一種用于鑒別野山參與栽培人參snp分子標記的pcr試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒，其特征是由分離包裝的上游引物、下游引物、無MgCl2的緩沖液、DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷酸單位DNTP和滅菌雙蒸水組成，其中，上下游引物的序列為：上游引物：5’?TCCTCAGCTTATGGATATGC?3’；下游引物：5’?GCAAGTAGAAGTCGAACAA?3’。各組分的用量比為：濃度為2μmol/μL的上游引物和濃度為2μmol/μL的下游引物各0.5μl；無MgCl2的緩沖液17μL；濃度為25mmol/L的MgCl2 1.8μL；濃度為5U/μL的Taq DNA聚合酶0.5μL；濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸單位DNTP 1.2μL；滅菌雙蒸水5.3μL。本發明試劑盒檢測出的SNP標記可準確鑒別野山參和栽培人參。
【專利說明】
一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于中藥材來源品種鑒定技術領域，具體涉及用特異的SNP分子標記鑒定 野山參和栽培人參的方法以及一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒。
【背景技術】
[0002] 人參（Panax ginseng)為五加科人參屬植物的干燥根，系名貴中藥材；人參具補 氣、固脫、生津、益智、安神的功效，因補虛治病效果顯著，臨床應用日趨廣泛。
[0003] 野山參是指生長在深山密林的原生態人參。有的野山參生長長達百年，沒有經過 人工培植、沒有化學肥料的成份，采集非常辛苦，藥用價值極高，是一種名貴中藥材。由于野 山參與栽培人參的市場價值差別極大，導致市場上通過技術手段用栽培人參假冒野山參的 事件層出不窮。目前，鑒別野山參的品質鑒別目前仍是主要沿用民間的經驗性狀鑒別法，即 眼觀其蘆、芐、體、紋、皮、須等性狀來鑒定，尚不具嚴謹的科學性。隨著科技的進步，使假冒 野山參的性狀與野山參非常相似，從而導致通過性狀鑒別法鑒別野山參的真偽越來越難。 雖然有研究表明野山參與栽培人參的人參皂苷類成分有所不同，但是由于單個樣品化學成 分的含量不穩定性，導致區別度不高，鑒別的準確度低。因此，提供一種快速、嚴謹和準確度 高的鑒別野山參與栽培人參的方法和試劑盒為大眾所需。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒。
[0005] 所述的試劑盒是由分離包裝的上游引物、下游引物、無 MgCl2的緩沖液、DNA聚合 酶、MgCl2、脫氧核苷酸單位DNTP和無菌雙蒸水組成，其中，上下游引物的序列分別為：
[0006] 上游引物：5 ' -TCCTCAGCTTATGGATATGC-3 ' ；
[0007] 下游引物:5 ' -GCAAGTAGAAGTCGAACAA-3 '。
[0008] 所述的試劑盒各組分的用量比為:濃度為2μηιο1/μL的上游引物和濃度為2μηιο1/μL 的下游引物各〇. 5yL;無 MgCl2的緩沖液17yL;濃度為25mmol/L的MgCl2 1.8yL;濃度為5U/yL 的Taq DNA聚合酶0.5yL;濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸單位DNTP 1.2yL;滅菌雙蒸水5.3μ L〇
[0009] 所述的PCR試劑盒，其PCR反應程序為:94°C預變性4min，然后94°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸lmin，共30個循環;然后72°C保溫10分鐘，4°C保存。
[0010] 根據本發明的試劑盒，可以提供一種利用SNP分子標記對野山參和栽培人參鑒別 的檢測方法，該方法為
[0011] (1)提取待檢測人參樣品的DNA，作為擴增模板；
[0012] (2)以步驟(1)中提取的DNA為模板，使用本發明PCR試劑盒進行PCR擴增反應；
[0013] (3)對擴增產物進行測序，通過分析擴增產物的DNA序列，確定自DNA序列的5 '端起 第237位的堿基。
[0014] 采用本發明PCR試劑盒擴增的DNA序列如SEQ ID N〇:l所示，其中，如果自DNA序列 的5'端起第236位點處查找野山參的特異位點為C，則樣品鑒定為野山參，如果自DNA序列的 5'端起第236位點處查找野山參的特異位點為缺失，則樣品鑒定為栽培人參。
[0015] 本發明的PCR試劑盒及檢測方法適用性更廣，能檢測所有能提取出DNA的野山參和 栽培人參的任何樣品。因此，能夠實現野山參、栽培人參的藥材、生飲片和粉未的快速、準確 鑒定。
【附圖說明】
[0016] 圖1所示為PCR擴增后DNA的凝膠電泳圖。
[0017]圖2所示為野山參和栽培人參的DNA序列的比對結果，圖上方DNA序列為野山參樣 品ΡΗ01 (第231位-240位堿基），圖下方DNA序列為栽培人參樣品DH01 (第231位-240位堿基）
【具體實施方式】
[0018] 以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0019] 實施例1試劑盒的制備
[0020] 用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒由下列分別包裝的試劑組 成，所述的試劑為：
[0021] a)濃度為2μL?〇1/μL的上游引物0.5yL;
[0022] b)濃度為2μηιο1/μL的下游引物0.5yL;
[0023] c)無 MgCl2 的緩沖液 17yL;
[0024] d)濃度為 25mmol/L 的 MgCh 1.8yL;
[0025] e)濃度為5U/yL的Taq DNA聚合酶0.5yL;
[0026] f)濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸單位DNTP 1.2yL;
[0027] g)滅菌雙蒸水5.3yL。
[0028] 上下游引物的序列分別為：
[0029] 上游引物：5 ' -TCCTCAGCTTATGGATATGC-3 ' ；
[0030]下游引物:5 ' -GCAAGTAGAAGTCGAACAA-3 '。
[0031] 將上述試劑分別按各自常規要求包裝后即制得用于鑒別野山參與栽培人參SNP分 子標記的PCR試劑盒，用于后繼的實驗。
[0032] 實施例2采用本發明的試劑盒對50份野山參樣品和51份栽培人參樣品進行檢測
[0033] 1)從不同產地收集的50份野山參和51份栽培人參樣品，分別取0.2藥材，采用CTAB 法提取樣品的基因組DNA。
[0034] 表1野山參和栽培人參樣品
[0037] 2)PCR 擴增
[0038] 引物序列為上游引物:TCCTCAGCTTATGGATATGC;下游引物:GCAAGTAGAAGTCGAACAA。 引物用無菌去離子水溶解并稀釋至2ymol/yL。
[0039] 25yL 反應體系：無 MgCl2 的緩沖液 17yL，MgCl2 1.8yL(25mmol/L)，dNTPs 1.2yL (2 · 5mmo 1 /L)，上下游引物各0 · 5yL，模板DNA lyL(約 1 OOng)，Taq DNA聚合酶（5U/u 1) 0 · 5yL， 加滅菌雙蒸水至25yL，進行PCR擴增。
[0040] PCR反應程序:在PCR儀上按照以下程序進行擴增反應：
[0041 ] 94°C預變性4min，然后94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個循環；然 后72 °C保溫10分鐘，4 °C保存。
[0042]分別取5yL的PCR擴增產物上樣，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后在凝膠成像 儀上檢測結果（圖1)。
[0043] 3)測序
[0044] PCR產物通過ABI3730/3730xl進行測序:將PCR產物用化學的方法標記熒光素后用 "電進樣"的方法將帶電的樣品分子加到灌好電泳膠的毛細管的進樣端(負極），然后在毛細 管兩端加上直流電壓，樣品中不同大小的DNA片段開始從負極向正極移動，移動的速度受到 片段自身大小影響，片斷越短移動得越快。電泳的結果是使長度不同的帶電DNA片斷互相分 離，并且按片段的長短的順序通過檢測窗口，產生信號，短片段先到達檢測窗口，當標記有 熒光素的DNA片斷移動到檢測窗口時，熒光素受到激光束的激發而產生熒光信號，此熒光信 號被CCD檢測器所檢測并被轉化為電信號傳遞到計算機從而獲得DNA條形碼序列。
[0045] 4)序列比對
[0046] 用DNASTARV7 · 1完成序列的拼接，BioEdit7 · 0 · 9進行比對，利用Sequence Scanner vl.o確定峰圖質量。結果如圖2所示。從圖2中可以看出，共獲得1個SNP位點，通過檢測，所有 50個野山參樣品的DNA序列（SEQ ID No. 1)的第236位為C，而所有51個栽培人參樣品的DNA 序列（SEQ ID No. 1)的第236位為缺失，表明這個SNP位點可特異性地用于鑒定野山參和栽 培人參。
[0047] 實施例2
[0048] 基本同實施例1，所不同的是將實施例1中的野山參和栽培人參樣品制備成飲片， 以該飲片為樣品，提取DNA，進行鑒定，結果也能特異性地檢測到上述的SNP位點。
[0049] 實施例3
[0050] 基本同實施例1，所不同的是將實施例1中的野山參和栽培人參樣品制備成粉末， 以該粉末為樣品，提取DNA，進行鑒定，結果也能特異性地檢測到上述的SNP位點。
[0051] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人 員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒，其特征在于：由分離包 裝的上游引物、下游引物、無 MgCl2的緩沖液、DNA聚合酶、MgCl2、脫氧核苷酸單位DNTP和水組 合，其中，上下游引物的序列分別為： 上游引物：5 ' -TCCTCAGCTTATGGATATGC-3 ' ； 下游引物:5 ' -GCAAGTAGAAGTCGAACAA-3 ' ； 所述的試劑盒各組分的用量比為:濃度為2μηιο1/μL的上游引物和濃度為2μηιο1/μL的下 游引物各〇·5μΜ無 MgCl2的緩沖液17yL;濃度為25mmol/L的MgCl2 1·8μΜ濃度為5U/yL的Taq DNA聚合酶0.5yL;濃度為2.5mmol/L的脫氧核苷酸單位DNTP 1.2yL;滅菌雙蒸水5.3yL。2. 根據權利要求1所述的一種用于鑒別野山參與栽培人參SNP分子標記的PCR試劑盒， 其特征在于:所述PCR試劑盒的PCR反應程序為:94 °C預變性4min，然后94 °C變性30s，55 °C退 火30s，72°C延伸lmin，共30個循環;然后72°C保溫10分鐘，4°C保存。
【文檔編號】C12Q1/68GK105986037SQ201610547481
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】王緒敏, 殷金龍, 郭海燕, 劉貴明, 王國良
【申請人】中國科學院北京基因組研究所