組合物的制作方法
【專利摘要】一種包含鼠李糖脂和膜破壞劑的抗微生物組合物。
【專利說明】組合物
[0001 ]本發明涉及改進的包含鼠李糖脂的殺菌組合物。
[0002] 盡管存在相關現有技術，但本領域仍然需要改進的殺菌鼠李糖脂組合物。
[0003] 因此，第一方面，本發明提供了包含鼠李糖脂和細胞膜破壞劑(disrupter)的殺菌 組合物。
[0004] 單鼠李糖脂含有單個鼠李糖糖環。IUPAC名稱是3-[3-[(2R，3R，4R，5R，6S)-3,4,5-三羥基 -6-甲基四氫吡喃(methyloxan)-2-基]氧基癸酰基氧基]癸酸。
[0005] 二鼠李糖脂含有兩個鼠李糖糖環。IUPAC名稱是3-[3-[4,5_二羥基-6-甲基-3-(3， 4,5_三羥基-6-甲基四氫吡喃-2-基)氧基四氫吡喃-2-基]氧基癸酰基氧基]癸酸。
[0006] 對于鼠李糖脂，在整篇本專利說明書中，前綴"單"和"二"分別用于表示單鼠李糖 月旨(具有一個鼠李糖糖環)和二鼠李糖脂(具有兩個鼠李糖糖環）。如果使用縮寫，則R1為單 鼠李糖脂而R2為二鼠李糖脂。
[0007] 單鼠李糖脂可以是由銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)生產的L-鼠李糖-β-羥基癸酰 基-β-羥基癸酸(RhaC 1QC1Q，化學式C26H48〇9)
[0008] 典型的二鼠李糖脂是L-鼠李糖-L-鼠李糖-β-羥基癸酰基-β-羥基癸酸(Rha2C 1QC10， 化學式C32H58O13)。
[0009] 實際上，根據碳源和菌株，具有不同烷基鏈長度組合的各種其它次要組分與上述 更常見的鼠李糖脂組合存在。單鼠李糖脂和二鼠李糖脂的比例可通過制備方法來控制。一 些細菌只生產單鼠李糖脂，參見US5767090:實施例1，某些酶可將單鼠李糖脂轉化為二鼠李 糖脂。
[0010] 以下鼠李糖脂為涵蓋在本發明內的單鼠李糖脂和二鼠李糖脂的來源(C12:1，C14: 1，表不具有雙鍵的脂肪醜基鏈）：
[0011] -由銅綠假單胞菌生產的鼠李糖脂(單鼠李糖脂）：
[0012] Rha_C8_Ci〇，Rha_Ci〇_C8，Rha _CiQ_CiQ，Rha_Ci〇_Ci2，Rha _Ci〇_Ci2:1，Rha_Ci2_Ci〇，Rha _ C12： l~Cl〇
[0013] -由綠針假單胞菌(P · chlororaphis)生產的鼠李糖脂（僅單鼠李糖脂）：他&-(：10-C8，Rha -Ci〇-Ci〇，Rha-Ci2_Ci〇，Rha -Ci2: i_Ci〇，Rha-Ci2_Ci2，Rha-Ci2: i_Ci2，Rha-Ci4_Ci〇，Rha-Cl4: i_Ci〇〇
[0014] -單鼠李糖脂也可通過從銅綠假單胞菌(Psuedomonas aeruginosa)引入rhlA和 rhlB基因而從惡臭假單胞菌(P· putida)生產[Cha等，Bioresour Techno 1 · 2008 · 99(7): 2192-9]。
[0015] -由銅綠假單胞菌生產的鼠李糖脂(二鼠李糖脂）
[0016] Rha_Rha_Cs_Ci〇，Rha _Rha_C8_Ci2:1，Rha_Rha_Ci〇 _C8，Rha_Rha_CiQ_CiQ，Rha_Rha _Ci〇_ Ci2:1，Rha_Rha_Ci〇_Ci2，Rha_Rha _Ci2_Ci〇，Rha_Rha_Ci2: i_Ci2，Rha_Rha_Ci〇_Ci4 :1
[0017] -由類鼻疽伯克氏菌(Burkholdera pseudomallei)生產的鼠李糖脂(僅二鼠李糖 脂)：
[0018] Rha-Rha-Cu-Cu
[0019] -由植物伯克氏菌（假單胞菌）（Burkholdera(Psuedomonas)plantarii)生產的鼠 李糖脂(僅二鼠李糖脂）：
[0020] Rha-Rha-Cw-Cw
[0021 ]-由銅綠假單胞菌生產的鼠李糖脂，其最初未被識別為單或二鼠李糖脂：
[0022] C8_C8，C8_ClO，Cl0-C8，C8_Cl2:1，Cl2:1 _C8，Cl0-Cl0，Cl2_ClO，Cl2: l_ClO，Cl2_Cl2，Cl2: l_Cl2， Cl4_Cl0，Cl4: l_ClO，Cl4_Cl4 〇
[0023] 優選地，所述鼠李糖脂包含至少20重量％的二鼠李糖脂，優選50重量％二鼠李糖 月旨，更優選60重量％，甚至更優選75重量％且最優選至少90重量％二鼠李糖脂。
[0024] 根據本發明的組合物可以用作殺菌原材料，使得用戶例如消費者可將其稀釋入其 它組合物中，或組合物可以是消費品，其應用旨在對底物提供殺菌效果或甚至作為消費品 組合物中的防腐劑。
[0025] 優選地，所述細胞膜破壞劑包括酸，更優選有機酸。
[0026] 此處使用的優選的有機酸包括羧酸及它們的混合物。
[0027]優選的羧酸包括脂族、環脂族或芳族單_、二_、三-或多元羧酸及它們的組合/混合 物。多元羧酸優選在分子中含有2至10個碳原子，更優選為3至6個碳原子。也可以使用羥基 羧酸。
[0028]所述有機酸可以是脂肪酸。
[0029]優選的羧酸包括辛酸、丙酸、壬二酸、己酸、羥基苯甲酸、水楊酸、蘋果酸、馬來酸、 富馬酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、檸檬酸、酒石酸，以及它們的混合物。
[0030] 市售混合物包含30-35%的己二酸，45%-50%戊二酸和10-18%的琥珀酸。此種混 合物可從BASF作為SOKALAN DCS獲得。另一種適合的混合物為從Radici作為RAD頂IX獲得。
[0031] 優選地，細胞膜破壞劑以制劑的0.01 -10重量％的范圍存在。更優選地，細胞膜破 壞劑以5-10重量％的范圍存在。
[0032]優選地，所述組合物是家庭護理和個人產品。
[0033]優選的家庭護理產品包括洗衣洗滌劑/清潔組合物，洗衣調理組合物，和硬表面清 潔劑例如手洗和機洗餐具洗滌組合物，廚房和浴室清潔劑。硬表面包括廚房和浴室表面、刀 具、餐具等。
[0034]個人護理組合物包括洗發劑、毛發調理劑、除臭劑，皮膚清潔組合物和口腔護理產 品，如牙膏和漱口水。
[0035] 以下為本發明的非限制性實施方案，僅作為示例。
[0036] 實施例1
[0037] 以下數據說明了包含鼠李糖脂和細胞膜破壞劑、辛酸的組合物的抑菌效果。
[0038] 材料和方法 [0039]微生物和培養條件
[0040] 銅綠假單胞菌ATCC 15442和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)ATCC 9144,在-20°C下保存于加20%甘油的營養肉湯中。將在30°C下于營養瓊脂斜面上培養24小 時生長的細菌用于獲得細菌懸液，調節570nm處的光學密度以提供108cfu/mL。
[0041] 鼠李糖脂的特性
[0042] 從獲自 Jeneil Biosurfactant Co· (Saukville，Wisconsin)的樣品分離獲得鼠李 糖脂，其含有10 % (重量/體積)的單鼠李糖脂(C26H4809，分子量:504，在中性pH下的臨界膠 束濃度:20mg/L M)和10% (重量/體積)二鼠李糖脂(C32H58013，分子量:650，在中性pH下的 CMC:1.5X10-430mg/L)〇
[0043] 細胞膜破壞劑:辛酸
[0044] 辛酸(CAS RN 0124-07-2)購自Sigma Aldrich(目錄號C2875)，純度大于99%。
[0045] 所述單和二鼠李糖脂由購自Jeneil的樣品使用下面的程序分離得到，使用獲得的 單獨的R1/R2分數來生產上述10%鼠李糖脂溶液。
[0046]將定量的JBR425采用12M HC1酸化至pH 3并置于冷凍機過夜。將上清液采用氯仿 和乙醇的2:1混合物萃取3次。然后通過旋轉蒸發除去溶劑，并將分離的鼠李糖脂混合物重 新溶解于甲醇中。
[0047]分離和表征混合物的方法采用HPLC連接離子阱電噴霧電離質譜儀進行。電離模式 為負模式，掃描范圍50-1200Da。用于分離的柱是Phenomenex luna C18 250X4.6mm 5ym 柱。流動相:水(流動相A)和乙腈(流動相B)被用于分離，梯度由60:40(A:B)變化至30:70(A: B)，持續時間30分鐘。系統在返回起始條件之前，全部以0.5ml/min的流速持續5分鐘。進樣 體積為1〇μ1。
[0048]表 1 通過 HPLC/MS 分析 JBR425
[0051 ] BioFlux流通設備上的生物膜生長
[0052]為分析流動條件下的生物膜形成，采用B i 〇 F 1 u X 2 0 0系統（F 1 u X i ο η Bioscienceslnc.，South San Francisco，CA)，其允許對專用多孔板進行自動圖像采集。為 使生物膜生長，微流通道(深度，75μπι;寬度，350μπι)采用TSB(50% )以10 · Odyn/cm2灌注。將 107CFU的來自銅綠假單胞菌ATCC 15442,金黃色葡萄球菌ATCC 9144的過夜培養物及兩者 的混合培養物接種于通道。將板在30°C下培養48小時，以使細胞粘附。生物膜形成后，除去 浮游細胞，以279yL/h的流速向輸入孔添加 roS IX(作為對照)和不同處理物，持續30min。采 用Evon顯微鏡（1 OX，17 %光照）記錄結果。
[0053] 結果
[0054] 使用鼠李糖脂和辛酸，銅綠假單胞菌ATCC 15442、金黃色葡萄球菌ATCC 9144及混 合培養的生物膜破裂。
[0055] 在Bioflux流通條件下，測定鼠李糖脂和辛酸一起對由銅綠假單胞菌ATCC 15442 生物膜、金黃色葡萄球菌ATCC 9144及混合培養預形成的生物膜的影響。確定了由辛酸與鼠 李糖脂組合產生的破壞。所有菌株的生物膜生長超過48h。然而，在所有情況下，在微流體通 道周圍的擴展方面具有相當的可變性。銅綠假單胞菌生物膜和混合培養物在流動條件下較 好地形成（圖ΙΑ，E和1G)，然而，由金黃色葡萄球菌ATCC 9144形成的生物膜（圖1C)不厚，但 相對于自由生長的浮游細菌，其足夠良好而被認為是展示出基本不同的生理狀態的多細胞 集群。
[0056] 48小時后，所有的板用1^3 1乂沖洗，并采用鼠李糖脂(0.04%￥八)和辛酸(0.01% V/V)的組合進行處理30分鐘，此階段之后，超過90%的生物膜被破壞。有趣地注意到，革蘭 氏陽性和革蘭氏陰性微生物對鼠李糖脂和辛酸之間的組合的響應不同，這表明相較于當組 分單獨施用的結果(數據未示出），它們之間可能存在協同作用。
[0057]結果如圖1所示，其顯示了在BioFlux通道中生物膜的形成和破壞情況。圖像為相 位對比圖像，并展示了在30°C下培育48小時后完全形成的生物膜，且圖像采用Evon顯微鏡 (10X，17 %光照)記錄如下
[0058] (A)處理前的銅綠假單胞菌ATCC 15442生物膜。
[0059] (B)用鼠李糖脂(0.04%)和辛酸(0.01%)處理后的銅綠假單胞菌ATCC 15442(A)。
[0060] (C)處理前的金黃色葡萄球菌ATCC 9144。
[0061 ] (D)用鼠李糖脂（0.04%)和辛酸（0.01%)處理后的金黃色葡萄球菌ATCC 9144 (C)。
[0062] (E)處理前的混合培養物（銅綠假單胞菌ATCC 15442/金黃色葡萄球菌ATCC 9144)〇
[0063] (F)用鼠李糖脂(0.0 4 % )和辛酸(0.01 % )處理后的混合培養物(E)。
[0064] (G)處理前的銅綠假單胞菌ATCC 15442。
[0065] (Η)用PBS IX處理后的銅綠假單胞菌ATCC 15442(G)。
【主權項】
1. 抗微生物組合物，其包含鼠李糖脂和膜破壞劑。2. 根據權利要求1所述的組合物，其中所述膜破壞劑包含羧酸。3. 根據權利要求2所述的組合物，其中所述膜破壞劑包含有機羧酸。4. 根據前述任一項權利要求所述的組合物，其包含進一步的表面活性劑，所述表面活 性劑包含合成表面活性劑。5. 根據前述任一項權利要求所述的組合物，其中所述鼠李糖脂以總表面活性劑的1重 量％-95重量％，優選10-70重量％存在。6. 根據權利要求1-5任一項所述的組合物，其是家庭護理或個人護理組合物。7. 根據權利要求6所述的組合物，其是個人護理組合物，優選選自洗發劑、調理劑、除臭 劑、皮膚清潔組合物、止汗劑。8. 根據權利要求6所述的組合物，其是家庭護理組合物，優選選自洗衣組合物和硬表面 清洗劑。9. 根據權利要求1-15任一項所述的組合物用于防止或破壞微生物生長的抗微生物的 用途。
【文檔編號】C11D3/48GK105992814SQ201480069581
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2014年12月16日
【發明人】M·A·迪亞茲德里恩佐, A·S·賈梅森, P·S·史蒂文森
【申請人】荷蘭聯合利華有限公司