生物反應器中的細胞擴增的制作方法

生物反應器中的細胞擴增的制作方法
【專利摘要】本發明描述了用于在生物反應器中擴增細胞的實施方式。在一個實施方式中，提供了在生物反應器中分布細胞和使細胞附著至生物反應器的特定部分以改善細胞在生物反應器中的擴增的方法。可在被配置為加載、分布、附著和擴增細胞的細胞擴增系統上實施實施方式。
【專利說明】生物反應器中的細胞擴増
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年11月16日遞交的美國臨時專利申請號61/905,182的名稱為 "在細胞擴增系統的生物反應器中加載并且分布細胞的方法(METHOD OF LOADING AND DISTRIBUTING CELLS IN A BIOREACTOR OF A CELL EXPANSION SYSTEM)" 的優先權，該美 國臨時專利申請通過引用整體并入本文中，就如其全文涵蓋在本申請中一樣。
【背景技術】
[0003] 干細胞在各種治療和療法中的潛在應用已經取得了特別關注。細胞擴增系統可用 于擴增(例如生長)干細胞以及其它類型的細胞，諸如骨髓細胞。從供體細胞擴增的干細胞 可用于修復或替換受損的或有缺陷的組織，并且對于大量疾病都具有廣泛的臨床應用。再 生醫學領域中的最新進展證實了，干細胞具有很多特性，諸如增殖和自我更新能力、維持非 特化狀態以及在特定條件下分化成特化細胞的能力。
[0004] 細胞擴增系統包括用于擴增細胞的一個或多個腔室，諸如細胞生長腔室(在本文 中也被稱為"生物反應器"）。為了擴增細胞，通常將初始體積的細胞加載并且分布在生物反 應器中。因此，需要一種在與細胞擴增系統相連的生物反應器中加載并且分布細胞的方法。 本發明解決了這種需要或其他需要。
[0005] 鑒于這些和其它方面的考慮，進行了本發明的實施方式。但是，上述相對具體的問 題并不限制本發明的實施方式對其它問題的適用性。

【發明內容】

[0006] 提供該
【發明內容】
以介紹本發明的簡化形式的一些實施方式的各個方面，并不用于 確定本發明的關鍵或必要元素，也不用于限制權利要求的范圍。
[0007] 應理解本發明可包括多種不同的變體或實施方式，本
【發明內容】
并不是要進行限制 或包括所有的變體或實施方式。本
【發明內容】
提供了對一些可被包括在實施方式中的特征的 一些概括性描述，還包括了對可被包括在其他實施方式中的其他特征的一些更具體的描 述。
[0008] -個或多個實施方式通常涉及用于在細胞擴增系統的生物反應器中加載和分布 細胞的方法和系統。因此，實施方式包括可用于向流體中添加多個細胞的方法，該流體在細 胞擴增系統的生物反應器內以第一速度循環。在實施方式中，生物反應器可包括具有多個 獨立中空纖維的中空纖維膜，細胞和其他流體穿過該具有多個獨立中空纖維的中空纖維膜 循環。最初，流體穿過生物反應器的中空纖維膜循環，并且將細胞添加到循環的流體中。流 體以第一預定的循環速度進行循環。在循環過程中，生物反應器可處于水平位置。在通過添 加至循環流體來加載細胞后，隨著細胞流入和流出中空纖維膜的中空纖維，可允許細胞穿 過系統循環并且均勻地分布在系統中。然后，可停止循環。隨后，在重力的影響下，允許細胞 沉淀，并且附著至生物反應器中的中空纖維的第一區上。在實施方式中，可允許細胞在第一 預定時間段期間進行沉淀。在一些實施方式中，可對預定時間段進行選擇，以允許細胞附著 至中空纖維的第一區上。
[0009] 在第一預定時間段之后，使生物反應器旋轉180度。在生物反應器旋轉之后，允許 生物反應器內的細胞進行額外的沉淀。然后，細胞可在第二預定時間段期間沉淀在中空纖 維的相對的部分上，可對該第二預定時間段進行選擇，以允許細胞附著至該相對的部分。在 第二預定時間段之后，使生物反應器旋轉回到其初始的水平位置，然后細胞進行擴增程序。
[0010] 在一些實施方式中，加載過程包括額外的步驟。在一些實施方式中，在生物反應器 返回至其初始的水平位置之后，重新啟動循環。可將循環速度設置為比第一預定循環速度 慢的速度。一旦使還沒有附著至表面的細胞進行額外的分布，則要進行循環。該循環應持續 第三預定時間段，以允許未附著的細胞均勻分布在包括生物反應器的系統中。然后停止循 環，以允許生物反應器中的細胞沉淀，并且在一些實施方式中再次附著至中空纖維的多個 部分上
[0011] 在允許細胞進行額外沉淀的第四預定時間段之后，使生物反應器旋轉180度。在生 物反應器旋轉之后，允許生物反應器內的細胞進行額外的沉淀。然后，細胞可在第五預定時 間段期間沉淀在中空纖維的相對部分上，可對該第五預定時間段進行選擇，以允許細胞附 著至中空纖維的相對部分。在第五預定時間段之后，使生物反應器旋轉回到其初始的水平 位置
[0012] 通過使細胞在系統中循環，以再次重復上述程序，以使任何未附著的細胞進行均 勻分布。但是，每次重新啟動循環，都以比之前循環慢的速度重新啟動。當停止循環時，允許 細胞沉淀和附著。使生物反應器旋轉180度，并且允許細胞沉淀和附著。然后，使生物反應器 旋轉回到其初始位置。可將循環、沉淀、旋轉、沉淀和旋轉的這些步驟重復預定的次數，之 后，已經附著成層的附著的細胞在生物反應器中進行擴增。
[0013] 其它實施方式還涉及用于在細胞擴增系統的生物反應器中加載和分布細胞的方 法和系統。實施方式包括可用于向流體中添加多個細胞的方法，該流體在細胞擴增系統的 生物反應器內以第一速度循環。在實施方式中，生物反應器可包括具有多個獨立中空纖維 的中空纖維膜，細胞和其他流體穿過該具有多個獨立中空纖維的中空纖維膜循環。最初，流 體穿過生物反應器的中空纖維膜循環，并且將細胞添加到循環的流體中。流體以第一預定 的循環速度進行循環。在循環過程中，生物反應器可處于水平位置。在通過添加至循環流體 來加載細胞后，隨著細胞流入和流出中空纖維膜的中空纖維，可允許細胞穿過系統循環并 且均勻地分布在系統中。然后，可停止循環。隨后，在重力的影響下，允許細胞沉淀，并且附 著至生物反應器中的中空纖維的第一區上。在實施方式中，可允許細胞在第一預定時間段 期間進行沉淀。在一些實施方式中，可對預定時間段進行選擇，以允許細胞附著至中空纖維 的第一區上。
[0014] 在第一預定時間段之后，使生物反應器旋轉180度。在生物反應器旋轉之后，細胞 擴增程序。如可理解的，之前附著的細胞可以在中空纖維的頂部上。當細胞擴增時，細胞可 受到重力影響，而重力可影響細胞朝中空纖維的底部生長。
[0015] 在下面的討論中，特別當與附圖一起討論時，本文中示出的實施方式的其他優點 將變得非常明顯。
【附圖說明】
[0016] 為了進一步闡明本發明的上述及其他優點和特征，將參考附圖中示出的具體實施 方式給出對本發明的更具體的描述。應理解，這些附圖僅描繪了本發明的典型實施方式，因 此不能認為限制了本發明的范圍。通過使用附圖，對本發明進行具體詳細地描述和解釋，在 附圖中：
[0017] 圖1A描繪了細胞擴增系統(CES)的一個是實施方式。
[0018] 圖1B描繪了 CES的第二實施方式。
[0019]圖1C描繪了CES的第三實施方式。
[0020] 圖1D描繪了在CES的運行過程中，旋轉或側向移動細胞生長腔室的搖動裝置的實 施方式。
[0021] 圖2A描繪了中空纖維細胞生長腔室的實施方式的側視圖。.
[0022]圖2B描繪了在圖2A中示出的中空纖維細胞生長腔室的實施方式的側剖視圖。
[0023] 圖3描繪了生物反應器的另一實施方式的側剖視圖，示出穿過生物反應器的循環 路徑。
[0024] 圖4示出根據實施方式的CES的一部分的透視圖，該CES包括可拆卸地附接的生物 反應器。
[0025] 圖5示出用于在根據實施方式的CES中擴增細胞的方法的流程圖。
[0026] 圖6示出用于加載、分布、附著和擴增細胞的程序的流程圖，在一些實施方式中，該 程序包括可在圖5示出的流程圖的方法中使用的步驟。
[0027] 圖7是用于加載、分布、附著和擴增細胞的程序的流程圖，在一些實施方式中，該程 序包括可在圖5示出的流程圖的方法中使用的步驟
[0028]圖8示出處于第一取向的生物反應器的實施方式的正視圖。
[0029]圖9示出圖8的生物反應器的正視圖，其中示出的生物反應器自圖8的視圖旋轉了 約90度。
[0030]圖10是圖8的生物反應器的正視圖，其中示出的生物反應器自圖8的視圖旋轉了約 180 度。
[0031]圖11是圖8的生物反應器的正視圖，其中示出的生物反應器旋轉回到圖8示出的初 始取向。
[0032]圖12示出圖8的生物反應器的正視圖，其中示出的生物反應器自圖8的視圖旋轉了 約90度，并且自圖9的視圖旋轉了約180度。
[0033] 圖13A至圖13C示出隨著執行在根據實施方式的生物反應器中分布、附著和擴增細 胞的程序的步驟，可作為生物反應器的部件的中空纖維的(與中心軸線垂直的)橫截面。
[0034] 圖13D和圖13E示出隨著執行在根據實施方式的生物反應器中分布、附著和擴增細 胞的程序的步驟，可作為生物反應器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線平行）。
[0035] 圖14A至圖14D示出隨著執行在根據另一實施方式的生物反應器中分布、附著和擴 增細胞的程序的步驟，可作為生物反應器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線垂直）。 [00 36]圖15A至圖15F不出隨著執行在根據又一實施方式的生物反應器中分布、附著和擴 增細胞的程序的步驟，可作為生物反應器的部件的中空纖維的橫截面(與中心軸線垂直）。
[0037]圖16示出生物反應器的橫截面，其中示出多個中空纖維和中空纖維區域，含細胞 的液體可穿過該多個中空纖維和中空纖維區域以不同的流速循環。
[0038] 圖17示出可用于實施多個實施方式的基礎計算機的框圖。
【具體實施方式】
[0039] 通過參考以下詳細描述以及附圖中描繪的實施方式，可進一步理解本發明的原 理。應當理解的是，盡管相對于【具體實施方式】，下文示出并描述了具體特征，但是本發明并 不限于下文所述的實施方式。總體來講，本公開涉及在細胞擴增系統的生物反應器中分布 多個細胞的方法。如下所述，在生物反應器中分布細胞的方法可包括:將細胞加載至生物反 應器中；使生物反應器旋轉，以及維持生物反應器靜止在特定的取向處。
[0040] 在圖1A描繪了示例性細胞擴增系統(CES)的示意圖。CES10包括第一流體循環路徑 12和第二流體循環路徑14。第一流體流動路徑16具有與中空纖維細胞生長腔室24(在本文 中也被稱為"生物反應器"）流體相連的至少相對端部18和20。具體地，相對端部18與細胞生 長腔室24的第一入口 22流體相連，而相對端部20與細胞生長腔室24的第一出口 28流體相 連。第一循環路徑12中的流體流經布置在細胞生長腔室24中的中空纖維膜的中空纖維的內 部(細胞生長腔室和中空纖維膜將在下文中進行更加詳細地描述）。此外，第一流體流動控 制器30與第一流體流動路徑16可操作地相連，并且控制第一循環路徑12中流體的流動。
[0041] 第二流體循環路徑14包括第二流體流動路徑34、細胞生長腔室24以及第二流體流 動控制器32。第二流體流動路徑34具有至少相對端部36和38。第二流體流動路徑34的相對 端部36和38分別與細胞生長腔室24的進入端口 40和排出端口 42流體相連。流經細胞生長腔 室24的流體與細胞生長腔室24中的中空纖維膜的外部相接觸。第二流體循環路徑14與第二 流體流動控制器32可操作地相連。
[0042] 因此，通過中空纖維膜，第一流體循環路徑12和第二流體循環路徑14在細胞生長 腔室24中是分離的。第一流體循環路徑12中的流體流經細胞生長腔室中的中空纖維的內毛 細管（"1C"）空間。因此，第一循環路徑12被稱為"1C環路"。第二循環路徑14中的流體流經細 胞生長腔室中的外毛細管（"EC")空間。因此，第二流體循環路徑14被稱為"EC環路"。第一流 體循環路徑12中的流體能以相對于第二流體循環路徑14中的流體流動的順流或逆流的方 向流動。
[0043]流體進入路徑44與第一流體循環路徑12流體相連。流體進入路徑44允許流體進入 第一流體循環路徑12,而流體排出路徑46允許流體離開CES10。第三流體流動控制器48與流 體進入路徑44可操作地相聯。或者，第三流體流動控制器48可與第一排出路徑46可替代地 相聯。
[0044] 本文中所使用的流體流動控制器可為栗、閥、夾具或它們的組合。多個栗、閥和夾 具可以任何的組合來布置。在各個實施方式中，流體流動控制器是蠕動栗或包括蠕動栗。在 其他實施方式中，流體循環路徑、進入端口和排出端口可以由任意材料的管子構成。
[0045] 各組件在本文中被稱為"可操作地相聯/相連"。如本文所使用的，"可操作地相聯/ 相連"是指組件以可操作的方式連接在一起，并且涵蓋其中組件直接連接的實施方式以及 其中在兩個連接的組件之間放置有額外的組件的實施方式。"可操作地相聯/相連的"組件 可為"流體相連"。"流體相連"是指將組件連接在一起，以使得能在它們之間運輸流體。"流 體相連"涵蓋其中在兩個流體相連的組件之間放置有額外的組件的實施方式，以及其中組 件之間是直接相連的實施方式。流體相連的組件可包括不與流體相接觸，而與其它組件相 接觸以操控系統的組件(例如，通過壓縮管的外部來栗送流體穿過柔性管子的蠕動栗）。
[0046]通常來講，任何類型的流體(包括緩沖液、含蛋白的流體以及含細胞的流體)都可 流經各循環路徑、進入路徑以及排出路徑。如本文所使用的，"流體"、"介質"以及"流體介 質"是可互換使用的。
[0047]圖1B描繪了更詳細的細胞擴增系統800XES800包括第一流體循環路徑802(也被 稱為"內毛細管環路"或"1C環路"），以及第二流體循環路徑804(也被稱為"外毛細管環路" 或"EC環路"）。第一流體流動路徑806通過第一流體循環路徑802與細胞生長腔室801流體相 連。流體通過1C進入端口 801A流入細胞生長腔室801，流經細胞生長腔室801中的中空纖維， 并且經由1C排出端口801B流出。壓力傳感器810測量離開細胞生長腔室801的介質的壓力。 除了壓力以外，傳感器810在實施方式中也可為在運行期間檢測介質壓力和溫度的溫度傳 感器。介質流經可用于控制介質流速(例如在1C環路中的循環速度）的1C循環栗812 JC循環 栗812可沿第一方向栗送流體，或沿與第一方向相對的第二方向栗送流體。排出端口 801B可 用作相反方向上的入口。進入IC環路802的介質可經過閥814進入。如本領域技術人員所知 曉的，可將額外的閥和/或其他裝置放置在各位置，以沿流體路徑的多個部分隔離和/或測 量介質的特性。因此，應當理解的是，示出的示意圖代表CES800的各元件的一種可能的配 置，而且對示出的示意圖的修改在一個或多個所示的實施方式的范圍內。
[0048] 對于1C環路802,可在運行期間從樣品線圈818中獲得介質樣品。隨后介質返回至 1C進入端口 801A，以完成流體循環路徑802。可將在細胞生長腔室801中生長/擴增的細胞沖 出細胞生長腔室801，通過閥898和管線897進入收獲袋899。或者，當閥898關閉時，細胞可在 腔室801內重新分布以用于進一步的生長或加載。
[0049] 第二流體循環路徑804中的流體經由EC進入端口 801C進入細胞生長腔室801，并且 經由EC排出端口 801D離開細胞生長腔室801。在EC環路804中的介質與在細胞生長腔室801 中的中空纖維的外部相接觸，從而允許小分子分散進入中空纖維內或分散出中空纖維，該 中空纖維可在腔室801內。
[0050]在介質進入細胞生長腔室801的EC空間之前，布置在第二流體循環路徑804中的壓 力/溫度傳感器824允許測量介質的壓力和溫度。在介質離開細胞生長腔室801之后，傳感器 826允許測量在第二流體循環路徑804中的介質的壓力和溫度。對于EC環路804,可在運行期 間從樣品端口 830或樣品線圈中獲得介質樣品。
[0051 ]在離開細胞生長腔室801的EC排出端口 801D之后，在第二流體循環路徑804中的流 體穿過EC循環栗828到達氣體運輸模塊832AC循環栗828也可沿相對方向栗送流體。第二流 體流動路徑822經由氣體運輸模塊832的進入端口 832A和排出端口 832B與氣體運輸模塊832 流體相連。在運行中，流體介質經由進入端口 832A流入氣體運輸模塊832中，并且經由排出 端口 832B離開氣體運輸模塊832。氣體運輸模塊832將氧加入到CES800的介質中并且去除 CES800的介質中的氣泡。在各實施方式中，在第二流體循環路徑804中的介質與進入氣體運 輸模塊832中的氣體相平衡。氣體運輸模塊832可為本領域已知的任意合適尺寸的裝置，并 且用于氧合或氣體運輸。空氣或氣體經由過濾器838流入氣體運輸模塊832,并且通過過濾 器840流出氧合器或氣體運輸裝置832。過濾器838和過濾器840降低或防止氧合器832和相 關介質的污染。在啟動順序的多個部分期間，從CES800排出的空氣或氣體可經由氣體運輸 模塊832排放到大氣中。
[0052]在描繪的CES800的配置中，在第一流體循環路徑802和第二流體循環路徑804中的 流體介質沿相同的方向（順流配置)流經細胞生長腔室801。還可將CES800配置成以逆流構 造流動。
[0053]根據至少一個實施方式，包括細胞(來自諸如細胞容器(例如袋子)的源)的介質可 附接在附接點862處，并且來自介質源的流體介質可附接在附接點846處。可經由第一流體 流動路徑806,將細胞和介質引入到第一流體循環路徑802中。附接點862經由閥864與第一 流體流動路徑806流體相連，附接點846經由閥850與第一流體流動路徑806流體相連。試劑 源可與點844流體連接，并且經由閥848與流體進入路徑842相關聯，或經由閥848和閥872與 第^流體進入路徑874相關聯。
[0054] 空氣去除腔室(ARC)856與第一循環路徑802流體相連。空氣去除腔室856可包括一 個或多個傳感器(包括上傳感器和下傳感器），以在空氣去除腔室856內的特定測量位置處 檢測空氣、流體的缺乏，和/或氣體/流體界面(例如空氣/流體界面）。例如，超聲波傳感器可 用在靠近空氣去除腔室856的底部和/或頂部處，以檢測這些位置處的空氣、流體，和/或氣 體/流體界面。在不脫離本公開的精神和范圍的情況下，實施方式提供了多種其它類型的傳 感器的應用。例如，根據本公開的實施方式，可使用光學傳感器。在啟動順序的多個部分期 間或其它方案中，從CES800中排出的空氣或氣體能夠經由管線858從空氣閥860排出進入大 氣，其中管線858與空氣去除腔室856流體相連。
[0055] EC介質源可附接至EC介質附接點868,沖洗液源可附接至沖洗液附接點866,以將 EC介質和/或沖洗液添加到第一流體流動路徑或第二流體流動路徑中。附接點866可與閥 870流體相連，其中閥870經由閥872和第一流體進入路徑842與第一流體循環路徑802流體 相連。或者，通過打開閥870和閉合閥872，附接點866可經由第二流體進入路徑874和EC進入 路徑884與第二流體循環路徑804流體相連。同樣地，附接點868與閥876流體相連，其中閥 876可經由第一流體進入路徑842和閥872與第一流體循環路徑802流體相連。或者，通過打 開閥876和閉合閥分配器872,流體容器868可與第二流體進入路徑874流體相連。
[0056] 在1C環路802中，最初可通過1C進入栗854向前推動流體。在EC環路804中，最初可 通過EC進入栗878向前推動流體。空氣檢測器880(諸如超聲波傳感器）也可與EC進入路徑 884相關聯。
[0057]在至少一個實施方式中，第一流體循環路徑802和第二流體循環路徑804與廢物管 線888連接。當閥890打開時，1C介質可流經廢物管線888，到達廢物袋886。同樣地，當閥892 打開時，EC介質可流至廢物袋886。
[0058]在細胞已經在細胞生長腔室801中生長后，可經由細胞收獲路徑897來收獲生長的 細胞。此時，在閥898是打開的情況下，可通過栗送含細胞的1C介質，使其經過細胞收獲路徑 897進入細胞收獲袋899，收獲來自細胞生長腔室801的細胞。
[0059] CES800的各組件也可被包含或封裝在機器或殼體899(諸如細胞擴增器）內，其中， 該機器將細胞和介質維持在預定溫度。進一步需要注意的是，在實施方式中，CES 800的組 件可與其它CES(諸如CES10(圖1A)或CES900(圖1C))的組件組合。在其它實施方式中，CES可 包括比圖1A至圖1C中所示出少的部件，而且這樣的實施方式仍然在本公開的范圍內。
[0060]圖1C描繪了 CES的另一實施方式。CES900包括第一流體循環路徑902(也被稱為"內 毛細管（1C)環路"）以及第二流體循環路徑904(也被稱為"外毛細管環路"或"EC環路"）。
[0061] 第一流體流動路徑906通過第一流體循環路徑902與細胞生長腔室908流體相連。 流體通過進入端口 910流入細胞生長腔室908中，流經細胞生長腔室908中的中空纖維，并且 經由排出端口 907離開。壓力計917測量離開細胞生長腔室908的介質的壓力。介質流經可用 于控制介質流速的閥913和栗911。在運行期間，可從樣品端口 905或樣品線圈909獲得介質 樣品。布置在第一流體循環路徑902中的壓力/溫度計915允許在運行期間檢測介質的壓力 和溫度。隨后，介質返回至進入端口910,以完成流體循環路徑902。可將在細胞生長腔室908 中擴增的細胞沖出細胞生長腔室908或重新分布在中空纖維中，以用于進一步的生長。 [0062] 第二流體循環路徑904包括第二流體流動路徑912,該第二流體流動路徑912與環 路中的細胞生長腔室908流體相連。第二流體循環路徑904中的流體經由進入端口 914進入 細胞生長腔室908,并且經由排出端口 916離開細胞生長腔室908。介質與細胞生長腔室908 中的中空纖維的外部相接觸，允許小分子擴散進入中空纖維和從中空纖維擴散出來。
[0063]在介質進入細胞生長腔室908的EC空間之前，布置在第二循環路徑904中的壓力/ 溫度計919允許測量介質的壓力和溫度。在介質離開細胞生長腔室908之后，壓力計921允許 測量在第二循環路徑904中的介質的壓力。
[0064]在離開細胞生長腔室908的排出端口 916之后，第二流體循環路徑904中的流體穿 過栗920和閥922到達氧合器918。第二流體流動路徑912經由氧合器進入端口 924和氧合器 排出端口926與氧合器918流體相連。在運行中，流體介質經由氧合器進入端口924流入氧合 器918中，并且經由氧合器排出端口926離開氧合器918。
[0065]氧合器918將氧加入到CES900中的介質中。在各實施方式中，第二流體循環路徑 904中的介質與進入氧合器918的氣體相平衡。氧合器可為本領域已知的任意氧合器。氣體 經由過濾器928流入氧合器918中，并且通過過濾器930流出氧合器918。過濾器928和過濾器 930降低或防止氧合器918和相關介質的污染。
[0066]在描繪的CES900的配置中，第一循環路徑902和第二循環路徑904中的流體介質沿 相同的方向（順流配置)流經細胞生長腔室908。本領域技術人員應認識到，CES900也可配置 為逆流構造。本領域技術人員應認識到，相應的進入端口和排出端口可布置在細胞生長腔 室908中的任何位置處。
[0067]可經由第一流體進入路徑932,將細胞和流體介質引入至流體循環路徑902中。流 體容器934和流體容器936分別經由閥938和閥940與第一流體進入路徑932流體相連。同樣 地，細胞容器942經由閥943與第一流體循環路徑902流體相連。在一些實施方式中，細胞和 流體可經過熱交換器944、栗946，進入滴注腔室(dr ip chamber) 948中。在來自容器942的細 胞經過熱交換器944的實施方式中，要使用額外的管線(未示出）來連接容器942和熱交換器 944。滴注腔室948與第一流體循環路徑902流體相連。來自滴注腔室948的溢出物可經由閥 952從溢出物管線950流出滴注腔室948。
[0068] 可從流體容器954和流體容器956,將額外流體添加到第一流體循環路徑902或第 二流體循環路徑904中。流體容器954與閥958流體相連，其中，閥958經由閥964、路徑960和 路徑932與第一流體循環路徑902流體相連。或者，流體容器954與第二流體進入路徑962流 體相連。同樣地，流體容器956與閥966流體相連，其中閥966經由第一流體進入路徑960與第 一流體循環路徑902流體相連。或者，流體容器956與第二流體進入路徑962流體相連。
[0069]第二流體進入路徑962被配置為，允許流體在進入滴注腔室970前流經熱交換器 944、栗968。第二流體進入路徑962延續至第二流體循環路徑904。溢出的流體可經由溢出物 管線972通過閥974流出，到達廢物容器976。
[0070] 可經由細胞收獲路徑978收獲細胞。當閥982打開時，可通過栗送含細胞的介質穿 過細胞收獲路徑978到達細胞收獲袋980，收獲來自細胞生長腔室908的細胞。
[0071] 第一流體循環路徑902和第二流體循環路徑904通過連接器路徑984相連。當閥986 打開時，介質可流經在第一循環路徑902和第二循環路徑904之間的連接器路徑984。同樣 地，栗990可將介質栗送穿過在第一流體循環路徑902和第二流體循環路徑904之間的另一 連接器路徑988。
[0072] CES900的各組件可被容納在培養箱999內。培養箱999將細胞和介質維持在恒定溫 度。
[0073]本領域技術人員應認識到，任意數目的流體容器(例如介質袋)能夠以任意組合與 CES900流體相連。還應注意到的是，滴注腔室948的位置或獨立于滴注腔室948的傳感器可 位于CES900中進入端口 910之前的任意位置處。
[0074] CES800和CES900可包括額外的組件。例如，可在CES上的蠕動栗的位置處增加一個 或多個栗環路(未示出）。栗環路可由聚氨酯(PU)(可獲自Tygothane C-210A)制成。或者，也 可包括作為一次性部件的盒子(cassette)，該盒子用于組織管線并且也可包括蠕動栗的管 道環路。
[0075] 在一些實施方式中還可提供可拆卸的流動線路(本文中也可稱為"可拆卸的循環 模塊"）。可拆卸的流動線路可為細胞擴增模塊的一部分，該細胞擴增模塊被配置為附接至 CES的更永久的固定部件。通常來講，CES的固定部件包括蠕動栗。在各實施方式中，CES的固 定部件可包括閥和/或夾具。
[0076] 可拆卸的流動線路可包括具有至少兩個端部的第一流體流動路徑。第一端部被配 置為與細胞生長腔室的第一端部流體相連，第一流體流動路徑的第二端部被配置為與細胞 生長腔室的第二端部流體相連。
[0077] 同樣地，可拆卸的流動線路可包括具有至少兩個端部的第二流體流動路徑。可拆 卸的流動線路的一部分可被配置為與氧合器和/或生物反應器流體相連。可拆卸的流動線 路可包括被配置為與氧合器和細胞生長腔室流體相連的第二流體流動路徑。
[0078] 在各實施方式中，可拆卸的流動線路可拆卸地且一次性地安裝至流體流動控制 器。可拆卸的流動線路可包括與CES的多個部件連接的可拆卸的流體導管(例如柔性管子）。
[0079] 在其他實施方式中，可拆卸的流動線路可包括細胞生長腔室、氧合器以及用于容 納介質和細胞的袋子。在各實施方式中，多個組件可連接在一起，或是相互隔開的。或者，可 拆卸的流動線路可包括被配置為與流體流通控制器(諸如閥、栗及其組合)附接的一個或多 個部分。在使用蠕動栗的變形中，可拆卸的線路模塊可包括蠕動環路，該蠕動環路被配置為 環繞管道的蠕動部分安裝。在各實施方式中，蠕動環路可被配置為與循環路徑、進入路徑和 排出路徑流體相連。可拆卸的流動線路也可組合在套件(kit)中，該套件具有將它組裝或附 接至流體流動控制器(諸如栗和閥）的說明書。
[0080] 實施方式提供了使用許多不同的方法將細胞引入至CES的生物反應器中。如下文 中進行的更詳細地描述，實施方式包括在生物反應器中分布細胞以促進細胞一致擴增的方 法和系統。
[0081]根據實施方式，細胞可在1C環路或EC環路中生長（"擴增"）。貼壁細胞和非貼壁的 懸浮細胞都可進行擴增。在一個實施方式中，細胞生長腔室纖維的管腔可涂覆有纖連蛋白。 將無二價陽離子(例如，無鈣和鎂）的PBS加入至CES系統中。在將貼壁細胞引入至細胞生長 腔室，例如腔室24、801或908中之后，將它們孵育足夠長的時間以使它們附著至中空纖維。 循環1C介質和EC介質，以確保為細胞供應足夠的營養。
[0082] 可將1C環路和EC環路的流速調節至特定值。在各實施方式中，可將1C環路和EC環 路的流速獨立地設置為約2mL/分鐘、約4mL/分鐘、約6mL/分鐘、約8mL/分鐘、約10mL/分鐘、 約15mL/分鐘、約20mL/分鐘、約25mL/分鐘、約30mL/分鐘、約35mL/分鐘、約40mL/分鐘、約 45mL/分鐘、約50mL/分鐘、約60mL/分鐘、約70mL/分鐘、約80mL/分鐘、約90mL/分鐘、約 100mL/分鐘、約200mL/分鐘、約300mL/分鐘、約400mL/分鐘或約500mL/分鐘。在各實施方式 中，可將1C線路環路的流速設置為約10mL/分鐘至約20mL/分鐘，可將EC線路環路的流速設 置為20mL/分鐘至約30mL/分鐘（允許介質流經氧合器并且重建氧的水平）。可以較低的流速 (例如，在一些實施方式中為0. lmL/分鐘)將額外的介質栗入至CES中，以更換通過氣體交換 模塊(諸如，氣體交換器/氧合器832和918)蒸發的介質。在各實施方式中，EC環路去除細胞 廢物，并且1C環路在介質中包含生長因子。
[0083] CES在不同的生長條件和標準中可提供很大的靈活性。通過使介質持續循環，可以 使細胞在1C環路中保持懸浮。或者，可停止介質的循環，以使細胞沉淀。通過超濾可將新鮮 的介質加入至1C環路中，以在不去除細胞的情況下容納超額體積。EC介質的循環允許氣體、 營養物、廢棄產物進行交換，并且允許在不去除細胞的情況下添加新介質。
[0084] 擴增的細胞可包括貼壁細胞、非貼壁細胞或現有技術中的細胞的任意組合的共培 養。可在CES的實施方式中生長的細胞的非限制性實例包括(非限制性的)干細胞(例如間充 質細胞、造血細胞等）、成纖維細胞、角質細胞、祖細胞、其他完全分化的細胞，以及它們的組 合。
[0085] 在實施方式中，為了收獲貼壁細胞，可將1C介質和EC介質替換成無二價陽離子的 介質（例如，無二價陽離子的PBS)。在一個實施方式中，可將胰蛋白酶加載至第一循環路徑 中，并且與貼壁細胞一起孵育一段時間（在一些實施方式中，一起孵育約5分鐘至約10分 鐘）。隨后，可從系統中沖洗掉胰蛋白酶。通過增加流過細胞生長腔室的流速向細胞施加剪 切力，并且可將從細胞生長腔室中釋放的貼壁細胞栗入至細胞收獲袋中。
[0086] 當擴增非貼壁細胞時，可從循環1C線路沖洗出細胞。貼壁細胞保持在細胞生長腔 室中，而去除了非貼壁細胞。
[0087] CES可用于進行各種細胞擴增方法。在一個實施方式中，可擴增接種的細胞群。將 細胞引入或接種至CES中。在某些情況下，可使中空纖維的管腔處于允許細胞附著的適當條 件。隨后，將細胞加入至細胞生長腔室中，并且貼壁細胞附著至中空纖維，而非貼壁細胞(例 如造血干細胞或HSC)并不附著。可從系統中沖洗出非貼壁細胞。在孵育一段時間之后，貼壁 細胞可被釋放并收獲。
[0088] 在實施方式中，細胞擴增系統的細胞生長腔室包括中空纖維膜，中空纖維膜由將 第一流體循環路徑和第二流體循環路徑隔開的多個半通透的中空纖維組成。
[0089] CES可包括一裝置，該裝置通過將其附接至旋轉和/或側向搖動的裝置，被配置為 相對于細胞擴增系統的其它組件移動或"搖動"細胞生長腔室。圖1D示出了這樣的一個裝 置，其中，生物反應器400與兩個旋轉搖動組件和一個側向搖動組件旋轉相連。
[0090]第一旋轉搖動裝置組件402使生物反應器400繞生物反應器的中心軸線410旋轉。 生物反應器400還與側向搖動裝置404連接。旋轉搖動裝置組件402與生物反應器400旋轉相 聯。旋轉搖動裝置402隨后使生物反應器400繞生物反應器的中心軸線410旋轉。旋轉可沿順 時針方向進行或沿逆時針方向進行。生物反應器400可沿單一方向繞中心軸線410以順時針 方向或逆時針方向連續地旋轉。或者，生物反應器400可以交替的方式旋轉，繞中心軸線410 首先順時針旋轉，隨后逆時針旋轉。
[0091 ] CES還可包括第二旋轉搖動組件，該第二旋轉搖動組件使生物反應器400繞旋轉軸 線412旋轉。旋轉軸線412穿過生物反應器400的中心點并且與中心軸線410正交。生物反應 器400可沿單一方向繞旋轉軸線412以順時針方向或逆時針方向連續地旋轉。或者，生物反 應器400可以交替的方式旋轉，繞旋轉軸線412首先順時針旋轉，隨后逆時針旋轉。在各實施 方式中，生物反應器400也可繞旋轉軸線412旋轉，并且位于相對于重力的水平取向或豎直 取向上。
[0092] 側向搖動組件404與生物反應器400側向相聯。側向搖動組件404的平面沿-X方向 和-y方向側向移動。因此，隨著含細胞的介質在中空纖維中的運動，降低了細胞在生物反應 器400中的沉淀。
[0093] 搖動裝置的旋轉運動和/或側向移動可降低裝置內細胞的沉淀并且降低細胞被捕 獲在生物反應器400的一部分內的可能性。根據斯托克（Stoke)定律，細胞在細胞生長腔室 (例如生物反應器400)中的沉淀速度與細胞和懸浮液介質之間的密度差異成比例。在某些 實施方式中，進行如上所述的重復的具有暫停的180°旋轉(快）（具有30秒的總組合時間)使 非貼壁的血紅細胞保持懸浮。在一些實施方式中，進行約180°的最小旋轉;然而，在其它實 施方式中，可利用高達360°或更大角度的旋轉。可獨立地或以任意組合使用不同的搖動組 件。例如，使生物反應器400繞中心軸線410旋轉的搖動部件可與使生物反應器400繞軸線 412旋轉的搖動組件相組合。同樣地，也可以以任意組合，獨立地進行繞不同軸線的順時針 旋轉和逆時針旋轉。
[0094] 應注意，上述搖動裝置和它們的組件可應用在使用任意適當結構的實施方式中。 例如，在實施方式中，一個或多個馬達可用作搖動裝置，或搖動裝置的組件（例如402和 404)。在一個實施方式中，搖動裝置可使用于2013年3月19日遞交的美國專利8，339，245，名 稱為《細胞擴增系統的細胞生長腔室的旋轉系統及其使用方法（ROTATION SYSTEM FOR CELL GROWTH CHAMBER OF A CELL EXPANSION SYSTEM AND METHOD OF USE THEREFOR)》中 示出和描述的實施方式中的搖動裝置，該專利通過引用而整體并入本文中，就如其全文呈 現在本申請中一樣。
[0095]圖2B和圖2A中描繪了細胞生長腔室的實施方式，其中描繪了中空纖維細胞生長腔 室200(可被稱為"生物反應器"）的側剖視圖和側視圖。細胞生長腔室200被裝在細胞生長腔 室殼體202中。細胞生長腔室殼體202進一步包括四個開口或端口：進入端口 204、排出端口 206、進入端口 208和排出端口 210。
[0096]第一循環路徑中的流體通過進入端口 204進入細胞生長腔室200，進入且穿過多個 中空纖維212的內毛細管側（在各實施方式中被稱為，中空纖維膜的內毛細管（"1C"）側或 "1C空間"），并且通過排出端口206流出細胞生長腔室200。術語"中空纖維"、"中空纖維毛細 管"以及"毛細管"可互換使用。多個中空纖維212-起被稱為"膜"。第二循環路徑中的流體 通過進入端口 208流入細胞生長腔室中，與中空纖維212的外部(也被稱為膜的"EC側"或"EC 空間"）相接觸，并經由排出端口 210離開細胞生長腔室200。細胞可被包含在第一循環路徑 或第二循環路徑內，并且可在膜的1C側或EC側。
[0097]盡管細胞生長腔室殼體202的形狀被描繪為圓柱形，但是它可具有本領域已知的 任意形狀。細胞生長腔室殼體202可由任意類型的生物相容性聚合物材料制成。其它各種細 胞生長腔室殼體可具有不同的形狀和尺寸。
[0098] 本領域技術人員應知曉的是，術語"細胞生長腔室"并不意味著在CES中生長或擴 增的所有細胞都生長在細胞生長腔室中。在許多實施方式中，貼壁細胞可附著至布置在生 長腔室中的膜，或可生長在相關聯的管道內。非貼壁細胞(也被稱為"懸浮細胞"）也可生長。 細胞可在第一流體循環路徑或第二流體循環路徑內的其它區域中生長。
[0099] 例如，中空纖維212的端部可通過連接材料（在本文也被稱為"灌封"或"灌封材 料"）在細胞生長腔室200的側面被灌封。灌封可為用于粘合中空纖維212的任意合適的材 料，只要不阻塞介質和細胞進入中空纖維中的流動，并且穿過1C進入端口流入細胞生長腔 室200中的液體僅流入中空纖維212中。示例性的灌封材料包括但并不限于聚氨酯以及其它 合適的粘合或粘著組分。在各實施方式中，也可在每一端部通過垂直于中空纖維212的中心 軸線切割中空纖維212和灌封，以使流體流入和流出1C側。端部帽214和端部帽216被布置在 細胞生長腔室的端部。
[0100]經由進入端口 208進入細胞生長腔室200的流體與中空纖維212的外部相接觸。中 空纖維細胞生長腔室的這一部分也被稱為"外毛細管(EC)空間"。小分子(例如水、氧、乳酸 鹽等)可穿過中空纖維212從中空纖維的內部擴散至EC空間，或從EC空間擴散至1C空間。大 分子量的分子諸如生長因子通常太大而不能穿過中空纖維212,從而保持在中空纖維的1C 空間中。在細胞生長在1C空間中的實施方式中，EC空間用作介質儲存器，以為細胞供應營養 物并且除去細胞代謝的副產物。根據需要可更換介質。介質也可穿過氧合器循環，以交換所 需的氣體。
[0101] 在各實施方式中，可通過各種方法(包括注射)將細胞加載至中空纖維212中。也可 從流體容器(例如袋子），將細胞引入到細胞生長腔室中，其中該流體容器可與細胞生長腔 室流體相連。
[0102] 中空纖維212被配置為允許細胞生長在纖維的內毛細管空間（即，中空纖維管腔的 內部）中。中空纖維212足夠大，能允許細胞附著在管腔上，而基本上不阻礙介質穿過中空纖 維管腔的流動。在各實施方式中，中空纖維的內直徑可大于或等于約10000微米、約9000微 米、約8000微米、約7000微米、約6000微米、約5000微米、約4000微米、約3000微米、約2000微 米、約1000微米、約900微米、約800微米、約700微米、約650微米、約600微米、約550微米、約 500微米、約450微米、約400微米、約350微米、約300微米、約250微米、約200微米、約150微米 或甚至約100微米。同樣地，中空纖維的外直徑可小于或等于約10000微米、約9000微米、約 8000微米、約7000微米、約6000微米、約5000微米、約4000微米、約3000微米、約2000微米、約 1000微米、約900微米、約800微米、約700微米、約650微米、約700微米、約650微米、約600微 米、約550微米、約500微米、約450微米、約400微米、約350微米、約300微米、約250微米、約 200微米、約150微米或甚至約100微米。在一些實施方式中，中空纖維壁的厚度應當足以允 許小分子進行擴散。
[0103]只要中空纖維能與細胞生長腔室的進入端口和排出端口流體相連，則可在細胞生 長腔室中使用任意數目的中空纖維。在各實施方式中，細胞生長腔室可包括數目大于或等 于約 1000、約 2000、約 3000、約 4000、約 5000、約 6000、約 7000、約 8000、約 9000、約 10000、約 11000或約12000個中空纖維。在其它實施方式中，細胞生長腔室可包括數目小于或等于約 12000、約11000、約 10000、約 9000、約 8000、約 7000、約 6000、約 5000、約 4000、約 3000 或甚至 約2000個中空纖維。在其它各實施方式中，中空纖維的長度可大于或等于約100毫米、約200 毫米、約300毫米、約400毫米、約500毫米、約600毫米、約700毫米、約800毫米或約900毫米。 在實施方式中，細胞生長腔室含有約9000個中空纖維，這些中空纖維具有約295_的平均長 度、215微米的平均內直徑以及315微米的平均外直徑。
[0104]中空纖維可由任何能形成如下尺寸的材料構成，該尺寸足以形成能夠將液體從細 胞生長腔室進入端口運輸至細胞生長腔室排出端口的纖維。在各實施方式中，中空纖維可 由塑料附著材料構成，該塑料附著材料能夠粘合某些種類的細胞，諸如貼壁干細胞(例如 MSC)。在各其它實施方式中，中空纖維可經諸如纖連蛋白的化合物進行處理，以形成附著表 面。
[0105] 在某些實施方式中，中空纖維可由半通透的生物相容性聚合材料制成。這樣的一 種可使用的聚合材料為聚酰胺、聚芳醚砜和聚乙烯吡咯烷酮的共混物(在本文中也被稱為 "PA/PAES/PVP"）。半通透膜允許營養物、廢物和溶解的氣體穿過在EC空間和IC空間之間的 膜進行轉移。在各實施方式中，選擇中空纖維膜的分子轉移特性，以最大限度地降低從中空 纖維中丟失細胞生長所必需的昂貴試劑(諸如生長因子、細胞因子），同時允許代謝廢棄產 物穿過膜擴散進入中空纖維管腔側而被去除。
[0106] 在某些變型中，每一PA/PAES/PVP中空纖維的一個外層的特征在于，具有限定表面 粗糙度的均勻且開孔的結構。孔的開口尺寸可在約0.5微米至3微米的范圍內，并且在纖維 外表面上的孔的數目可在約10000個孔/mm 2至約150000個孔/mm2的范圍內。該外層具有約1 微米至約10微米的厚度。在每個中空纖維中的下一層為具有海綿結構形式的第二層，并且 在實施方式中具有約1微米至約15微米的厚度。該第二層可用作外層的支撐。緊挨著第二層 的第三層可具有指狀結構的形式。該第三層提供了機械穩定性和高孔隙體積，使得膜在穿 過膜運輸分子時具有較低的阻力。在使用期間，指狀孔隙充滿流體，并且與具有較低空隙體 積的海綿填充結構的基質相比，該流體為擴散和對流給出了較低的阻力。該第三層可具有 約20微米至約60微米的厚度。
[0107] 在進一步的實施方式中，中空纖維膜可包括在約65wt%至95wt%之間的至少一種 疏水性聚合物，以及在約5wt %至約35wt %之間的至少一種親水性聚合物。疏水性聚合物可 選自由聚酰胺（PA)、聚芳酰胺(PAA)、聚芳醚砜(PAES)、聚醚砜(PES)、聚砜(PSU)、聚芳砜 (PASU)、聚碳酸酯(PC)、聚醚、聚氨酯(PUR)、聚醚酰亞胺，以及任意上述聚合物的共聚物混 合物(諸如聚醚砜，或聚芳醚砜和聚酰胺的混合物)所組成的組。在進一步的實施方式中，親 水性聚合物可選自由聚乙烯吡咯烷酮(PVP )、聚乙二醇(PEG )、聚乙二醇單酯、水溶性纖維衍 生物、聚山梨醇酯和聚乙烯-聚丙烯氧化物共聚物所組成的組。
[0108]根據要在細胞生長腔室中擴增的細胞的類型，可使用諸如纖連蛋白的物質對聚合 物纖維進行處理，以增強細胞生長和/或細胞對膜的附著。
[0109] 現參考圖3,示出了另一細胞生長腔室的實施例，生物反應器300的側剖視圖。生物 反應器300具有縱軸線LA-LA，并且包括生物反應器殼體304。在至少一個實施方式中，生物 反應器殼體304包括四個開口或端口 ： 1C進入端口 308、1C排出端口320、EC進入端口 328以及 EC排出端口 332。
[0110] 第一循環路徑中的流體通過在生物反應器300的第一縱向端部312處的1C進入端 口 308進入生物反應器300,進入且穿過多個中空纖維316的內毛細管側(在各種實施方式中 被稱為中空纖維膜的內毛細管（"1C"）側或"1C空間"）并且通過位于生物反應器300的第二 縱向端部324處的1C排出端口 320流出生物反應器300。第二循環路徑中的流體通過EC進入 端口328流入生物反應器300中，與中空纖維316的外毛細管側或外部(也被稱為膜的"EC側" 或"EC空間"）相接觸，并且經由EC排出端口 332離開生物反應器300。經由EC進入端口 328進 入生物反應器的流體與中空纖維的外部相接觸。小分子(例如水、氧、乳酸鹽等)可穿過中空 纖維從中空纖維的內部擴散至EC空間，或從EC空間擴散至1C空間。大分子量的分子諸如生 長因子通常太大而不能穿過中空纖維，從而保持在中空纖維的1C空間內。可以根據需要更 換介質。介質也可穿過氧合器循環，以交換所需的氣體。細胞也可被包含在第一循環路徑 和/或第二循環路徑中，并且可在膜的1C側和/或EC側。通過示例性且非限制性的方式，在一 個實施方式中，生物反應器300可包括約11520個具有215X 10_6m的內直徑(ID)的纖維。
[0111] 盡管生物反應器殼體304被描繪為圓柱形，但是其可具有各種形狀，諸如長方體。 生物反應器殼體304可由任意類型的生物相容性聚合物材料制成，包括基本透明的材料，以 允許觀察者觀察多個中空纖維316中的一個或多個以及在生物反應器殼體304內的流體。各 種其它的生物反應器殼體可具有不同的形狀和尺寸。
[0112] 現在參考圖4,示出了CES430的一部分的透視圖，該CES430的一部分包括CES430的 主體408的后部434。為了清晰起見，主體408的前部未示出，然而，前部諸如通過鉸鏈438附 接至后部434，從而允許前部包括門或艙口，可打開該門或艙口以進入CES430的生物反應器 300。管道和取樣端口 420的線管416可附接至生物反應器300。在生物反應器300附近的環境 為溫控的，以為細胞生長提供合適的條件。
[0113] 現在參考圖5,示出了描述與使用CES相關的細胞擴增程序的一個實施方式的流程 圖500,其中包括與在生物反應器(例如生物反應器300)中加載和分布細胞相關的步驟，下 面將進行進一步描述。盡管CES(例如CES430)的特征被描述為執行流程圖500的一些步驟， 但是本發明并不限于此。事實上，一些實施方式中，可利用具有不同的特征的其它CES，這些 特征未在本文中描述或在上面描述(例如CES10、CES800或CES900)。因此，參考CES430(諸如 生物反應器300)的特征僅提供用于解釋說明的目的，流程圖500并不限于用于任何特定的 CES〇
[0114] 流程圖500起始于502并且轉到504,其中生物反應器300和任意相關聯的管道以及 相關的結構與主體408連接，以提供可操作的CES430。一旦與主體408連接，在508處，利用合 適的預補液(priming fluid)(諸如生理鹽水）啟動生物反應器300和其相關聯的管道和相 關的結構。在512處，將細胞加載到生物反應器300中，并且進行分布。
[0115] 在實施方式中，細胞的加載和分布涉及許多子步驟，例如，在一些實施方式中，步 驟512額外地包括可選子步驟:在可選子步驟516處，使生物反應器300定向在第一取向；隨 后，在可選子步驟520處，將細胞加載到生物反應器300中并且進行分布。在可選子步驟524 處，可允許細胞附著至生物反應器。
[0116] 將細胞加載到生物反應器300中并且進行分布之后，在528處細胞進行擴增。也就 是說，允許生物反應器300中的細胞進行擴增，即生長和/或增殖。在532處，對是否需要將額 外的細胞加入至生物反應器300中，和/或是否需要旋轉生物反應器300以在生物反應器300 內分布細胞進行評價。如果需要將額外的細胞加載至生物反應器300中，和/或如果需要在 生物反應器300中進行細胞的分布，則隨后流程圖500返回至步驟512。如果不需要加入細胞 和/或不需要旋轉生物反應器300,則在536處對細胞擴增程序528是否完成進行評價。如本 文所使用的，如果已經達到了足夠數目的細胞和/或已經實現了細胞特性的改變，則確定細 胞擴增程序完成。如果細胞擴增程序528完成，則在540處收獲細胞。如果細胞擴增程序528 沒有完成，則隨后允許在528處繼續進行細胞擴增程序。流程圖500終止于544。
[0117] 現在將提供與程序有關的其他細節，該程序在一些實施方式中，可用于在生物反 應器和CES中加載、分布和擴增細胞，例如步驟512和步驟528(圖5)。圖6和圖7示出可用于加 載、分布、附著和擴增細胞的一些程序的流程圖。可作為流程圖500的程序的一部分進行這 些程序，例如上述步驟(例如步驟512和步驟528)的子步驟。在其他實施方式中，可在不考慮 流程圖500中所述步驟的情況下，執行流程圖600和流程圖700所述的程序。此外，下面可將 流程圖600和流程圖700中的步驟描述為通過CES或其部分(例如CES10、CES800、CES900)來 執行或關于CES或其部分（例如CES10、CES800、CES900)來執行，其中CES或其部分（例如 CES10、CES800、CES900)包括多個組件(例如用作搖動組件402和搖動組件404的馬達）、生物 反應器(例如生物反應器24、生物反應器300、生物反應器400、生物反應器801或生物反應器 908)，或生物反應器的多個部件。本說明書并不在于限制流程圖600和流程圖700,在實施方 式中，流程圖600和流程圖700的步驟可通過或關于其他系統、裝置、組件或零件來執行。
[0118] 流程圖600起始于604,并且轉到步驟608,在步驟608中含細胞的流體可穿過生物 反應器(諸如生物反應器300)(參見圖3和圖8~圖12)循環。在實施方式中，步驟608可涉及 啟動一個或多個栗，以使流體穿過生物反應器300循環。例如，可啟動1C循環栗(例如812或 911)，以使流體以第一循環流速穿過生物反應器300的1C側循環。在至少一個實施方式中， 攜帶細胞的流體可從1C側經過生物反應器300的中空纖維流至EC側。在其他實施方式中，可 將細胞加載到生物反應器300的EC側中，并且使攜帶細胞的流體從EC側流至1C側。在這些實 施方式中，可啟動EC循環栗(例如828或974)，以使流體以第一循環流速穿過生物反應器300 的EC側
[0119] 在一些實施方式中，步驟608還可涉及使生物反應器300以特定順序旋轉，輔助細 胞穿過生物反應器300和可與生物反應器300流體相連的CES的循環路徑進行分布。在于 2010年12月15日遞交的美國專利申請序列號12/968,483,名稱為"在細胞擴增系統的生物 反應器中加載和分布細胞的方法（METHOD OF LOADING AND DISTRIBUTING CELLS IN A BIOREACTOR OF A CELL EXPANSION SYSTEM)"中描述了用于使生物反應器300以特定順序 旋轉以在循環或加載過程中輔助細胞分布的實施方式的實例，該專利申請通過引用整體并 入本文中，就如其全文呈現在本申請中一樣。在其他實施方式中，循環步驟608可涉及在一 些時間段中使生物反應器300旋轉，而在其他時間段中使生物反應器300維持靜止。
[0120] 在步驟608之后，在步驟612降低流體循環速度。可將循環速度降低至約零(0)ml/ min，或者在其他實施方式中，可將循環速度降低至高于零(0)ml/min，但仍然允許細胞沉淀 并且附著至生物反應器300(例如生物反應器300的中空纖維316的內表面）的速度。在實施 方式中，步驟612可涉及停止或關閉一個或多個在步驟608中使用以使流體循環的栗。
[0121] 流程從步驟612轉到可選步驟616,可執行可選步驟616以將生物反應器(例如生物 反應器300)的方向調整至初始取向。在實施方式中，可能已經將生物反應器調整為初始取 向，這樣使得步驟616是不必要的。當執行時，可通過實施方式中的一個或多個馬達執行步 驟 616。
[0122] 現在參考圖8~圖12,圖8中示出的生物反應器300位于初始取向。作為可選步驟 616的一部分，可以使生物反應器300處于起始取向的縱向軸線LA-LA來定向，所述起始取向 例如如圖8中示出的第一水平取向。
[0123] 流程從步驟616轉到步驟620,在步驟620中，將生物反應器維持在第一取向以允許 細胞沉淀，并且在一些實施方式中，允許細胞附著至生物反應器300的第一區。執行步驟 620,持續第一預定時間段。
[0124] 現在參考圖13A~圖13C，這些附圖示出中空纖維1300的（取與中空纖維1300的中 心軸線和生物反應器300的中心軸線垂直的）橫截面，該中空纖維1300可以是生物反應器 300的中空纖維316中的一個。這些附圖示出在流程圖600的一些步驟期間，細胞在中空纖維 316內的可能的位置。如圖13A所示，在實施方式中，在步驟612處降低循環速度之前，各中空 纖維1300內的細胞可均勻分布在中空纖維1300容積的各個部分中。當降低循環速度時，細 胞開始受到重力1304的影響，并且開始沉淀。
[0125] 在實施方式中，隨著生物反應器300處于第一水平取向（圖8)，允許生物反應器300 內的細胞沉淀在生物反應器的第一區上。如圖13B所示，生物反應器300的第一區可至少包 括中空纖維1300的區1308。在實施方式中，允許細胞沉淀第一預定時間段(流程圖600的步 驟620)，可對該第一預定時間段進行選擇，使得不僅允許細胞沉淀，而且還允許細胞附著至 中空纖維1300的區1308。
[0126] 在一些實施方式中，第一預定時間段可以持續足夠長的時間，以僅允許細胞沉淀 和附著至區1308。在這些實施方式中，細胞可僅需要移動中空纖維1308的內徑的距離。例 如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內徑的實施方式中，第一預定時間段可 小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實施方式中，第一預定時間段可 大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個實施方式中，第一時 間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0127] 在其他實施方式中，第一預定時間段可以持續足夠長的時間，以不僅允許細胞沉 淀而且還允許細胞附著至中空纖維，該第一預定時間段可持續足夠長的時間以允許附著的 細胞生長。在這些實施方式中，細胞可側向生長。因為任一側向可提供最小的阻力。換句話 說，因為如果在區1308上的細胞在纖維壁上朝上生長的話，則這些細胞要對抗重力1304進 行生長，因此相信在一些實施方式中，這些細胞至少最初是側向生長的。在這些實施方式 中，當允許細胞在附著之后進行生長時，第一預定時間段可大于約5小時、大于約10小時、大 于約15小時、大于約20小時或甚至大于約24小時。在其他實施方式中，第一預定時間段可小 于約60小時、小于約55小時、小于約50小時或甚至小于約45小時。在一個實施方式中，上述 預定時間段可在約1 〇小時至約48小時之間。
[0128] 重新參考圖6，在一些實施方式中，在步驟620之后，流程轉到步驟640，在步驟640 中，生物反應器300從第一水平取向旋轉約180度至第二水平取向。如圖8~圖10所示，可通 過首先從第一水平取向（圖8)旋轉至距第一水平取向約90度的第一豎直取向，例如軸線LA-LA 處于豎直取向 （圖 9)，來旋轉生物反應器。然后，將生物反應器 300 再旋轉 90度 （圖 10)， 以 完成到第二水平取向的旋轉。
[0129] 在實施方式中，在旋轉到第二水平取向之后，流程600可轉到步驟644，在步驟644 中，在生物反應器300處于第二水平取向的同時，進行細胞擴增。圖13C示出在第二水平取向 時，附著至中空纖維1300的細胞現在位于中空纖維1300的內側頂部。步驟644可涉及一些子 步驟，諸如將流體循環到生物反應器中，以為附著在生物反應器中的細胞供給和提供營養。 可以理解的是，步驟644還可涉及為細胞提供氧氣，以便它們能夠增殖。可控制生物反應器 中的幾種其他參數，以優化擴增，即細胞的生長。在一些實施方式中，步驟644可包括使流體 持續循環約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或甚至約72小時，以飼養細胞。在一些實 施方式中，作為步驟644的一部分，細胞的飼養可持續小于約120小時、小于約108小時、小于 約96小時、小于約84小時或甚至小于約72小時。然后，流程600可終止于648。
[0130] 在不受到理論束縛的情況下，相信在實施方式中，如果細胞如圖13C所示在重力影 響下生長，則能改善細胞擴增。在實施方式中，細胞可在中空纖維1300中向下生長，朝中空 纖維中還沒有細胞的部分生長。相信細胞可朝纖維中提供最小阻力的部分（諸如在頂部 1308下面的部分，參見圖13C)生長。在實施方式中，與傳統工藝相比，在重力影響下的生長 改善了細胞產量，并且縮短了細胞倍增的時間。
[0131] 在其他實施方式中，流程600可包括額外的步驟。例如，在一些實施方式中，在步驟 620之后，流程600可轉到步驟624，在步驟624中，可將生物反應器628旋轉至豎直取向。例 如，如圖9所示，可將生物反應器300旋轉至第一豎直取向。在步驟624之后，流程可轉到步驟 628,在步驟628中，可使生物反應器在第一豎直取向上維持第二預定時間段。
[0132] 現在參考圖13D和圖13E，這些圖示出中空纖維1300的（取與中空纖維1300的中心 軸線和生物反應器300的中心軸線平行的）橫截面，該中空纖維1300可以是生物反應器300 的中空纖維316中的一個。圖13D和圖13E示出在步驟620之后的中空纖維1300,其中細胞已 經沉淀且附著至纖維1300的一部分上。如圖13D所示，當生物反應器300旋轉至第一豎直取 向時，中空纖維1300的第一端部1312位于第二端部1316的上面。
[0133] 如上所述，在不受到理論束縛的情況下，相信附著至纖維1300的細胞將受到重力 1304的影響，開始生長，即朝端部1316縱向擴增。因此，在實施方式中，持續第二預定時間段 執行步驟628(維持第一豎直取向），該第二預定時間短可持續足夠長的時間以允許細胞縱 向生長。在一些實施方式中，第二預定時間段可大于約5小時、大于約10小時、大于約15小 時、大于約20小時或甚至大于約24小時。在其他實施方式中，第二預定時間段可小于約60小 時、小于約55小時、小于約50小時或甚至小于約45小時。在一個實施方式中，上述預定時間 段可在約10小時至約48小時之間。
[0134] 在步驟628之后，流程可轉到步驟632,在步驟632中，可將生物反應器旋轉至第二 豎直取向。圖12中示出處于第二豎直取向的生物反應器300的一個實例。在步驟624之后，流 程可轉到步驟636,在步驟636中，可使生物反應器在第二豎直取向上維持第三預定時間段。
[0135] 參考圖13E，該圖示出在步驟632之后的中空纖維1300,其中細胞已經沉淀且附著 至中空纖維1300的一部分上，并且已經使生物反應器300從第一豎直取向旋轉至第二豎直 取向并且維持在第二豎直取向上。如圖13E所示，當使生物反應器300旋轉至第二豎直取向 時，中空纖維1300的第一端部1312位于第二端部1316的下面。
[0136] 與步驟628(維持第一豎直取向）相似，執行步驟636(維持第二豎直取向），因為相 信在實施方式中，附著至纖維1300的細胞將受到重力1304的影響，開始生長，即朝端部1312 縱向擴增。在實施方式中，如圖13E所示，可執行步驟636,持續第三預定時間段，該第三預定 時間段可持續足夠長的時間以允許細胞朝端部1312縱向生長。在一些實施方式中，第三預 定時間段可大于約5小時、大于約10小時、大于約15小時、大于約20小時或甚至大于約24小 時。在其他實施方式中，第二預定時間段可小于約60小時、小于約55小時、小于約50小時或 甚至小于約45小時。在一個實施方式中，上述預定時間段可在約10小時至約48小時之間。
[0137] 重新參考流程圖600，在步驟636之后，流程可轉到步驟640，在步驟640中，如上所 述，可使生物反應器旋轉到如圖11所示的第二水平位置。如上所述，流程600從步驟640轉到 644，在644中，細胞進行擴增，即增殖。然后，流程終止于648。
[0138] 現在轉到圖7,流程700在704開始，然后轉到步驟708,在步驟708中，含細胞的流體 可穿過生物反應器(諸如生物反應器300)進行循環(參見圖3和圖8~圖12)。在實施方式中， 步驟708可包括啟動一個或多個栗，以使流體穿過生物反應器300循環。例如，可啟動1C循環 栗(例如812或911)，以使流體以第一循環流速穿過生物反應器300的1C側循環。在至少一個 實施方式中，攜帶細胞的流體可經過生物反應器300的中空纖維從1C側流到EC側。在其他實 施方式中，可將細胞加載到生物反應器300的EC側中，并且使攜帶細胞的流體從EC側流到1C 側。在這些實施方式中，可啟動EC循環栗(例如828或974)，以使流體以第一循環流速穿過生 物反應器300的EC側循環。
[0139] 在實施方式中，第一循環流速可以是相對較高的流速。在實施方式中，第一循環流 速可小于約500ml/min、小于約400ml/min或甚至小于約300ml/min。在其他實施方式中，第 一循環速度可大于約50ml/min、大于約100ml/min或甚至大于約150ml/min。在一個實施方 式中，第一循環流速在約l〇〇ml/min至約300ml/min之間，諸如約200ml/min。
[0140] 在一些實施方式中，步驟708可還涉及使生物反應器300以特定順序旋轉，以促使 細胞穿過生物反應器300和CES的循環路徑進行分布，其中生物反應器300可與CES的循環路 徑流體相連。在其他實施方式中，循環步驟708可涉及使生物反應器300在一些時間段中旋 轉，但使生物反應器300在其他時間段中保持靜止。
[0141] 在步驟708之后，在步驟712處降低流體循環速度。可將循環速度降低至約零(0) ml/min，或者在其他實施方式中，可將循環速度降低至大于零(0)ml/min但仍允許細胞沉淀 且附著至生物反應器300,例如生物反應器300的中空纖維316的內表面的速度。在實施方式 中，步驟712可涉及停止或關閉在步驟708中用于使流體循環的一個或多個栗。
[0142] 流程從步驟712轉到可選步驟716,執行可選步驟716以將生物反應器(例如生物反 應器300)的方向調整為初始取向。在實施方式中，生物反應器可能已經處于初始取向，這樣 就不需要執行步驟716。在一些實施方式中，當執行步驟716時，可通過一個或多個馬達執行 步驟716。
[0143] 現在參考圖8~圖12,在圖8中示出的生物反應器300位于初始取向。作為可選步驟 716的一部分，可使生物反應器300的縱向軸線LA-LA處于起始取向，例如如圖8所示的水平 取向。
[0144] 流程從716轉到步驟720，在步驟720中，使生物反應器維持在第一取向上以允許細 胞沉淀，并且在一些實施方式中附著至生物反應器300的第一部分。執行步驟820,持續第一 預定時間段。
[0145] 現在參考圖14A~圖14D和圖15A~圖15F，這些附圖示出中空纖維1400的（取與中 空纖維1400的中心軸線和生物反應器300的中心軸線垂直的)橫截面，該中空纖維1400可以 是生物反應器300的中空纖維316中的一個。這些附圖示出在流程圖700的一些步驟期間，細 胞在中空纖維316內的可能的位置。如圖14A所示，在實施方式中，在步驟712處降低循環速 度之前，各中空纖維1400內的細胞可均勻分布在中空纖維1400的整個體積。當降低循環速 度時，細胞開始受到重力1404的影響，開始沉淀。圖15A也示出對于中空纖維1500和重力 1504的類似的情況。
[0146] 在實施方式中，隨著生物反應器300處于第一水平取向（圖8)，允許生物反應器300 內的細胞沉淀在生物反應器的第一區上。如圖14B和圖15B所示，生物反應器300的第一區可 至少包括中空纖維1400的區1408和/或中空纖維1500中的區1508。在實施方式中，允許細胞 沉淀第一預定時間段，可對該第一預定時間段進行選擇，使得不僅允許細胞沉淀，而且還允 許細胞附著至中空纖維1400的區1408 (和中空纖維1500的區1508)。
[0147] 在一些實施方式中，第一預定時間段可以持續足夠長的時間，以允許細胞沉淀和 附著至區1408和區1508。在這些實施方式中，細胞可僅需要移動中空纖維1400或中空纖維 1500的內徑的距離。例如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內徑的實施方式 中，第一預定時間段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實施方式 中，第一預定時間段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一 個實施方式中，第一時間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0148] 在步驟720之后，流程轉到步驟724，在步驟724中，可使生物反應器300自第一水平 取向旋轉約180度至第二水平取向。如圖8~圖10所示，可通過首先從其第一水平取向（圖8) 旋轉至距第一水平取向約90度的第一豎直取向，例如軸線LA-LA處于豎直取向（圖9)，來旋 轉生物反應器。然后，將生物反應器300再旋轉90度（圖10)，以完成到第二水平取向的旋轉。 在一些實施方式中，可通過與生物反應器300連接的一個或多個馬達來執行步驟724。這些 馬達可以是搖動裝置的一部分。
[0149] 在一些實施方式中，流程700從步驟724轉到步驟736,在步驟736中，將生物反應器 300在第二水平取向（圖10)上維持第二預定時間段，以允許細胞沉淀至生物反應器的第二 區，諸如中空纖維1400的區1412(圖14C)或中空纖維1500的區1512(圖15C)。
[0150] 在一些實施方式中，在步驟736之前，流程700可包括可選的步驟728和步驟732。與 步驟708類似，步驟728使流體穿過生物反應器300循環。在實施方式中，步驟728可涉及啟動 一個或多個栗，以使流體穿過生物反應器300循環。如上所述，可啟動1C循環栗(例如812或 911)，以使流體以第二循環流速穿過生物反應器300的1C側循環。在至少一個實施方式中， 攜帶細胞的流體可經過生物反應器300的中空纖維從1C側流到EC側。在其他實施方式中，可 將細胞加載到生物反應器300的EC側中，并且使攜帶細胞的流體從EC側流到1C側。在這些實 施方式中，可啟動EC循環栗(例如828或974)，以使流體以第二循環流速穿過生物反應器300 的EC側循環。
[0151] 在實施方式中，第二循環流速可小于第一循環速度。在實施方式中，第二循環流速 可小于約400ml/min、小于約300ml/min或甚至小于約200ml/min。在其他實施方式中，第二 循環速度可大于約25ml/min、大于約500ml/min或甚至大于約75ml/min。在一個實施方式 中，第二循環流速在約50ml/min至約150ml/min之間，諸如約100ml/min。
[0152] 在一些實施方式中，步驟728可還涉及以與步驟708中的循環方向不同的方向進行 循環。換句話說，在一些實施方式中，步驟708可涉及使流體以逆時針方向循環(參見圖8和 圖9中的1C環路）。在一些實施方式中，在步驟728處的循環可以是順時針的。換句話說，上述 循環可以與步驟708處的循環相反地流動。在其他實施方式中，步驟708中的循環可以與步 驟708相同的方向，順時針或逆時針流動。
[0153] 在一些實施方式中，可選步驟728還涉及使生物反應器300以特定順序旋轉，以促 使細胞穿過生物反應器300和CES的循環路徑進行分布，其中生物反應器300可與CES的循環 路徑流體相連。在其他實施方式中，循環步驟728可涉及使生物反應器300在一些時間段中 旋轉，但使生物反應器300在其他時間段中保持靜止。
[0154] 在可選步驟728之后，在步驟732處再一次降低流體循環速度。可將循環速度降低 至約零(〇)ml/min，或者在其他實施方式中，可將循環速度降低至大于零(0)ml/min但仍允 許細胞沉淀且附著至生物反應器300，例如生物反應器300的中空纖維316的內表面的速度。 在實施方式中，步驟732可涉及停止或關閉在步驟728中用于使流體循環的一個或多個栗。
[0155] 再一次參考步驟736,使生物反應器維持在第二水平取向允許細胞沉淀在可與區 1408相對的區1412(或圖15C的1512)上，例如可將區1408(或1508)稱為"底部"，而將區1412 (或圖15C中的1512)稱為"頂部"。圖14C和圖15C示出細胞沉淀在區1412和區1512上，或者在 一些實施方式中相反。在實施方式中，允許細胞沉淀第二預定時間段，可對第二預定時間段 進行選擇，以不僅允許細胞沉淀，而且還允許細胞附著至中空纖維1400的區1412(或纖維 1500的1512)。
[0156] 在一些實施方式中，第二預定時間段可以持續足夠長的時間，以允許細胞沉淀且 附著至區1412(或圖15C中1512)。在這些實施方式中，細胞可僅需要移動中空纖維1400或中 空纖維1500的內徑的距離。例如，在中空纖維具有約150微米至約300微米之間的內徑的實 施方式中，第二預定時間段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實 施方式中，第二預定時間段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分 鐘。在一個實施方式中，第二時間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0157] 在一些實施方式中，在步驟736之后，流程700可轉到步驟772,在步驟772中，細胞 進行擴增。步驟772可涉及許多子步驟，諸如使流體循環到生物反應器中，以為附著在生物 反應器中的細胞供給和提供營養。可以理解的是，步驟772還可涉及為細胞提供氧氣，以便 它們能夠增殖。可控制生物反應器中的幾種其他參數，以優化擴增，即細胞的生長。在一些 實施方式中，步驟772可包括使流體持續循環約24小時、約36小時、約48小時、約60小時或甚 至約72小時以飼養細胞。在一些實施方式中，作為步驟772的一部分，細胞的飼養可持續小 于約120小時、小于約108小時、小于約96小時、小于約84小時或甚至小于約72小時。然后，流 程終止于776。
[0158] 在其他實施方式中，流程700可轉到步驟740，在步驟740中，生物反應器300旋轉回 到其初始的第一水平取向。圖11示出已經旋轉回到其第一水平取向的生物反應器300。可通 過與生物反應器300連接的一個或多個馬達執行步驟740。這些馬達可以是搖動裝置的一部 分。在實施方式中，流程可從步驟740轉到步驟772,在步驟772中，細胞進行擴增。然后，流程 終止于776。
[0159]在其他實施方式中，流程700從步驟740轉到步驟744,或在其他實施方式中，流程 可直接從步驟736轉到步驟744(當不執行額外旋轉時），其中使流體以第三循環流速再次循 環。與步驟708和步驟728類似，使流體穿過生物反應器300循環。在實施方式中，步驟744可 涉及啟動一個或多個栗，以使流體穿過生物反應器300循環。如上所述，可啟動1C循環栗(例 如812或911)，以使流體以第三循環流速穿過生物反應器300的1C側循環。在至少一個實施 方式中，攜帶細胞的流體可經過生物反應器300的中空纖維從1C側流到EC側。在其他實施方 式中，可將細胞加載到生物反應器300的EC側中，并且使攜帶細胞的流體從EC側流到1C側。 在這些實施方式中，可啟動EC循環栗(例如828或974)，以使流體以第三循環流速穿過生物 反應器300的EC側循環。
[0160]在實施方式中，第三循環流速可小于第二循環速度。在實施方式中，第三循環流速 可小于約200ml/min、小于約150ml/min或甚至小于約100ml/min。在其他實施方式中，第三 循環速度可大于約1〇1111/111；[11、大于約201]11/1]1；[11或甚至大于約301]11/1]1；[11。在一個實施方式中， 第三循環流速在約20ml/min至約100ml/min之間，諸如約50ml/min。
[0161] 在一些實施方式中，步驟744可還涉及以與步驟728中的循環方向不同的方向進行 循環。換句話說，在一些實施方式中，步驟728可涉及使流體以順時針方向循環。在一些實施 方式中，在步驟744處的循環可以與步驟708類似，并且是逆時針方向（參見圖8和圖9中的1C 環路）。換句話說，步驟744處的循環可以與步驟728處的循環相反地流動，并且與步驟708的 循環方向相同。在其他實施方式中，步驟708、步驟728、步驟744中的循環可以相同方向，順 時針或逆時針流動。
[0162] 在一些實施方式中，可選步驟744還涉及使生物反應器300以特定順序旋轉，以促 使細胞穿過生物反應器300和CES的循環路徑進行分布，其中生物反應器300可與CES的循環 路徑流體相連。在其他實施方式中，循環步驟744可涉及使生物反應器300在一些時間段中 旋轉，但使生物反應器300在其他時間段中保持靜止。
[0163] 流程從744轉到步驟748,在步驟748中，再一次降低流體循環速度。可將循環速度 降低至約零(〇)ml/min，或者在其他實施方式中，可將循環速度降低至大于零(0)ml/min但 仍允許細胞沉淀且附著至生物反應器300,例如生物反應器300的中空纖維316的內表面的 速度。在實施方式中，步驟748可涉及停止或關閉在步驟744中用于使流體循環的一個或多 個栗。
[0164] 流程從步驟748轉到步驟752,在步驟752中，使生物反應器維持在水平取向。在包 括步驟744(旋轉到第一取向）的實施方式中，步驟752涉及維持第一水平取向。在不包括步 驟740的旋轉的實施方式中，步驟752涉及維持第二水平取向。在任何情況中，都執行步驟 752以允許細胞再次沉淀在如區1508(參見圖15D和圖15E，如果執行旋轉步驟740)上。在實 施方式中，允許細胞沉淀第三預定時間段，可對該第三預定時間段進行選擇，以不僅允許細 胞沉淀，而且還允許細胞附著。
[0165] 在一些實施方式中，第三預定時間段可以持續足夠長的時間，以僅允許細胞沉淀 和附著至區1508。在這些實施方式中，細胞可僅需要移動中空纖維1500的內徑的距離。例 如，在中空纖維1500具有約150微米至約300微米之間的內徑的實施方式中，第三預定時間 段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實施方式中，第三預定時間 段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個實施方式中，第 三時間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0166] 在一些實施方式中，流程700可從步驟752轉到步驟772，在步驟772中，細胞進行擴 增。圖15F示出這些實施方式中的纖維1500。然后，流程終止于776。
[0167] 在其他實施方式中，如下所述，在移動到擴增細胞的步驟772之前，流程700可包括 額外的旋轉（756)、循環（760)、降低循環（764)和維持取向（768)的步驟。在這些實施方式 中，流程700可從步驟752轉到步驟756,如果在步驟740旋轉到第一水平取向的話，在步驟 756中，使生物反應器300旋轉回到第二水平取向。圖10示出處于第二水平取向的生物反應 器300。可通過與生物反應器300連接的一個或多個馬達執行步驟756。這些馬達可以是搖動 裝置的一部分。在一些實施方式中，如果沒有執行步驟740以使生物反應器旋轉到第一水平 取向的話，則不需要執行這一步驟。
[0168] 流程700轉到步驟760,在步驟760中，流體以第四循環流速再次進行循環。與步驟 708、步驟728和步驟744類似，流體穿過生物反應器300循環。在實施方式中，步驟744可涉及 啟動一個或多個栗以使流體穿過生物反應器300循環，如上所述，可啟動1C循環栗(例如812 或911)，以使流體以第四循環流速穿過生物反應器300的1C側循環。在至少一個實施方式 中，攜帶細胞的流體可經過生物反應器300的中空纖維從1C側流到EC側。在其他實施方式 中，可將細胞加載到生物反應器300的EC側中，并且使攜帶細胞的流體從EC側流到1C側。在 這些實施方式中，可啟動EC循環栗(例如828或974)，以使流體以第四循環流速穿過生物反 應器300的EC側循環。
[0169] 在實施方式中，第四循環流速可小于第三循環速度。在實施方式中，第四循環流速 可小于約1〇〇1111/111；[11、小于約751111/111；[11或甚至小于約501111/111；[11。在其他實施方式中，第四循 環速度可大于約5ml/min、大于約10ml/min或甚至大于約15ml/min。在一個實施方式中，第 四循環流速在約15ml/min至約35ml/min之間，諸如約25ml/min。
[0170] 在一些實施方式中，步驟760可還涉及以與步驟744中的循環方向不同的方向進行 循環。換句話說，在一些實施方式中，步驟744可涉及使流體以逆時針方向循環。在一些實施 方式中，在步驟760處的循環可以與步驟728類似，并且是順時針方向。換句話說，步驟760處 的循環可以與步驟744處的循環相反地流動，并且與步驟728的循環方向相同。在其他實施 方式中，步驟708、步驟728、步驟744和步驟760中的循環可以相同方向，順時針或逆時針流 動。
[0171] 在一些實施方式中，步驟760還可涉及使生物反應器300以特定順序旋轉，以促使 細胞穿過生物反應器300和CES的循環路徑進行分布，其中生物反應器300可與CES的循環路 徑流體相連。在其他實施方式中，循環步驟760可涉及使生物反應器300在一些時間段中旋 轉，但使生物反應器300在其他時間段中保持靜止。
[0172] 流程從760轉到步驟764,在步驟764中，再一次降低流體循環速度。可將循環速度 降低至約零(〇)ml/min，或者在其他實施方式中，可將循環速度降低至大于零(0)ml/min但 仍允許細胞沉淀且附著至生物反應器300,例如生物反應器300的中空纖維316的內表面的 速度。在實施方式中，步驟764可涉及停止或關閉在步驟760中用于使流體循環的一個或多 個栗。
[0173]流程從步驟764轉到步驟768,在步驟768中，使生物反應器維持在第二水平取向 上，以允許細胞再次沉淀在例如區1512上(參見圖15F)。在實施方式中，允許細胞在第四預 定時間段期間進行沉淀，可對第四預定時間段進行選擇，以不僅允許細胞沉淀而且還允許 細胞再次附著。
[0174]在一些實施方式中，第四預定時間段可以持續足夠長的時間，以允許細胞沉淀和 附著。在這些實施方式中，細胞可僅需要移動中空纖維（例如纖維1500)的內徑的距離。例 如，在中空纖維1500具有約150微米至約300微米之間的內徑的實施方式中，第四預定時間 段可小于約20分鐘、小于約15分鐘或甚至小于約10分鐘。在其他實施方式中，第四預定時間 段可大于約1分鐘、大于約2分鐘、大于約3分鐘或甚至大于約4分鐘。在一個實施方式中，第 四時間段可以在約3分鐘至約8分鐘之間，諸如約5分鐘。
[0175] 在步驟768之后，流程700轉到步驟772,在步驟772中，沉淀且附著至生物反應器 300(例如生物反應器的中空纖維）的細胞進行擴增，即增殖。然后，流程700終止于776。 [0176]在不受到理論束縛的情況下，相信在實施方式中，如果執行流程700的步驟，則能 改善細胞擴增。相信這些實施方式有助于在細胞擴增之前，在生物反應器的更多部分，例如 生物反應器中的中空纖維的表面接種細胞。與傳統工藝相比，這樣可初始接種更多的細胞， 并且最終改善細胞產量并且縮短細胞倍增的時間。
[0177] 盡管流程700包括提供旋轉、循環、降低循環和維持生物反應器的取向的特定數目 的步驟，但是其他實施方式并不限于這些特定數目的步驟。在其他實施方式中，甚至在步驟 768之后，也可使生物反應器再次旋轉，再次啟動循環，然后進行降低循環的另一階段，以允 許細胞沉淀，并且維持取向一段時間以允許細胞附著至生物反應器的一部分。可將這些步 驟執行任意次數。在實施方式中，每次啟動循環時，該循環的速度都小于之前的循環。在其 他實施方式中，循環速度可以在每次啟動的循環中都是相同的。在另外一些實施方式中，可 以改變循環的方向，其中一循環為第一方向，然后終止該循環以允許細胞沉淀和附著，然后 以與第一方向相反的方向（順時針對逆時針)進行循環并且再次終止循環以允許細胞沉淀。
[0178] 現在參考圖16,示出了生物反應器(例如生物反應器300)的橫截面1600(與中心軸 線垂直）。橫截面1600不出可在殼體1604內的多個中空纖維1608。橫截面1600取自生物反應 器的一個末端，除了中空纖維1608之外，橫截面1600還示出將中空纖維1608保持在一起的 基質材料1628(如上可被稱為灌封材料）。
[0179] 圖16還示出區域1612、1616、1620和1624。這些區域代表其中可能有流體以不同流 速循環穿過其中的纖維。換句話說，在不受到理論束縛的情況下，相信處于相對較高流速的 循環可主要流經纖維的區域1612,其中相對較高流速諸如可在循環步驟708或步驟728(圖 7)中使用的速度。在不受到理論束縛的情況下，相信較高流速不能使流體分散到足以允許 均勻流到中空纖維的外區域中。隨著流速降低(諸如在步驟744和步驟760中），相信流體可 分散到中空纖維的外區域中，諸如區域1616、區域1620和區域區域1624。
[0180] 相應地，在不受到理論束縛的情況下，相信通過步驟708、步驟728、步驟744和步驟 752以不同流速進行循環，允許流體比僅使用一種流速要流經更多的中空纖維1608。在按照 流程圖700進行的工藝的一個實施方式中，在步驟708(處于上述流速)時，流體可流經中空 纖維的區域1612。在步驟728(處于上述流速)時，因為速度較慢并且流體可更加分散，因此 流體可流經中空纖維的區域1612和區域1616。在步驟744(處于上述流速)時，因為流速更慢 并且流體甚至更加分散，因此流體可流經中空纖維的區域1612、區域1616和區域1620。在步 驟752(處于上述流速)時，因為流速甚至更慢并且流體可分散至所有纖維的各個區域，因此 流體可流經中空纖維的所有區域1612、區域1616、區域1620和區域1624。因此，相信與使用 單一高流速循環相比，使用一系列的不同流速可使含細胞的流體流入更多的中空纖維中。
[0181] 此外，還相信不同的流速還可影響細胞沿生物反應器（即沿中空纖維）的縱向分 布。也就是說，較高的流速可允許細胞沿中空纖維內側流動地更遠。例如，在較高流速時，被 流體攜帶的細胞可達到中空纖維長度的一半之外。在較低流速時，被流體攜帶的細胞可達 到中空纖維長度的一半。在甚至更低的流速時，被流體攜帶的細胞可達到小于中空纖維長 度一半。因此，在一些實施方式中，相信使用不同流速可在細胞沿生物反應器(例如中空纖 維）的長度縱向分布上得到一些改善。
[0182] 注意到，在參考流程圖500、流程圖600和流程圖700描述的實施方式可用于擴增任 意類型的細胞，該任意類型的細胞的一些非限制性實例包括干細胞（間充質細胞、造血細胞 等）、成纖維細胞、角質細胞、祖細胞、內皮細胞、其他完全分化的細胞，以及它們的組合。可 使用具有不同特征和特征的組合的工藝來擴增不同細胞，其中一些可包括參考流程圖500、 流程圖600和/或流程圖700所述的步驟。
[0183] 盡管流程圖500(圖5)、流程圖600(圖6)和流程圖7(圖7)描述了以特定順序列出的 步驟，但本發明并不限于此。在其他實施方式中，例如在另一步驟之前和之后，可以不同順 序、平行或以任意不同的次數執行各步驟。另外，如上所述，流程圖500、流程圖600和流程圖 700可包括一些可選步驟或子步驟。但是，不應將上面不是作為可選步驟示出的那些步驟認 為對于本發明是必需的，而是可以在本發明的一些實施方式中執行，而在其他實施方式中 不執行。
[0184] 最后，圖17示出基礎計算機系統1700的示例性組件，在該基礎計算機系統1700上 可執行本發明的實施方式。計算機系統1700可執行用于加載和分布細胞的方法中的一些步 驟。系統1700可以是用于控制特征的控制器，所述特征例如為上述在其中加載且分布了細 胞以進行擴增的CES系統10、430、800和900的流動控制裝置、栗、閥、生物反應器的旋轉、馬 達等。
[0185] 計算機系統1700包括輸出裝置1704和/或輸入裝置1708。輸出裝置1704可包括一 個或多個顯示器，包括CRT、IXD和/或等離子體顯示器。輸出裝置1704還可包括打印機、揚聲 器等。輸入裝置1708可包括鍵盤、觸摸輸入裝置、鼠標、語音輸入裝置等。
[0186] 根據本發明的實施方式，基礎計算機系統1700還可包括處理元件1712和/或存儲 器(mem〇ry)1716。處理元件1712可為通用處理器，可操作地用于執行存儲器1716中存儲的 指令。根據實施方式，處理元件1712可包括一個處理器或多個處理器。進一步地，在實施方 式中，每個處理器都可為具有一個或多個核的多核處理器，以讀取和執行獨立的指令。上述 處理器可包括通用處理器、專用集成電路(ASIC)、現場可編程門陣列（FPGA)，其它集成電 路。
[0187] 根據實施方式，存儲器1716可包括用于短期存儲或長期存儲數據和/或處理器可 執行指令的任意有形介質。存儲器1716可包括例如隨機存取存儲卡（RAM)、只讀存儲卡 (ROM)或電可擦除可編程只讀存儲卡(EEPR0M)。其它存儲介質可以包括例如⑶-R0M、磁帶、 數字多功能盤(DVD)或其它光學存儲器，磁帶、磁盤存儲器、磁帶、其它磁存儲裝置等等。在 實施方式中，系統1700可用于控制生物反應器300的旋轉和/或CES系統的各流動控制裝置、 栗、閥等。存儲器1716可存儲方案1720和程序1724,諸如將細胞加載和分布在生物反應器中 的方案和程序，能夠控制循環栗、閥、生物反應器的旋轉等的運行。
[0188] 貯存器(st〇rage)1728可以上任意的長期數據存儲裝置或組件。根據實施方式，貯 存器1220可包括連同存儲器1716-起描述的一個或多個系統。存器1728可為永久的或可 擦除的。在實施方式中，系統1700為CES的一部分，并且貯存器1728可存儲利用CES系統加 載、分布、附著、擴增和收獲各種類型的細胞的各種方案。
[0189] 實施例
[0190] 下面，描述本發明的【具體實施方式】的一些實例。但是，應注意盡管下面根據一些實 施方式，描述了例如用于為CES(即QUANTUM?細胞擴增系統)提供程序的具體參數、特征 和/或數值，但是提供這些具體參數、特征和/或數值僅為了示例目的，本發明并不限于下面 提供的具體細節。
[0191] 實施例1
[0192] 本研究的目的是描繪使用兩種獨特的細胞接種方法，使來源于人類骨髓的間充質 干細胞(hMSC)在QUANTUM?細胞擴增系統中進行擴增。
[0193] 目前，用于預先選定的hMSC的QUANTUM細胞擴增系統上使用的細胞加載程序經由 均勻的細胞懸浮液將細胞分布在生物反應器中。將細胞加載到QUANTUM細胞擴增系統的1C 循環環路中，然后以相對較高的流速(200mL/min)循環2分鐘。該循環方法，同時伴隨有目的 的生物反應器運動，得到細胞的均勻懸浮液。一旦使細胞均勻懸浮，則循環和生物反應器的 運動停止，從而使細胞沉淀在生物反應器的表面上。
[0194] 該細胞加載程序的一個限制是，僅將細胞接種至生物反應器纖維的凹槽中。hMSC 常常以特定細胞密度(例如500個細胞/cm2)進行接種。當確定要加載的細胞的適當數目時， 為了實現特定的接種密度，只能考慮生物反應器表面積的約50%。在500個細胞/cm 2時， QUANTUM細胞擴增系統生物反應器可接種10.5E+06個細胞(500個細胞/cm2x 21000cm2)。但 是，由于現有細胞加載方案的上述機械性，僅可認為生物反應器表面積的50 %是"能接種 的"。此外，為了利用生物反應器的"不能接種的"表面，嘗試迀移至該表面的擴增細胞必須 要克服重力。本文建立的理論是，與在培養瓶對應部分中擴增的那些細胞群相比，迀移細胞 可能采取阻力最小的路徑，從而得到細胞群內的快速匯合。
[0195] 總共七個無菌的具有生物反應器的Quantum CES-次性套件可經纖連蛋白包被 (5mg)過夜。所有的Quantum系統都可接種預培養的hMSC。一個Quantum細胞擴增系統可使用 現有的循環作業加載(Load with Circulation Task)，并且用作實驗對照。三個Quantum細 胞擴增系統可使用"循環作業加載:改型Γ (改型1 )，而且三個Quantum細胞擴增系統可使用 循環作業加載:改型2"（改型2)。
[0196] 一次性套件：所有生物反應器都整合在QUANTUM細胞擴增系統（CES)-次性套件 中，并且經環氧乙烷進行消毒。
[0197] 細胞來源和密度:可使用的生物反應器可具有2.1m2的內（1C)表面積。可能需要基 于1C環路的生物反應器的體積分數，對對照培養瓶的接種密度進行調整。所有生物反應器 可均勻接種來自直接重加載的相同細胞來源的最高20E+06預先選定的MSC(存在1~3次傳 代）。優選來自一個供體的細胞。作為用于對比目的的生物反應器，以每cm 2相同密度的hMSC 接種三(3)個T25對照培養瓶。
[0198] CES介質1C進入Q管理&收獲：當葡萄糖水平低于70mg/dL時，介質供給速度（1C進入 Q)可加倍;如果葡萄糖值繼續低于70mg/dL，則1C進入Q可在一天期間再次加倍。可同時并且 不晚于第8天，收獲所有的一次性條件，以限制潛在的聚集。可根據細胞培養物顯示的代謝 特征，來決定細胞收獲時間。目標收獲時間可以是細胞的對數生長后期。
[0199] 收獲后的評估:可對每一收獲產物進行評估。這些評估可包括細胞計數和存活力。 [0200] Quantum CES細胞加載改型1
[0201]可使用下面以粗體示出的改型，執行目前的細胞加載程序。在允許細胞附著5分鐘 之后，可使所有生物反應器旋轉180度以允許細胞沉淀在中空纖維膜的頂部，持續額外的5 分鐘。然后，使生物反應器旋轉回到初始的水平位置，并且進行擴增方案。該改型的基本原 理是使細胞在生物反應器中空纖維的整個表面積上進行分布。
[0202] 天:0使用一次(1)旋轉使細胞附著
[0203] 目的：使貼壁細胞能附著至生物反應器的膜上，同時允許在EC循環環路中進行流 動。可將至1C環路的栗流速設置為零。
[0204] 表1描述了當使細胞附著時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對應的體積 可基于該任務的默認設置。
[0205]表1:使細胞附著的改型1的溶液 [0206]表1:用于使細胞附著的溶液
[0207]
[0208] 細胞路徑:任務〉加載和附著〉使細胞附著
[0209] 輸入在方案表2a~2c中示出使細胞附著的每一設置的數值。
[021 0]表2a:任務〉加載和附著〉使細胞附著，步驟1改型1
[0211]
[0212] 表2b:任務〉加載和附著〉使細胞附著，步驟2改型1
[0213]
[0214] 表2c:任務〉加載和附著〉使細胞附著，步驟3改型1
[0215]
[0216] Quantum CES細胞加載改型2
[0217] 可使用下面以粗體示出的改型，執行目前的細胞加載程序、預先選定的MSC擴增方 案。在細胞附著期間（18~24小時），通過使生物反應器旋轉至180度位置，可使細胞附著至 中空纖維的頂部。然后，使生物反應器旋轉回到初始位置，并且進行擴增方案。該改型的基 本原理是在細胞擴增期間，使重力影響細胞朝空的生長表面迀移的方向。
[0218]重力可用于"影響"擴增期間的細胞迀移。這可通過如在目前細胞加載程序中所述 的接種細胞，然后在擴增期間可使生物反應器旋轉180°來完成。在這種配置中，生物反應器 的未被占據的生長表面在接種的細胞的下方。然后，細胞朝最小阻力方向（例如在重力的幫 助下朝下)進行擴增。
[0219]天:0使用一次⑴旋轉使細胞附著
[0220]目的：使貼壁細胞能附著至生物反應器的膜上，同時允許在EC循環環路中進行流 動。可將至1C環路的栗流速設置為零。
[0221 ]表5描述了當使細胞附著時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對應的體積 可基于該任務的默認設置。
[0222]表5:使細胞附著的改型2的溶液
[0223]
[0224] 細胞路徑:任務〉加載和附著〉使細胞附著
[0225] 表6:任務〉加載和附著〉使細胞附著的改型2
[0226]
[0227] 結果可如下：
[0228] 表 7
[0234] 實施例2
[0235] 牛眼樣細胞(Bull's Eye cell)加載程序是一系列步驟，這些步驟被設計為通過 允許細胞在QUANTUM?細胞擴增系統的生物反應器內進行更均勻的分布，并且通過減少 在接種過程中細胞丟失的數目，來增加細胞產量。
[0236] QUANTUM細胞擴增系統的牛眼樣細胞加載技術提供了一系列步驟，包括并且加入 通常用于加載生物反應器的"使用均勻懸浮液加載細胞（Load Cells with Uniform Suspension)"的方案(軟件版本2.0的Quantum細胞擴增系統操作者手冊）。在使用均勻懸浮 液加載細胞(LCWUS)中，在細胞懸浮液以200mL/min穿過1C環路循環之后，懸浮的細胞有一 個時機進入并且附著至生物反應器的一個纖維的內表面。牛眼樣細胞可允許在初始懸浮之 后不附著的細胞和那些不是在生物反應器中而是留在1C環路中的細胞被重新懸浮，并且轉 運到生物反應器內的不同纖維中用于隨后的附著。
[0237] 可基于以下原理進行牛眼樣細胞的加載:依賴于1C環路中的細胞懸浮液的循環速 度，經由1C環路的循環引入到生物反應器中的細胞懸浮液可經過生物反應器纖維的不同 組。
[0238] 在使用均勻懸浮液(LCWUS)加載細胞的初始200mL/min懸浮循環之后，1C環路中的 細胞懸浮液可選地以順序較低的循環速度-100mL/min、50mL/min、-25mL/min，以正向和反 向進行循環。1C環路的每一逐漸較慢的循環可允許，那些仍留在懸浮液中的細胞有額外的 機會進入并且附著至生物反應器纖維的內表面上。
[0239] 流體在1C環路中的每一次循環都可跟著7分鐘的細胞附著時間，在這一時間段中， 1C循環速度可以是零。已表明MSC細胞在5分鐘內附著至在QUANTUM細胞擴增系統中使用的 生物反應器中的纖維的內表面上。這樣，7分鐘的附著可允許5分鐘用于細胞附著，額外的2 分鐘允許較慢的細胞附著。1C環路中的細胞懸浮液和細胞附著的總四次循環可跟著24小時 附著期間，在該24小時附著時間之后，可根據需要輸入適當的細胞飼養計劃。
[0240]天：_1包被生物反應器
[0241 ]目的:使用試劑包被生物反應器的膜。
[0242] 步驟1:在1C環路中加載試劑，直至袋子清空。
[0243] 步驟2:將上述試劑從ARC趕至1C環路中。
[0244] 步驟3:使上述試劑在1C環路中進行循環。
[0245] 在啟動這一任務之前，可滿足下面的前提：
[0246] 在細胞輸入袋中包括至少40mL空氣。
[0247] 表10描述了在執行包被生物反應器時，可用于與每一管線附接的溶液袋。這些溶 液和對應的體積可基于該任務的默認設置。
[0248]
[0249] 包被生物反應器的路徑:任務〉系統管理〉包被生物反應器
[0250] 輸入在表11中示出的步驟1的每一設置的數值。
[0251]
[0252] 輸入在表12中示出的步驟2的每一設置的數值。
[0254] 輸入在表13中示出的步驟3的每一設置的數值。
[0255]
[0256] 天：0 IC EC沖洗
[0257] 目的：用于替換1C循環環路和EC循環環路中的流體。通過交換的1C體積和EC體積 的數量來限定替換的體積。表14描述了當進行IC EC沖洗時，可與每一管線附接的溶液袋。 這些溶液和對應的體積可基于該任務的默認設置。
[0258]
[0259] IC EC沖洗路徑:任務〉沖洗>IC EC沖洗
[0260]確認表15中示出的用于IC EC沖洗的每一設置的數值。
[0261]
[0262] 天:0條件培養基(介質）
[0263] 按照該任務的指令，在加載細胞之前，允許介質達到與提供的氣體供應的平衡。該 任務可包括兩個獨立步驟：
[0264] 步驟1:通過使用高EC循環速度，提供介質和氣體供應之間的快速接觸。
[0265] 步驟2:將系統維持在適當狀態，直至操作者準備要加載細胞。
[0266] 表16描述了當執行條件培養基時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對應 的體積可基于該任務的默認設置。
[0267]
[0268] 條件介質路徑:任務〉系統管理〉條件介質
[0269] 輸入在表17中示出對步驟1的每一設置的數值。
[0271 ]輸入在表18中示出對步驟2的每一設置的數值。
[0272]
[0273]天:0使用均勻懸浮液加載細胞
[0274] 目的:將細胞從細胞輸入袋加載到生物反應器中，直至袋子清空。該任務僅使用1C 循環來分布細胞，并且不嘗試將細胞從管線趕至生物反應器中。該任務可包括三個獨立步 驟。
[0275] 步驟1:將細胞從細胞輸入袋加載到生物反應器中。
[0276] 步驟2:將細胞從ARC趕至生物反應器中。更大驅趕體積（chase volume)擴散細胞 并且使細胞朝1C出口移動。
[0277] 步驟3:促使細胞經由1C循環跨越膜進行分布而不經由1C入口，因此沒有超過濾。
[0278] 在啟動該任務之前，可滿足下面的前提：
[0279] 在細胞輸入袋中包括至少40 mL的空氣。
[0280] 表19描述了在執行使用均勻懸浮液加載細胞時，可與每一管線附接的溶液袋。這 些溶液和對應的體積可基于該任務的默認設置。
[0281]
[0282] 使用均勻懸浮液加載細胞的路徑:任務〉加載和附著〉使用均勻懸浮液加載細胞
[0283] 確認表20中示出的用于步驟1的每一設置的數值。
[0284]
[0285] 確認表21中示出的用于步驟2的每一設置的數值。
[0286]
[0287]確認表22中示出的用于步驟3的每一設置的數值。
[0288]
[0289] 天:0牛眼樣細胞的附著
[0290] 目的:在允許在EC循環環路中進行流動時，允許貼壁細胞附著至生物反應器膜上。 可將至1C環路的栗流速設置為零。
[0291 ]步驟1:允許細胞7分鐘附著至處于180°的生物反應器的內表面。
[0292] 步驟2:使1C流體和剩余的懸浮細胞以高速，與初始加載相反的方向循環。
[0293] 步驟3:該步驟是第二個7.0分鐘，允許進一步的細胞附著。使從1C環路或從生物反 應器的不同區域重新定位的那些細胞有機會沉淀且貼壁到生物反應器上。
[0294] 步驟4:再次使留在1C環路中的那些細胞和還沒有附著至表面上的那些細胞重新 循環。循環可以為正向，并且這一次的循環速度可較低，以避免移除已經附著的那些細胞， 并且優選接種到生物反應器中在之前的步驟中還沒有接種的區域上。
[0295] 步驟5:該步驟是第三個7.0分鐘，允許進一步的細胞附著。使從1C環路或從生物反 應器的不同區域重新定位的那些細胞有機會沉淀且貼壁到生物反應器上。
[0296] 步驟6:使留在1C環路中的那些細胞和還沒有附著至表面的那些細胞重新循環。循 環可以為反向，并且這一次的循環速度可較低，以避免移除已經附著的那些細胞。
[0297] 步驟7:24小時附著細胞階段。細胞可有24小時，以在飼養開始之前，牢固地錨固至 生物反應器上
[0298] 表23描述了在執行牛眼樣細胞的附著時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液 和對應的體積可基于該任務的默認設置。
[0299]
[0300] 牛眼樣細胞附著路徑:任務〉自定義〉自定義
[0301] 輸入表24中示出的每一設置的數值。
[0302]
[0303]輸入表25中示出的每一設置的數值。
[0304]
[0305]輸入表26中示出的每一設置的數值。
[0306]
[0307] 輸入表27中示出的每一設置的數值。
[0308]
[0309]輸入表28中示出的每一設置的數值。 「03101
[0311]輸入表29中示出的每一設置的數值。
[0313] 輸入表30中示出的每一設置的數值。[0314]
[0315] 天：1飼養細胞
[0316] 目的：持續低流速向1C循環環路和/或EC循環環路進行添加。在該任務過程中，存 在幾種排出設置，可用于移除向系統添加的流體。
[0317] 表31描述了在執行飼養細胞時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶液和對應的 體積可基于該任務的默認設置。
[0318]
[0319] 飼養細胞的路徑:任務〉飼養和添加〉飼養細胞
[0320] 確認表32中示出的步驟1的每一設置的數值。
[0321]
[0322]根據需要，增加 1C進入速度。
[0323]釋放貼壁細胞和收獲
[0324]目的：從膜上釋放細胞，是細胞離開1C環路并且將來自1C循環環路的細胞(包括在 生物反應器中的細胞)以懸浮液的形式轉移到收獲袋中。
[0325] 步驟1:在準備中，執行IC EC沖洗任務，以添加試劑。例如，在準備中，該系統將roS 替換成IC EC介質以去除蛋白、Ca++和Mg++，以添加胰蛋白酶。
[0326] 步驟2:將試劑加載到系統中，直至袋子清空。
[0327] 步驟3:將試劑趕至1C環路中。
[0328] 步驟4:混合1C環路內的試劑。
[0329] 步驟5:將來自1C循環環路的細胞(包括生物反應器中的細胞）以懸浮液的形式轉 移至收獲袋中。
[0330] 在啟動該任務之前，可滿足下面的前提：
[0331] 在細胞輸入袋上包括至少40mL的空氣。
[0332]表33描述了在執行釋放貼壁細胞和收獲時，可與每一管線附接的溶液袋。這些溶 液和對應的體積可基于該任務的默認設置。
[0333]
[0334] 釋放貼壁細胞的路徑:任務〉釋放和收獲〉釋放貼壁細胞和收獲
[0335] 確認表34中示出的步驟1的每一設置的數值。
[0338] 確認表35中示出的步驟2的每一設置的數值。
[0339]
[0340]確認表36中示出的步驟3的每一設置的數值。
[0341]
[0342] 確認表37中示出的步驟4的每一設置的數值。
[0343]
[0344] 確認表38中示出的步驟5的每一設置的數值。
[0345]
[0346] 本研究的結果如下：
[0347] 表39
[0348]
[0349] 可使用來自四個不同供體的MSC，來評估牛眼樣細胞的加載。加載的牛眼樣細胞的 收獲產量可相應高于使用LCWUS加載且在相同條件下培養的產量。使用牛眼樣細胞(n = 6) vs.LCWUS(n = 4)得到的細胞平均產量增加可為25%。
[0350]在進行牛眼樣細胞加載之后立即從1C環路中采集的MSC樣品的存活力為100%。對 于所有樣品，來自牛眼樣細胞收獲物的MSC的存活力高于98%。來自牛眼樣細胞收獲物的 MSC顯示出培養物中的典型形態，并且通過流式細胞儀測量的所有MSC生物標記物都符合 ISCT標準。
[0351] 實施例3
[0352] 可使用與上述實施例2相同的方案，來研究對牛眼樣細胞附著方案的改型。對牛眼 樣細胞附著的改型（牛眼樣細胞II)和對上述方案的改型包括去除在循環速度l〇〇ml/min、-50ml/min和25ml/min之后的附著階段。也就是說，取代如上所述的7分鐘停止條件，沒有停 止條件，以便下一個循環速度接著前一個循環速度。對照以及原牛眼樣細胞運轉（牛眼樣細 胞I)也實施作為對比。
[0353] 本研究的結果如下：
[0354] 表40
[0355]
[0356] 各組件在本文中被稱為"可操作地相聯/相連"。如本文所使用的，"可操作地相聯/ 相連"是指組件以可操作的方式連接在一起，并且涵蓋組件直接連接的實施方式以及在兩 個連接的組件之間放置有額外的組件的實施方式。
[0357] 前面對本發明的一個或多個實施方式的討論是用于解釋和說明的目的并不要進 行限制。例如在上文的【具體實施方式】中，一個或多個實施方式的各特征可組合在一起，以簡 化本公開。不能將本公開的方法理解為反映實施方式需要比在權利要求明確記載的更多的 特征的發明。此外，如下文權利要求所反映的，創造性方面較小地依賴于在前述一個實施方 式的所有特征。因此，將后附權利要求并入到該【具體實施方式】中，其中每個權利要求自身代 表本發明的一個獨立實施方式。
[0358] 此外，盡管說明書包括對一個或多個實施方式的描述以及某些變型和改型，但其 它變型和改型也在本發明的范圍內（例如，在理解本公開之后，可在本領域技術人員的技能 和知識的范圍內）。在不用于向公眾貢獻任何可專利性的主題的情況下，本發明要獲得在可 允許范圍內的替代實施方式的權利，包括要求權利的可替代地、可互換的和/或等價的結 構、功能、范圍或步驟，而不管這些可替代的、可互換的和/或等價的結構、功能、范圍或步驟 是否被本文所公開。
【主權項】
1. 一種將細胞加載到細胞擴增系統中的方法，所述方法包括： 使流體以第一流速穿過細胞擴增系統的生物反應器循環，其中所述流體包括多個細 胞； 使流體的循環自所述第一流速降低； 使所述生物反應器在第一取向上維持第一預定時間段，以允許至少所述多個細胞的一 部分沉淀； 在所述第一預定時間段之后，使所述生物反應器旋轉至距所述第一取向約180度的第 二取向； 在旋轉之后，使所述生物反應器在所述第二取向上維持第二預定時間段，以允許至少 所述多個細胞的第二部分沉淀；以及 在所述生物反應器中，使至少所述細胞的第一部分和第二部分擴增。2. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括： 在所述第一預定時間段之后，并且在使所述生物反應器維持在所述第二取向上之前： 使流體以第二流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第二流速比所述第一流速慢； 以及 使所述循環自所述第二流速降低；以及 使所述生物反應器在所述第二取向上維持第二時間段。3. 根據權利要求2所述的方法，進一步包括： 在所述第二預定時間段之后： 使流體以第三流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第三流速比所述第二流速慢； 使流體的循環速度自所述第三流速降低；以及 使所述生物反應器在所述第二取向上維持第三預定時間段，以允許至少所述多個細胞 的第三部分沉淀。4. 根據權利要求3所述的方法，進一步包括： 在所述第三預定時間段之后： 使流體以第四流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第四流速比所述第三流速慢； 以及 使流體的循環自所述第四流速降低；以及 使所述生物反應器在所述第二取向上維持第四預定時間段，以允許至少所述多個細胞 的第四部分沉淀。5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述第一時間段、所述第二時間段、所述第三時間 段和所述第四時間段是相同的。6. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一時間段和所述第二時間段的持續時間相 等。7. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一時間段小于約10分鐘。8. 根據權利要求7所述的方法，其中，所述第一時間段小于約8分鐘。9. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述生物反應器包括中空纖維膜。10. 根據權利要求1所述的方法，進一步包括： 在所述第二預定時間段之后并且在擴增之前，將所述生物反應器旋轉180度至所述第 一取向。11. 一種用于擴增細胞的系統，所述系統包括： 生物反應器； 被配置為與所述生物反應器連接并且使所述生物反應器旋轉的至少一個馬達； 與所述生物反應器流體相連的至少一個流體循環路徑； 用于使流體穿過所述至少一個流體循環路徑和所述生物反應器循環的至少一個栗； 被配置為執行處理器可執行指令的處理器；以及 儲存處理器可執行指令的存儲器，其中當所述指令由所述處理器執行時，執行包括以 下步驟的方法： 啟動所述至少一個栗，以使流體以第一流速穿過所述生物反應器循環，其中所述流體 包括多個細胞； 停止所述至少一個栗； 使所述生物反應器在第一取向上維持第一預定時間段，以允許至少所述多個細胞的一 部分沉淀； 在所述第一預定時間段之后，啟動所述至少一個馬達，以使所述生物反應器旋轉至距 所述第一取向約180度的第二取向； 在旋轉之后，使所述生物反應器在所述第二取向上維持第二預定時間段，以允許所至 少述多個細胞的第二部分沉淀；以及 啟動所述至少一個栗，以使流體穿過流體輸送系統循環并且使細胞在所述生物反應器 中擴增。12. 根據權利要求11所述的系統，其中，所述處理器可執行指令進一步包括用于以下各 項的指令： 在所述第一預定時間段之后，并且在使所述生物反應器維持在所述第二取向上之前： 啟動所述至少一個栗，以使流體以第二流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第二 流速比所述第一流速慢；以及 停止所述至少一個栗。13. 根據權利要求12所述的系統，其中，所述處理器可執行指令進一步包括用于以下各 項的指令： 在所述第二預定時間段之后： 啟動所述至少一個栗，以使流體以第三流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第三 流速比所述第二流速慢； 停止所述至少一個栗；以及 使所述生物反應器在所述第二取向上維持第三預定時間段，以允許所述多個細胞的至 少第三部分沉淀。14. 根據權利要求13所述的系統，其中，所述處理器可執行指令進一步包括用于以下各 項的指令： 在所述第三預定時間段之后： 啟動所述至少一個栗，以使流體以第四流速穿過所述生物反應器循環，其中所述第四 流速比所述第三流速慢；以及 停止所述至少一個栗；以及 使所述生物反應器在所述第二取向上維持第四預定時間段，以允許至少所述多個細胞 的第四部分沉淀。15. 根據權利要求14所述的系統，其中，所述第一流速在約150ml/min至約250ml/min之 間。16. 根據權利要求15所述的系統，其中，所述第二流速在約50ml/min至約150ml/min之 間。17. 根據權利要求16所述的系統，其中，所述第三流速在約25ml/min至約100ml/min之 間。18. 根據權利要求17所述的系統，其中，所述第四流速小于約50ml/min。19. 根據權利要求11所述的系統，其中，所述生物反應器包括中空纖維膜。20. 根據權利要求19所述的系統，其中，所述中空纖維膜包括多個中空纖維。
【文檔編號】C12M3/00GK105992816SQ201480065648
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年11月14日
【發明人】馬克·E·瓊斯, 內森·D·弗蘭克
【申請人】泰爾茂比司特公司