土生梭孢殼霉、長絨毛栓菌 (Trametes villosa)、變色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、 里氏木霉、或綠色木霉細胞。
[0041]優選的是本發明的絲狀真菌宿主細胞具有增加的同源重組與非同源重組（HR/ NHR)比率；優選地，非同源末端連接(NHEJ)途徑的一種或多種組分被抑制或者同源重組 (HR)途徑的一種或多種組分被過表達;最優選地，酵母KU70基因的等效物被失活。
[0042]在一個優選實施例中，本發明的自主復制序列是來自構巢曲霉的AMA1序列或其功 能衍生物。
[0043] 本發明的選擇性標記優選地是pyrG、ni iA和niaD。
[0044] 核酸構建體
[0045] 本發明還涉及核酸構建體或多核苷酸構建體，這些構建體包含可操作地連接至一 個或多個控制序列的本發明的基因文庫，在與控制序列相容的條件下，這些控制序列指導 編碼序列在合適的宿主細胞中的表達。
[0046] 該多核苷酸可以按多種方式操縱，以提供該多肽的表達。取決于表達載體，在多核 苷酸序列插入載體之前對其進行操縱可以是令人希望的或必要的。用于利用重組DNA方法 修飾多核苷酸的技術是本領域熟知的。
[0047] 該控制序列可以是啟動子，即，被宿主細胞識別以對編碼本發明的多肽的多核苷 酸進行表達的多核苷酸。該啟動子包含轉錄控制序列，這些序列介導該多肽的表達。該啟動 子可以是在宿主細胞中顯示出轉錄活性的任何多核苷酸，包括突變型、截短型及雜合型啟 動子，并且可以由編碼與該宿主細胞同源或異源的細胞外或細胞內多肽的基因獲得。
[0048] 在絲狀真菌宿主細胞中，用于指導本發明的核酸構建體的轉錄的合適啟動子的實 例是獲得自以下各項的基因的啟動子:構巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉酸 穩定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉堿性 蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構酶、尖鐮孢胰蛋白酶-樣蛋白酶(W0 96/00787)、鑲片鐮孢菌淀 粉葡糖苷酶(W0 00/56900)、鑲片鐮孢菌Daria(達莉亞）（W0 00/56900)、鑲片鐮孢菌Quinn (奎恩）（W0 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖 苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉纖維二糖水解酶II、里氏木霉內切葡聚糖酶I、 里氏木霉內切葡聚糖酶Π 、里氏木霉內切葡聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉 木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶Π 、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏 木霉翻譯延伸因子，連同NA2-tpi啟動子(來自編碼中性α-淀粉酶的曲霉屬基因的修飾的啟 動子，其中已經用來自編碼丙糖磷酸異構酶的曲霉屬基因的未翻譯的前導子替換未翻譯的 前導子;非限制性實例包括來自編碼中性淀粉酶的黑曲霉基因的修飾的啟動子，其中已 經用來自編碼丙糖磷酸異構酶的構巢曲霉或米曲霉基因的未翻譯的前導子替換未翻譯的 前導子）；及其突變型、截短型及雜合型啟動子。其他啟動子在美國專利號6，011，147中描 述。
[0049] 控制序列還可以是由宿主細胞識別以終止轉錄的轉錄終止子。該終止子可操作地 連接至編碼該多肽的多核苷酸的3'_末端。在該宿主細胞中起作用的任何終止子都可以用 于本發明中。
[0050] 用于絲狀真菌宿主細胞的優選終止子是從以下各項的基因獲得:構巢曲霉乙酰胺 酶、構巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α_葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉 酶、尖鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、里氏木霉葡糖苷酶、里氏木霉纖維二糖水解酶I、里氏木霉 纖維二糖水解酶Π 、里氏木霉內切葡聚糖酶I、里氏木霉內切葡聚糖酶II、里氏木霉內切葡 聚糖酶III、里氏木霉內切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉 木聚糖酶III、里氏木霉木糖苷酶以及里氏木霉翻譯延長因子。
[0051] 該控制序列還可以是在啟動子下游并且在基因編碼序列上游的mRNA穩定子區域， 它增加該基因的表達。
[0052] 該控制序列還可以是前導子，一種對宿主細胞翻譯重要的非翻譯mRNA區域。該前 導子可操作地連接至編碼該多肽的多核苷酸的5'_末端。可以使用在宿主細胞中起作用的 任何前導子。
[0053] 用于絲狀真菌宿主細胞的優選前導子是從米曲霉TAKA淀粉酶和構巢曲霉丙糖磷 酸異構酶的基因獲得。
[0054] 控制序列還可以是聚腺苷酸化序列，可操作地連接至該多核苷酸的3'-末端并且 當轉錄時由宿主細胞識別為將聚腺苷酸殘基添加至所轉錄的mRNA的信號的序列。可以使用 在宿主細胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
[0055] 用于絲狀真菌宿主細胞的優選聚腺苷酸化序列是從以下各項的基因獲得:構巢曲 霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖鐮 抱膜蛋白酶樣蛋白酶。
[0056] 控制序列還可以是編碼與多肽的N-末端連接并指導多肽進入細胞的分泌通路的 信號肽的信號肽編碼區。多核苷酸的編碼序列的5'_端可以固有地包含在翻譯閱讀框中與 編碼多肽的編碼序列的區段天然地連接的信號肽編碼序列。可替代地，編碼序列的5'_端可 以包含對于該編碼序列而言是外源的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然地包含信號肽編 碼序列的情況下，可能需要外源信號肽編碼序列。可替代地，外源信號肽編碼序列可簡單地 替換天然的信號肽編碼序列以便增強該多肽的分泌。然而，可以使用指導所表達多肽進入 宿主細胞的分泌通路的任何信號肽編碼序列。
[0057] 用于絲狀真菌宿主細胞的有效信號肽編碼序列是獲得自以下各項的基因的信號 肽編碼序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特異腐質霉纖維 素酶、特異腐質霉內切葡聚糖酶V、柔毛腐質霉脂肪酶以及米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。
[0058] 控制序列還可以是編碼位于多肽的N-末端處的前肽的前肽編碼序列。生成的多肽 被稱為前體酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情況下被稱為酶原(zymogen))。多肽原通常 是無活性的并且可以通過催化切割或自身催化切割來自多肽原的前肽而轉化為活性多肽。 前肽編碼序列可以從以下各項的基因獲得:枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢桿 菌中性蛋白酶(nprT)、嗜熱毀絲霉漆酶(W0 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及 釀酒酵母因子。
[0059] 在信號肽序列和前肽序列二者都存在的情況下，該前肽序列定位成緊鄰多肽的Ν-末端并且該信號肽序列定位成緊鄰該前肽序列的Ν-末端。
[0060] 還可能希望地是添加調節序列，這些調節序列相對于宿主細胞的生長來調節多肽 的表達。調節序列的實例是使得基因的表達響應于化學或物理刺激(包括調節化合物的存 在)而開啟或關閉的那些。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉TAKA 淀粉酶啟動子和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子、里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子以及里氏 木霉纖維二糖水解酶II啟動子。調控序列的其他實例是允許基因擴增的那些。在真核系統 中，這些調控序列包括在甲氨蝶呤存在下被擴增的二氫葉酸還原酶基因以及用重金屬擴增 的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸將與調控序列可操作地連接。
[0061 ] 表達載體
[0062]本發明還涉及包括本發明的多核苷酸、啟動子、以及轉錄和翻譯終止信號的重組 表達載體。不同的核苷酸和控制序列可以連接在一起以產生重組表達載體，該重組表達載 體可以包括一個或多個便利的限制酶切位點以允許在這些位點處插入或取代編碼該多肽 的多核苷酸。可替代地，該多核苷酸可以通過將該多核苷酸或包括該多核苷酸的核酸構建 體插入用于表達的適當載體中來表達。在產生該表達載體時，該編碼序列位于該載體中，這 樣使得該編碼序列與該供表達的適當控制序列可操作地連接。
[0063] 重組表達載體可以是任何載體(例如，質粒或病毒），其能夠方便地進行重組DNA程 序，并且能夠引起多核苷酸的表達。載體的選擇將典型地取決于該載體與有待引入該載體 的宿主細胞的相容性。該載體可以是線性的或閉合的環狀質粒。
[0064] 該載體包含一個或多個允許方便地選擇轉化細胞、轉染細胞、轉導細胞等細胞的 選擇性標記。選擇性標記是這樣一種基因，該基因的產物提供了殺生物劑抗性或病毒抗性、 重金屬抗性、營養缺陷型的原養型等。
[0065]用于在絲狀真菌宿主細胞中使用的選擇性標記包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰 氨基咪唑-琥珀羧胺合酶）、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶）、amdS(乙酰胺酶）、argB(鳥氨 酸氨甲酰基轉移酶）、bar(草丁膦乙酰轉移酶）、hph(潮霉素磷酸轉移酶）、niaD(硝酸還原 酶）、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脫羧酶）、sC(硫酸腺苷基轉移酶）、以及trpC(鄰氨基苯甲酸 合酶），連同其等效物。優選在曲霉屬細胞中使用的是構巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以 及吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus)bar基因。優選在木霉屬細胞中使用的是 adeA、adeB、amdS、hph 以及pyrG基因。
[0066] 選擇性標記可以是如在WO 2010/039889中描述的雙選擇性標記系統。在一方面， 雙選擇性標記是hph-tk雙選擇性標記系統。
[0067] 對于整合到該宿主細胞基因組中，該載體可以依靠編碼該多肽的多核苷酸序列或 用于通過同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他元件。可替代地，該載 體可以包含用于指導通過同源重組而整合到宿主細胞基因組中的一個或多個染色體中的 一個或多個精確位置處的另外的多核苷酸。為了增加在精確位置整合的可能性，這些整合 元件應包含足夠數量的核酸，例如100至10，〇〇〇個堿基對、400至10，000個堿基對、以及800 至10,000個堿基對，這些堿基對與對應的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重組的 可能性。這些整合元件可以是與宿主細胞的基因組內的靶序列同源的任何序列。此外，這些 整合元件可以是非編碼多核苷酸或編碼多核苷酸。另一方面，該載體可以通過非同源重組 整合到宿主細胞的基因組中。
[0068] 對于自主復制，該載體包括使該載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復制的復制 起點。復制起點可以是在細胞中起作用的介導自主復制的任何質粒復制子。術語"復制起點 (origin of replication)"或"質粒復制子(plasmid replicator)"意指使得質粒或載體 可在體內復制的多核苷酸。
[0069]在絲狀真菌細胞內有用的復制起點的實例是AMA1和ANSI (格姆斯（Gems)等人， 1991，基因（Gene)98:61-67;卡倫(Cullen)等人，1987,核酸研究（Nucleic Acids Res. )15: 9163-9175;W0 00/24883)^1^1基因的分離和包含該基因的質粒或載體的構建可以根據披 露于W0 00/24883中的方法來完成。
[0070]可以將本發明的多核苷酸的多于一個的拷貝插入到宿主細胞中以增加多肽的產 生。通過將序列的至少一個另外的拷貝整合到宿主細胞基因組中或者通過包括與該多核苷 酸一起的可擴增的選擇性標記基因可以獲得多核苷酸的增加的拷貝數目，其中通過在適當 的選擇性試劑的存在下培養細胞可以選擇包含選擇性標記基因的經擴增的拷貝的細胞，以 及由此該多核苷酸的另外的拷貝。
[0071] 用于連接以上所描述的元件以構建本發明的重組表達載體的程序是本領域的普 通技術人員熟知的(參見例如，薩姆布魯克(Sambrook)等人，1989,同上）。
[0072] 可以將真菌細胞通過涉及原生質體形成、原生質體轉化、以及細胞壁再生的方法 以本身已知的方式轉化。用于轉化曲霉屬和木霉屬宿主細胞的適合程序描述于EP 238023， 約爾頓(Yelton)等人，1984,美國國家科學院院刊（Proc.Natl .Acad. Sci.USA)81:1470-1474以及克里斯滕森(Christensen)等人，1988,生物/技術(Bio/Technology )6:1419-1422 中。用于轉化鐮孢屬物種的適合方法由馬拉迪爾(Malardier)等人，1989,基因（Gene)78: 147-156和W0 96/00787描述。
[0073]生產方法
[0074]本發明還涉及產生本發明的多肽的方法，這些方法包括(a)在有益于產生該多肽 的條件下培養本發明的重組宿主細胞;并且可任選地，（b)回收該多肽。
[0075]這些宿主細胞是在適合于使用本領域中已知的方法產生該多肽的營養培養基中 培養的。例如，可以通過在適合的培養基中和在允許表達和/或分離該多肽的條件下，進行 搖瓶培養，或者在實驗室或工業發酵罐中進行小規模或大規模發酵(包括連續，分批，分批 補料，或固態發酵)來培養細胞。該培養是使用本領域中已知的程序，在適合的營養培養基 中發生，該培養基包含碳源和氮源及無機鹽。適合的培養基可從商業供應商獲得或可以根 據公開的組成(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中）制備。如果多肽分泌到該營養 培養基中，那么可直接從培養基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可從細胞裂解液中 進行回收。
[0076]可以使用特異性針對這些多肽的本領域已知的方法來檢測該多肽。這些檢測方法 包括但不限于，特異性抗體的使用、酶產物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶測定 來確定該多肽的活性。
[0077]可以使用本領域已知的方法來回收多肽。例如，該多肽可以通過常規程序，包括但 不限于，收集、離心、過濾、提取、噴霧干燥、蒸發或沉淀，從該營養培養基回收。在一方面，回 收包含該多肽的發酵液。
[0078]可以通過本領域中已知的多種程序來純化該多肽以獲得基本上純的多肽，這些程 序包括但不限于:色譜法(例如，離子交換色譜、親和色譜、疏水作用色譜、色譜聚焦、以及尺 寸排阻色譜）、電泳程序(例如，制備型等電點聚焦）、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀）、SDS-PAGE、或提取（參見例如，蛋白質純化（Protein Purification)，詹森（Janson)和賴登 (Ryden)編輯，VCH出版社(VCH Publishers)，紐約，1989)。
[0079] 在一個替代性方面中，沒有回收該多肽，而是將表達該多肽的本發明的宿主細胞 用作該多肽的來源。
[0080] 發酵液配制品或細胞組合物
[0081] 本發明還涉及包含本發明的多肽的發酵液配制品或細胞組合物。發酵液產物進一 步包括在發酵過程中使用的另外的成分，例如像，細胞(包括含有編碼本發明的多肽的基因 的宿主細胞，這些宿主細胞被用于產生感興趣的多肽）、細胞碎片、生物質、發酵介質和/或 發酵產物。在一些實施例中，該組合物是含有一種或多種有機酸、殺滅的細胞和/或細胞碎 片以及培養基的細胞殺滅的全培養液。
[0082]如在此使用的術語"發酵液"是指由細胞發酵產生、不經歷或經歷最低限的回收 和/或純化的制劑。例如，當微生物培養物生長至飽和，在碳限制條件下孵育以允許蛋白質 合成(例如，由宿主細胞進行酶的表達)并且分泌到細胞培養基中時，產生發酵液。發酵液可 以包含在發酵結束時得到的發酵材料的未分級的或分級的內容物。典型地，發酵液是未分 級的并且包括用過的培養基以及例如通過離心去除微生物細胞(例如，絲狀真菌細胞)之后 存在的細胞碎片。在一些實施例中，發酵液包含用過的細胞培養基、胞外酶以及有活力的 和/或無活力的微生物細胞。
[0083]在一個實施例中，該發酵液配制品和細胞組合物包括第一有機酸組分(包括至少 一種1-5碳的有機酸和/或其鹽）以及第二有機酸組分(包括至少一種6碳或更多碳的有機酸 和/或其鹽）。在一個具體實施例中，該第一有機酸組分是乙酸、甲酸、丙酸、其鹽，或前述兩 種或更多種的混合物;并且該第二有機酸組分是苯甲酸、環己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、 其鹽，或前述兩種或更多種的混合物。
[0084] 在一方面，該組合物包含一種或多種有機酸，并且任選地進一步含有殺滅的細胞 和/或細胞碎片。在一個實施例中，從細胞殺滅的全培養液中去除這些殺滅的細胞和/或細 胞碎片，以提供不含這些組分的組合物。
[0085] 這些發酵液配制品或細胞組合物可以進一步包括防腐劑和/或抗微生物(例如，抑 菌)劑，包括但不限于山梨醇、氯化鈉、山梨酸鉀、以及本領域中已知的其他試劑。
[0086] 該細胞殺滅的全培養液或組合物可以包含在發酵結束時得到的發酵材料的未分 級的內容物。典型地，該細胞殺滅的全培養液或組合物包含用過的培養基以及在微生物細 胞(例如，絲狀真菌細胞)生長至飽和、在碳限制條件下孵育以允許蛋白合成之后存在的細 胞碎片。在一些實施例中，細胞殺滅的全培養液或組合物含有用過的細胞培養基、胞外酶和 殺滅的絲狀真菌細胞。在一些實施例中，可以使用本領域已知的方法來使細胞殺滅的全培 養液或組合物中存在的微生物細胞透性化和/或裂解。
[0087] 如在此描述的全培養液或細胞組合物典型地是液體，但是可以含有不溶性組分， 例如殺滅的細胞、細胞碎片、培養基組分和/或一種或多種不溶性酶。在一些實施例中，可以 除去不溶性組分以提供澄清的液體組合物。
[0088] 可以通過W0 90/15861或W0 2010/096673所述的方法產生本發明的全培養液配制 品和細胞組合物。
[0089] 實例
[0090] 在此我們使用常染色體復制質粒將大基因文庫轉化到絲狀真菌中并且然后使用 雙分裂標記物系統確保該文庫被位點特異性整合到該真菌的染色體中，由此提供穩定的且 可比較的表達產量，甚至在富生長培養基中。
[0091] 來自構巢曲霉的熟知的AMA1 (自主維持)序列使得質粒在真菌細胞核中以附加型 復制成為可能。我們使用的質粒包含ΑΜΑ序列以及包括基因文庫和具有啟動子與終止子的 全長pyrG基因的整合盒，所述盒在每一側分別側接niiA和niaD基因的非功能性部分，SP兩 個基因的5'端和啟動子。
[0092] 將該質粒文庫轉化到pyrG、niiA、niaD負型米曲霉宿主菌株(Colsl392)中并且首 先在具有尿素的基本培養基中進行篩選。這意味著僅針對pyrG的存在（即單獨成功的轉化） 進行選擇，因為當該菌株使用尿素作為氮源時，不需要功能性niiA和niaD基因。經轉化的質 粒將很可能以附加型存在，隨著真菌細胞生長具有從細胞核中丟失的傾向。
[0093]當鑒定出陽性轉化子時，將大量的孢子涂布至補充有NaN03的基本培養基的板上。 在整合盒已經成功地重組到宿主細胞的染色體中并在該過程中重構niiA和niaD位點的情 況下，僅孢子可以發芽和存活。
[0094]基因組位點特異性整合確保這些轉化子是穩定的并提供更高的且更一致的表達 水平，其進而允許從基因文庫中選擇感興趣的單個基因。
[0095]實例1.基于ΑΜΑ的整合質粒的構建
[0096] 如下制備保留ΑΜΑ序列和允許整合到米曲霉(C01sl392)的染色體中的niiA和niaD 中的區域兩者的質粒。
[0097] 將ΑΜΑ區域插入pBGMH14中從而產生pBAC3155。
[0098] 在PCR反應中，使用pENI4286(即ρΕΝΙ1298的衍生物（披露于W0 2008138835中））作 為模板以及寡核苷酸291012J4和291012J5將ΑΜΑ序列分離為PCR片段：
[0099] 291012jvi4：gccgcaattgtggctgcaggtcgaccatgccg(SEQ ID N0:1)
[0100] 291012jvi5：gccgcaattgaatgataccacagtctagttgac(SEQ ID N0:2)
[0101] 將該AM序列PCR片段使用商業克隆試劑盒進行克隆并且然后轉化到ToplO大腸桿 菌細胞中。制備DNA制劑用于克隆并且用Mfel限制性內切酶切割。也將載體pBGMH14(W0 2013/119302)用Mfel切割并且用小牛腸磷酸酶處理。將切割載體和包含ΑΜΑ的片段從瓊脂 糖凝膠純化并連接過夜。將該連接混合物轉化到大腸桿菌DHlOb中，并且DNA制劑由所得的 大腸桿菌克隆構成。將DNA制劑進行測序并用限制性內切酶EcoRV切割以鑒別正確的克隆。 將所得的質粒命名為PBAC3155，參見圖1。
[0102] 將脂肪酶基因插入PBAC3155中從而產生pBGMH0021。
[0103] 質粒pBAC3155包含PacI/Nt.BbvCI尿嘧啶特異性切除試劑或USER?盒（漢森 (Hansen)等人，2011，應用與環境微生物學(Appl .Environ.Microbiol · )77(9) :3044-51)， 該盒在一側側接米曲霉niaD基因的一部分并且在另一側側接米曲霉niiA基因的一部分 (USER?商標屬于新英格蘭生物實驗室(New England Biolabs)，美國）。尿嘧啶特異性切除 酶在尿嘧啶位置處產生單核苷酸缺口。該酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂 解酶內切核酸酶VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶堿基的切除，從而形成無堿基(無嘧啶）位 點，而保持磷酸二酯骨架的完整。內切核酸酶VIII的裂解酶活性在無堿基位點的3'和5'側 破壞磷酸二酯骨架，這樣使得釋放無堿基的脫氧核糖。可以用PacI和Nt.BbvCI使PPacI/ Nt.BbvCI USER?盒線性化;然后具有相容的突出端的PCR產物可以克隆到這個位點。
[0104] 我們將包含來自米曲霉的N A 2 t p i啟動子、編碼疏棉狀嗜熱絲孢菌 (T. lanuginosus)脂肪酶的基因以及轉錄終止子的片段克隆到Pac Ι/Nt.BbvCI USER?盒 中。使用兩種包含尿嘧啶的引物BGMH155和BGMH156將該片段從作為模板的pENI4286 (pENI 1298的衍生物)進行PCR擴增。
[0105] BGMH155：ggacttaauagcgagagagttgaacctggacg(SEQ ID NO:3)
[0106] BGMH156:gggtttaaucagatggcccgagaggactattccga(SEQ ID N0:4)
[0107] 將加下劃線的序列用于USER?輔助克隆到PBAC315 5中的Pac I /Nt. BbvC I USER?盒 中。
[0108] 最終體積為50μ1的擴增反應由以下組成：100ng的每種引物、模板DNA(10ng PENI4286)、1ΧΡ/^Τηγ/)〇_? C、反應緩沖液、2.5μ1 的dATP、dTTP、dGTP和dCTP的共混物（各以 10mM)以及2.5單位的P/wrwr/)〇_?Cx熱啟動DNA聚合酶。將PCR反應編程為：1個循環，在95°C 下持續2分鐘;40個循環，每個循環在95°C下持續30秒、55°C下持續30秒、以及72°C下持續4 分鐘；以及最終延長，在72 °C下持續10分鐘。
[0109] 在PCR擴增之后，添加5μ1的10X NEBuffer 4和20單位的Dpn I并且在37°C下孵育1 小時。在80°C下持續20分鐘使Dpn I失活。將PCR產物進行凝膠純化，并且將50ng的PCR產物、 10ng的PacI/Nt.BbvCI消化的pBAC3155以及1單位的USER?酶以10μ1的總體積在37°C下孵育 20分鐘，隨后在25°C下孵育20分鐘。接著將10μ1轉化到0NESHOT?T0P10感受態細胞中。將 所得的質粒命名為pBGMHOO 21，參見圖2。
[0110] 實例2.用pBGMH0021對絲狀真菌菌株C0LS1392進行轉化
[0111] 將質粒PBGMH0021轉化到⑶LS1392中，將其涂布在10mM尿素板上;選擇轉化子，即 菌株BGMH1000,其中pBGMH0021作為附加型質粒存在。
[0112] 將多個轉化子轉移到具有10mM尿素的新板上，并且六天后，通過向每個板中添加 l〇ml的水來收獲孢子。將lml孢子(孢子量/ml:約l，5x 107個)轉移到含有NaN03的板上。將這 些板在37°C下孵育六天，從而提供10-100個菌落/板。
[0113] 因為當沒有尿苷存在于這些板中時，pyrG、niiA和niaD對于菌株在作為僅有的氮 源的NaN03上生長而言都需要是功能性的，所以出現的菌落必須已經修復了niiA與niaD兩 者并且已經引入了pyrG基因。要想讓這成為可能，同源重組必須已經在niiA與niaD兩者中 發生，在該過程中重構兩個基因座。將一個菌株選擇為BGMH1001。
[0?14]最后，在包含尿苷的板上選擇pyrG-突變型菌株，即Cols 1300。
[0115]
[0116] 實例3.來自附加型與整合型表達盒的脂肪酶產量的比較
[0117] 使在實例2中構建的菌株在200μ1 YPM-培養基(+尿素）中的MTP中在34°C下生長3 天。將來自附加型基于AMA1質粒攜帶的表達盒(菌株BGMH1000)和來自染色體位點特異性整 合的表達盒(菌株BGMH1001/C0LS1300)的柔毛腐質霉脂肪酶的表達水平通過SDS-PAGE進行 比較。
[0118] SDS-PAGE凝膠的照片示于圖3中。通過箭頭指示脂肪酶條帶；泳道1-3示出了附加 型基于AMA1質粒的表達，然而泳道4-6示出了通過根據本發明的染色體整合盒表達的顯著 更粗的脂肪酶條帶。
【主權項】
1. 一種用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性染色體整合的方法，該 方法包括以下步驟： a) 提供一種多核苷酸構建體，該多核苷酸構建體包括自主復制序列和整合盒，所述盒 包括該基因文庫和第一選擇性標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部分 并且在另一側側接第三選擇性標記的非功能性部分； b) 提供一種絲狀真菌宿主細胞，該絲狀真菌宿主細胞在其染色體中包括該第二選擇性 標記的非功能性部分以及該第三選擇性標記的非功能性部分，其中該第二和第三選擇性標 記的染色體非功能性部分與該多核苷酸構建體中的對應的非功能性部分之間的正確重組 將產生第二和第三功能性染色體選擇性標記； c) 用該多核苷酸構建體轉化該宿主細胞并且針對該第一選擇性標記在該宿主細胞中 的存在進行選擇，由此分離出被成功轉化的宿主細胞;并且然后 d) 針對第二和第三功能性選擇性標記的存在進行選擇，由此獲得具有該基因文庫的正 確位點特異性染色體整合的宿主細胞。2. 如權利要求1所述的方法，其中該基因文庫包括編碼感興趣的親本多肽的基因的修 飾的、突變的或變體版本或由其組成;優選地，該感興趣的親本多肽是一種酶;更優選地，其 是半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖 酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊精糖基轉移 酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、 變位酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、 轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。3. 如權利要求1或2所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細胞是枝頂孢霉屬、曲霉屬、短梗 霉屬、煙管霉屬、擬臘菌屬、金孢子菌屬、鬼傘屬、革蓋菌屬、隱球菌屬、線黑粉菌科、鐮孢屬、 腐質霉屬、梨孢菌屬、毛霉屬、毀絲霉屬、新美鞭菌屬、鏈孢菌屬、擬青霉屬、青霉屬、平革菌 屬、射脈菌屬、瘤胃壺菌屬、側耳屬、裂褶菌屬、籃狀菌屬、嗜熱子囊菌屬、梭孢殼屬、彎頸霉 屬、栓菌屬或木霉屬細胞。4. 如權利要求3所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細胞是泡盛曲霉、臭曲霉、煙曲霉、日 本曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺煙管菌、干擬蠟菌、卡內基擬蠟菌、淺黃擬蠟菌、潘 諾希塔擬蠟菌、環帶擬蠟菌、微紅擬蠟菌、蟲擬蠟菌、狹邊金孢子菌、嗜角質金孢子菌、盧克 諾文思金孢子菌、糞狀金孢子菌、租金孢子菌、昆士蘭金孢子菌、熱帶金孢子菌、褐薄金孢子 菌、灰蓋鬼傘、毛革蓋菌、桿孢狀鐮孢、谷類鐮孢、庫威鐮孢、大刀鐮孢、禾谷鐮孢、禾赤鐮孢、 異孢鐮孢、合歡木鐮孢、尖鐮孢、多枝鐮孢、粉紅鐮孢、接骨木鐮孢、膚色鐮孢、擬分枝孢鐮 孢、硫色鐮孢、圓鐮孢、擬絲孢鐮孢、鑲片鐮孢、特異腐質霉、柔毛腐質霉、米黑毛霉、嗜熱毀 絲霉、粗糙鏈孢菌、產紫青霉、黃孢平革菌、射脈菌、刺芹側耳、土生梭孢殼霉、長絨毛栓菌、 變色栓菌、哈茨木霉、康寧木霉、長枝木霉、里氏木霉、或綠色木霉細胞。5. 如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中該絲狀真菌宿主細胞具有增加的同源重 組與非同源重組(HR/NHR)比率;優選地，非同源末端連接(NHEJ)途徑的一種或多種組分被 抑制或者同源重組(HR)途徑的一種或多種組分被過表達;最優選地，酵母KU70基因的等效 物被失活。6. 如權利要求1-5中任一項所述的方法，其中該自主復制序列是來自構巢曲霉的AMA1 序列或其功能衍生物。7. 如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中這些選擇性標記是pyrG、niiA和niaD。8. -種用于在絲狀真菌宿主細胞中對基因文庫進行位點特異性染色體整合的多核苷 酸構建體，所述構建體包括自主復制序列和整合盒，所述盒包括該基因文庫和第一選擇性 標記，其中該盒在一側側接第二選擇性標記的非功能性部分并且在另一側側接第三選擇性 標記的非功能性部分。9. 如權利要求8所述的多核苷酸構建體，其中該基因文庫包括編碼感興趣的親本多肽 的基因的修飾的、突變的或變體版本或由其組成;優選地，該感興趣的親本多肽是一種酶； 更優選地，其是α-半乳糖苷酶、α-葡糖苷酶、氨肽酶、淀粉酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酶、β-木糖苷酶、糖酶、羧肽酶、過氧化氫酶、纖維二糖水解酶、纖維素酶、殼多糖酶、角質酶、環糊 精糖基轉移酶、脫氧核糖核酸酶、內切葡聚糖酶、酯酶、葡糖淀粉酶、轉化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、變位酶、氧化酶、果膠分解酶、過氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、 核糖核酸酶、轉谷氨酰胺酶、或木聚糖酶。10. 如權利要求8或9所述的多核苷酸構建體，其中該自主復制序列是來自構巢曲霉的 ΑΜΑ1序列或其功能衍生物。11. 如權利要求8-10中任一項所述的多核苷酸構建體，其中這些選擇性標記是pyrG、 niiA和niaD〇
【文檔編號】C12N15/90GK105992821SQ201480065689
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年12月3日
【發明人】B·G·漢森, C·L·奧爾森, J·維恩
【申請人】諾維信公司