攜帶pap抗原基因的重組腺相關病毒載體及構建方法與應用

攜帶pap抗原基因的重組腺相關病毒載體及構建方法與應用
【專利摘要】本發明公開了一種攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關病毒載體(rAAV)及其構建方法與其應用。該rAAV載體是將腺相關病毒載體中的腺相關病毒的結構基因替換為PAP抗原基因得到。本發明的rAAV的病毒載體可將其攜帶的PAP抗原基因輸送入單核細胞?樹突狀細胞系中，被用于刺激免疫系統的效應細胞。實驗證明，被本發明的rAAV的病毒載體感染的DC所誘導的CTL在體外或患者體內可有效地抑制PAP抗原陽性的惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞。本發明的重組腺相關病毒載體或其相關產品可被用于制備治療抗PAP抗原陽性的前列腺癌的藥物。
【專利說明】
攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體及構建方法與應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物領域中的載體及其應用，特別是涉及一種攜帶前列腺酸性磷酸酶 (prostatic acid phosphatase，PAP)抗原基因的重組腺相關病毒載體及其構建方法以及 其在制備抗PAP陽性的前列腺癌藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV)的基因結構已經被鑒定。1983年， Samulski等人描述了AAV的末端重復片段(上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ, Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了 AAV的低感染顆粒(lip)基因和包膜 (cap)基因 （Hermonat PL,Labow MA,Wright R, Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells .Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A.81:6466-6470 ·)。1986年，Labow 等人鑒定了位于上游 5'端片段和rep基因之間的p5啟動子（Labow MA,Hermonat PL,Berns KI .Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)〇
[0003] 1984年，美國Paul L.Hermonat證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療。目前，主 要是歐美國家在進行以AAV為基礎的基因治療人類疾病的臨床試驗。據美國糧食和藥品管 理局統計，現有十余項以AAV為基礎的基因治療臨床試驗正在進行，主要是將攜帶治療基因 的AAV病毒注入患者體內，使其在體內表達治療基因，從而達到治療疾病的目的。主要針對 治療的疾病是帕金森氏綜合癥、風濕性關節炎、血友病、心力衰竭、進行性肌萎縮和奧茲海 默綜合癥等非腫瘤性疾病。2012年11月2日歐盟批準UniQure公司的Glybera產品在歐盟27 個成員國使用，這是西方國家第一個獲批準的基因治療藥物，它是利用腺相關病毒I型 (AAV-Ι)攜帶外源基因用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病(LPLD)的基因藥物。
[0004] AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因產物輔助，才 能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。目前AAV可分為12種血清型(AAV-1~AAV-12)。其中，2 型腺相關病毒載體(AAV-2)因具有無致病性、宿主范圍廣、目的基因長期表達等優點而成為 當前基因治療中最有潛力的病毒載體之一。AAV-2基因組全長約4700堿基對(bp)，兩端為重 復末端片段(TR)，中間為病毒的結構基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不 穩定性及其攜帶外源性基因（治療基因）長度有限等方面缺陷，因此有必要對其進行基因重 組形成重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)〇
[0005] 如何構建可用于制備治療疾病的藥物的重組腺相關病毒及其相關產品是本領域 技術人員努力的方向。

【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是:彌補上述現有技術的不足，提出一種穩定性高、攜 帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體及其構建方法與應用。
[0007] 本發明的技術問題通過以下的技術方案予以解決：
[0008] -種攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體，將腺相關病毒載體中的腺相關病 毒的結構基因替換為PAP抗原基因得到的重組腺相關病毒載體。
[0009] 已知的腺相關病毒載體具有P5啟動子，為提高目的基因的轉錄水平，還可進一步 將PAP抗原基因插入已經成功構建的啟動子為巨噬細胞病毒(CMV)啟動子、β-肌動蛋白啟動 子(β-actinp)、猴空泡病毒40(SV40)早期啟動子(SV40p)中的一種的AAV載體中。
[0010] 本發明還提供攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體的構建方法:在腺相關病 毒載體中，將腺相關病毒的結構基因剔除，在剔除的位置上插入PAP抗原基因，得到重組腺 相關病毒載體。
[0011] 本發明所提供的構建方法，是使用基因重組的方法，使用限制性內切酶先將AAV載 體骨架DNA切斷，再運用DNA連接技術，將特異抗原基因 PAP與被切斷的AAV載體DNA進行連 接，得到攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體。該rAAV載體的啟動子為p5啟動子或者下 述三種啟動子中的一種：巨細胞病毒（cytomegalovirus，CMV)啟動子、β-肌動蛋白啟動 子、SV40早期啟動子。
[0012] 一種與攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產品，包括ΡΑΡ重組腺相關 病毒的質粒載體、ΡΑΡ重組腺相關病毒的病毒載體、被所述ΡΑΡ重組腺相關病毒的病毒載體 感染或轉染的細胞系，所述ΡΑΡ重組腺相關病毒的質粒載體由上述攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組 腺相關病毒載體或者上述構建方法制得的攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體制得； 所述ΡΑΡ重組腺相關病毒的病毒載體由所述ΡΑΡ重組腺相關病毒的質粒載體進行細胞培養 得到。
[0013] 一種與攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產品的制備方法，ΡΑΡ重組 腺相關病毒的質粒載體的制備:將如上述攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體或者上 述構建方法制得的攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體導入基因工程大腸桿菌DH5a感 受態細胞，用含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB平板進行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質粒并 純化，得到PAP重組腺相關病毒的質粒載體;PAP重組腺相關病毒的病毒載體的制備：以所述 PAP重組腺相關病毒的質粒載體和pHelper質粒共轉染AAVp細胞得到PAP重組腺相關病毒的 病毒載體;PAP重組腺相關病毒感染或轉染的細胞系的制備：用所述PAP重組腺相關病毒的 病毒載體感染或轉染單核細胞或樹突狀細胞得到，所述細胞系包括單核細胞-樹突狀細胞 系(所述AAV/PAP中的相關基因一 PAP抗原基因可在單核細胞-樹突狀細胞系中在轉錄啟動 子的作用下獲得表達）。
[0014] -種如上所述的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體或者如上所述的相關產 品在制備抗PAP抗原陽性的前列腺癌藥物中的應用。
[0015] 藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是多種多樣的，如細胞培養液 (基）、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種 藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規的稀釋劑、吸收促進劑和表面活性劑等。
[0016] 用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內的單核細胞，再將AAV/PAP的病毒載體感染 或轉染患者的單核細胞。或將轉化有PAP的成熟的樹突狀細胞所刺激產生的細胞毒性T淋巴 細胞回輸腫瘤患者。
[0017] 本發明與現有技術對比的有益效果是：
[0018] 本發明提供了一種穩定性高、攜帶外源性基因（PAP)的重組腺相關病毒(rAAV)載 體(可簡稱為AAV/PAP)。AAV/PAP是在發明人已經成功構建的AAV載體的骨架中插入PAP抗原 基因。PAP抗原基因為一種前列腺癌抗原基因，AAV載體骨架有4種，其區別在于分別攜帶4種 不同的啟動子基因，分別為P5啟動子、巨噬細胞病毒(CMV)啟動子(CMVp)、人beta肌動蛋白 啟動子(β-actinp)或猴空泡病毒40(SV40)早期啟動子(SV40p)。在本發明的重組腺相關病 毒(AAV/PAP)載體可將其攜帶的PAP抗原基因輸送入單核細胞-樹突狀細胞系中，存在PAP抗 原基因的細胞被用于刺激免疫系統的效應細胞(不局限于T淋巴細胞和B淋巴細胞）。實驗證 明，被本發明的rAAV感染的樹突狀細胞和所誘導的細胞毒性T淋巴細胞在體外和患者體內 可有效地抑制相關惡性腫瘤細胞的生長或者殺滅腫瘤細胞，因而，本發明的攜帶PAP抗原基 因的重組腺相關病毒載體或與本發明重組腺相關病毒載體相關的產品可被用于制備抗PAP 抗原陽性的惡性腫瘤的細胞免疫治療。本發明在惡性腫瘤的臨床治療和應用中具有重要的 理論和實際意義，應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明【具體實施方式】的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體(AAV/PAP) 的結構示意圖。
[0020] 圖2為本發明【具體實施方式】的構建攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體(AAV/ PAP)以及制備具有感染性的AAV/PAP流程圖。
[0021] 圖3A為本發明【具體實施方式】的PAP CDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖。
[0022]圖3B為本發明【具體實施方式】的PAP基因克隆及重組腺相關病毒載體AAV/PAP的雙 酶切鑒定結果圖。
[0023]圖4為本發明【具體實施方式】的所獲得的PAP基因序列與美國NCBI Gene Bank公布 的基因序列比較圖。
[0024] 圖5為本發明【具體實施方式】的重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體的病毒滴 度檢測結果圖。
[0025] 圖6為本發明【具體實施方式】的重組腺相關病毒載體AAV/PAP感染腫瘤患者單核細 胞為基礎的殺滅腫瘤實驗流程圖。
[0026] 圖7a_7d為本發明【具體實施方式】的分別含不同的啟動子的重組腺相關病毒載體 AAV/PAP的病毒載體感染DC的效率檢測結果圖。
[0027]圖8a_8c為本發明【具體實施方式】的重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染 的DC表達⑶80、⑶83以及⑶86水平的檢測結果圖。
[0028]圖9為本發明【具體實施方式】的重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的DC 所誘導的CTL的IFN- γ水平與對照組對比的檢測結果圖。
[0029] 圖10為本發明【具體實施方式】的重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的DC 所誘導的CTL體外殺傷PAP陽性和陰性細胞的51Cr (絡-51)實驗結果圖。
[0030] 圖11為本發明【具體實施方式】的在重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的 DC所誘導的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特異性抗原(PSA)水平的變化情 況圖。
[0031 ]圖12為本發明【具體實施方式】的在重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的 DC所誘導的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清PAP水平的變化情況圖。
【具體實施方式】
[0032]下面結合【具體實施方式】并對照附圖對本發明做進一步詳細說明。
[0033] 發明人已經成功地將攜帶AAV 2型全基因組DNA的pBR322質粒（pBR-AAV2)中的 AAV-2的包括rep和cap基因在內的全部結構基因刪除，僅保留末端重復片段，或保留末端重 復片段和P5啟動子，并插入寡核苷酸片斷，以提高重組腺相關病毒(rAAV)DNA復制的效率和 重組腺相關病毒的穩定性，由此獲得AAV-2載體的基本骨架，所應用的AAV-2載體具有p5啟 動子，將PAP抗原基因插入其中。此外，也成功地用巨細胞病毒(CMV)啟動子、猴空泡病毒40 (SV40)早期啟動子、β-肌動蛋白啟動子取代AAV-2載體中原有的p5啟動子。也即本發明實施 方式中的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體(AAV/PAP)的啟動子可以為p5啟動子或 CMV啟動子或β-肌動蛋白啟動子或SV40早期啟動子。此外，在此基礎上成功地制備具有感染 性的rAAV病毒顆粒(參見中國專利ZL201110125683.X)，為研制新的rAAV產品奠定了基礎。
[0034] 前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)系酸性磷酸酶同工酶，由 兩個相同亞單位組成，其分子量為100kD，由成熟的前列腺上皮細胞溶酶體產生。PAP是一種 前列腺外分泌物中的糖蛋白，其在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的水解酶。 由于PAP特異性地在前列腺細胞表達，并在前列腺癌細胞高表達，并具有較強的免疫原性， 而前列腺為非維持人體生命的必需器官，故大量的實驗和臨床研究證明PAP為免疫治療的 理想的革G抗原。2010年美國糧食和藥品管理局（FDA)正式批準將美國Dendreon公司的 Provenge用來治療激素無效的無癥狀或癥狀輕微的轉移性前列腺癌，成為首個被美國FDA 批準上市的新型治療性腫瘤疫苗。Provenge是一種自體源性樹突細胞疫苗，在該疫苗中，其 藥物成份為一種融合蛋白，即將前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原蛋白融合于免疫刺激細胞因 子粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。將該融合蛋白刺激的患者樹突狀細胞輸回患 者體內，發動細胞免疫反應，從而使T細胞能辨識并殺滅PAP抗原陽性的癌細胞。臨床試驗表 明Provenge可降低患者的死亡風險，平均延長生存期4.1個月。雖然隨后的臨床試驗證明 Provenge的療效并不理想，但該PAP抗原已經被公認為細胞免疫治療的一個理想的祀抗原， 在抗腫瘤的細胞免疫治療中發揮重要的作用。
[0035]本發明的AAV/PAP載體是在發明人已經成功構建的腺相關病毒載體的骨架中插入 PAP抗原基因得到重組腺相關病毒載體，與載體相關的產品包括質粒載體、病毒載體和細胞 系。
[0036]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，Russel1，David ff., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0037] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列測定均由美國Life Technologies公司完成。
[0038] 實施例1、攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體(AAV/PAP)的構建及鑒定
[0039] 一、材料及其來源：
[0040] 1.四種具有不同啟動子的AAV 2型(AAV-2)pBR322質粒(pBR-AAV2):由發明人構建 成功（參見中國專利21^201110125683.乂，0056~0059段口81?-44￥2質粒的改建、？0財廣增啟動 子、將擴增的啟動子插入改建的PBR-AAV2質粒中等內容）。四種啟動子分別為AAV p5啟動子 (AAV p5)、巨噬細胞病毒啟動子(CMVp)、SV40早期啟動子（SV40p)和人β-肌動蛋白啟動子 (β-actinp)。該質粒的特點為兩端完整的重復末端片段(TR)序列，并在兩端TR的第75位核 苷酸序列處均插入9個核苷酸CTGCGCTGG組成的片段，目的是提高重組AAV病毒(rAAV)的穩 定性以及提高病毒的復制效率，并且已剔除了AAV-2的包括復制蛋白基因（rep)和包膜蛋白 基因（cap)在內的全部結構基因。
[0041 ] 2.人前列腺癌組織:來源于手術切除的癌組織，免疫組化證實PAP抗原陽性。
[0042] 3.基因擴增核苷酸引物：根據美國基因庫中公開發表的人前列腺酸性磷酸酶 (PAP)基因序列設計(GenBank: ΝΜ_001099 · 4)。
[0043] 二、構建本實施例攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體(如圖1和2所示）
[0044] 構建時:包括以下步驟：：1)改建AAV 2型pBR322質粒:使用限制性內切酶Bst98 I 和Hpa I將AAV 2型pBR322質粒中的AAV 2型腺相關病毒中的結構基因切除，然后將含有限 制性內切酶EcoR I和EcoR V酶切位點的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入質粒中，保 留兩端的TR序列或者在兩端的TR序列的第75位核苷酸序列處均插入由9個核苷酸組成的片 段CTGCGCTGG;2)將啟動子插入步驟1)得到的改建的AAV 2型pBR322質粒中，構建攜帶有啟 動子的AAV 2型pBR322質粒;所述啟動子為p5啟動子或者下述三種啟動子中的一種：巨噬細 胞病毒啟動子、肌動蛋白啟動子或SV40早期啟動子。3)獲取PAP cDNA; 4)將已構建的攜帶 有啟動子的AAV 2型pBR322質粒和步驟1)得到的PAP cDNA進行限制性內切酶反應，然后進 行DNA連接反應，得到攜帶有啟動子和PAP cDNA的重組腺相關病毒載體（可命名為AAV/ PAP)〇
[0045]具體過程包括以下步驟：
[0046] 1.獲取cDNA，具體方法為:采用Trizol試劑(美國Life Technology公司生產)獲取 前列腺癌組織的總mRNA。首先將PAP抗原陽性的前列腺癌組織反復碾磨后，加入5m 1 Trizol，按照其說明書進行操作。離心獲取上清液后，以75%(V/V)乙醇洗滌二次，再加入無 水乙醇，離心沉淀。沉淀物以去離子水溶解，得到總mRNA溶液，將濃度調至1 Ong/μL。以10μ1 總mRNA溶液為模板，進行逆轉錄反應(RT)，合成總cDNA。以25μ1為例的逆轉錄反應體系包 括:0.5yg oligo(dT)15(美國Promega公司）、0.5mM dNTPs(美國Promega公司）以及200U Μ-MLV逆轉錄酶(美國Promega公司）。反應條件為37°C，1小時，得到總cDNA。
[0047] 2.獲取PAP cDNA，具體方法為：總cDNA在引物1(如SEQ ID NO: 1): CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2 (SEQ ID NO: 2): CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引導下PCR擴 增，得到PAP cDNA。PCR擴增條件為:先94°C4分鐘;再94°C30秒，60°C35秒，72°C90秒，共30個 循環；最后72°C5分鐘，反應結束后，對PCR產物進行1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測，在 1182bp處出現一條預期的特異性cDNA條帶。如圖3A所示，其中，1、2是PAP cDNA，3是DNA分子 量標準。
[0048] 3.構建攜帶PAP cDNA的重組腺相關病毒載體:分別對攜帶4種不同啟動子的pAAV-2質粒和PAP cDNA分別用限制性內切酶進行酶切后，進行DNA連接反應。所用限制性內切酶 均購自美國Promega公司。酶切反應體系為：lyg pAAV質粒或PAP cDNA; 10U限制性內切酶 Xba I和Xho I(購自美國Promega公司），2·5μ1 10X緩沖液C以及19·5μ1去離子水;反應條 件為：在37°C下水浴4小時。連接反應體系為：500ng酶切后的質粒，300ng酶切后的ΡΑΡ cDNA，10IU T4DNA連接酶(購自美國Promega公司），1.5μ1 10 XT4DNA連接緩沖液以及11.5μ1 去離子水;反應條件為:在4°C下8小時。分別得到攜帶有AAV的ρ5啟動子和PAP cDNA的重組 腺相關病毒載體、攜帶有CMV啟動子和PAP cDNA的重組腺相關病毒載體、攜帶有SV40早期啟 動子和PAP cDNA的重組腺相關病毒載體、以及攜帶有β-肌動蛋白啟動子和PAP cDNA的重組 腺相關病毒載體。
[0049] 4.將連接后的AAV/PAP分別導入基因工程大腸桿菌(E.coli)DH5a感受態細胞(美 國Invitrogen公司），用含100yg/mL氨節青霉素的LB平板進行抗性篩選，挑取白色單菌落， 提取質粒并純化，得到大量的AAV/PAP的質粒載體。
[0050]三、重組腺相關病毒質粒的鑒定
[0051 ] 1.限制性內切酶酶切分析:將AAV/PAP質粒載體以限制性內切酶Xba I和Xho I進 行酶切反應，反應體系、條件以及操作過程同實施例1中的二.3。分析結果見圖3B所示，其 中，1、2是兩個陽性克隆;3是DNA分子量標準，證明構建AAV/PAP質粒載體成功。
[0052] 2. DNA序列測定:將AAV/PAP進行DNA序列測定。其測序結果的核苷酸序列如圖4所 示，與基因庫相應的PAP基因對比，99 %同源，進一步證明構建AAV/PAP質粒成功。
[0053]實施例2、重組腺相關病毒載體(rAAV)的制備及滴度測定 [0054]材料及其來源：
[0055] A.實施例1構建的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體AAV/PAP。
[0056] B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的輔助質粒pHelper:由美國阿肯色大學醫學院 附屬醫院基因治療中心劉勇教授構建(Liu，Y.，Chiriva_Internati，M.，Grizzi，F. Salati， E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0057] C.含有整合于細胞染色體并表達的腺病毒基因化142八44、￥八1和￥八11基因）的 AAVp細胞株：由美國阿肯色大學醫學院附屬醫院基因治療中心建立（1^11，￥.，(：11化"&-Internati，M.，Grizzi，F.Salati，E.，Roman，J·J·，Lim S·，and Hermonat,P.L. Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0058] D.脂質體轉染試劑Lipof ectin:購自美國Invotrogen公司。
[0059] E.DMEM培養基和胎牛血清(或小牛血清）：購自美國Cellgro公司。
[0060] F. PCR DIG標記試劑盒和DIG雜交檢測試劑盒:購自瑞士Roche公司。
[0061 ] G.DNA拷貝數標準：分別為1012拷貝數（copies)Ail至109(copies)Ail，購自美國 Promage公司。
[0062] -、重組腺相關病毒載體(rAAV)的制備
[0063] 參照圖2,用下述方法制備重組腺相關病毒(rAAV)，以制備一盤10.0cm細胞培養皿 的病毒為例，當AAV-HEK293細胞在二氧化碳細胞培養箱中生長至約占培養皿面積70%時， 進行如下操作：
[0064] A.按照Lipofectin的使用說明進行操作：將1 .Oyg AAV/PAP的質粒載體，1. Oyg pHelper質粒，4.ΟμL Lipofectin和50.ΟμL含5% (V/V)胎牛血清(或小牛血清）的DMEM培養 基混勻，室溫靜置20分鐘。
[0065] Β.將混合液加入細胞培養皿中，繼續置于二氧化碳細胞培養箱中培養。
[0066] C. 72小時后，收獲培養皿中的所有細胞和培養液。
[0067] D.劇烈振蕩1分鐘后，離心，保留上清，即rAAV病毒液。
[0068] E.將收集的rAAV病毒液過濾除菌，獲得的攜帶前列腺酸性磷酸酶基因 （PAP cDNA) 的AAV病毒命名為AAV/PAP的病毒載體。
[0069] 二、重組腺相關病毒載體(rAAV)的病毒滴度測定
[0070] 采用常規的斑點雜交法，對步驟一獲得的AAV/PAP的病毒載體進行病毒滴度測定， 具體方法包括以下步驟:僅所用的DNA探針為針對PAP基因的特異性探針。
[0071] A.采用常規的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒顆粒DNA。
[0072] B.將尼龍膜置于斑點印跡儀中，加入經堿變性的rAAV病毒顆粒DNA，并加入DNA拷 貝數標準，抽真空。
[0073] C.取出尼龍膜干燥后，紫外線固定。
[0074] D.用PCR DIG標記試劑盒并參照試劑盒說明書制備DIG標記的特異性探針，探針為 "實施例1中所獲得的PAP cDNA" 1CR擴增結束后，對PCR擴增產物進行1.2% (V/V)瓊脂糖凝 膠電泳，在紫外線下檢測PCR擴增產物，結果出現陽性條帶，表明探針標記成功。
[0075] E.用DIG雜交檢測試劑盒并參照試劑盒說明書，在雜交爐中對各種rAAV病毒顆粒 DNA進行DNA雜交。AAV/PAP的病毒載體的病毒滴度檢測結果如圖5所示，其中：1為標準品。2-4為3批AAV/PAP。每批AAV/PAP的滴度約在1012copies/ml;AAV/PAP的病毒載體的病毒滴度 為 1012拷貝（copies)/ml。
[0076]實施例3、AAV/PAP的病毒載體導入單核細胞-樹突狀細胞系的殺滅腫瘤實驗 [0077]材料及其來源：
[0078] A.rAAV病毒:AAV/PAP的病毒載體。
[0079] B.AIM-V細胞培養基:購自美國Life Technologies公司。
[0080] c.細胞因子:集落細胞刺激因子(GM-CSF)，白細胞介素2,4(IL-2，IL-4)以及腫瘤 壞死因子(TNF-α)購自美國R&D公司。
[0081 ] D. PAP陽性的原代腫瘤細胞:為從患者的腫瘤組織中分離的前列腺癌細胞。
[0082] E.PAP陽性細胞:為從患者的正常前列腺組織分離的前列腺細胞。
[0083] F.PAP陰性原代細胞:肺、乳腺、肝和腎臟的上皮細胞分別從正常組織中分離獲得。
[0084] G.分別針對人MHC I類抗原的多克隆抗體和人前列腺酸性磷酸酶的單克隆抗體： 購自美國BD公司。
[0085] 一、殺滅腫瘤實驗
[0086]如圖6所示，將本發明的攜帶PAP抗原基因的rAAV的病毒載體感染腫瘤患者單核細 胞為基礎的殺滅腫瘤實驗的過程包括以下步驟：
[0087] A.取腫瘤患者50-150毫升外周血，用血細胞分離儀(或淋巴細胞分離液)按常規方 法獲取外周血單個核細胞(PBMC)，與AM-V培養基混勻后，加入細胞培養瓶，置于恒溫二氧 化碳培養箱中培養2小時。
[0088] B.分離細胞，除去懸浮細胞，保留貼壁細胞（即單核細胞）。懸浮細胞即外周血淋巴 細胞，將其與AIM-V培養基混勻后，繼續培養備用。
[0089] C.在單核細胞中加入一種(或多種，效果更佳)本發明實施例2獲得的rAAV病毒，加 入量為1〇〇~1000M0I(本例匯中為100M0I)，同時再加入GM-CSF(800IU/ml)，繼續培養4小 時。
[0090] D.除去步驟C的舊培養基，補充含GM-CSF，IL-4(800IU/ml)以及TNF-a(20IU/ml)的 AIM-V培養基，繼續培養。
[0091] E.培養6天后，收獲成熟的樹突狀細胞(DC)，并與所培養的外周血淋巴細胞混合， 在A頂-V培養基中加入IL-2(20IU/ml)，繼續培養。
[0092] F.培養至6-12天后，收獲激活的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)進行檢測。
[0093] 二、樹突狀細胞(DC)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的檢測
[0094] A. rAAV病毒感染外周血單個核細胞的效率檢測
[0095] 采用常規的熒光抗體標記染色法，用針對前列腺酸性磷酸酶(PAP)的特異性熒光 抗體(購自美國BD公司）標記步驟一獲得的被本發明的rAAV病毒感染的單核細胞或未成熟 的DC，再進行流式細胞儀檢測陽性細胞的數量。其中，rAAV病毒感染外周血單核細胞的效率 檢測結果如圖7&-7(1所示，分別攜帶不同啟動子，即AAV p5、CMVp、SV40p或β-actinp的AAV/ PAP的病毒載體感染單核細胞或DC的效率分別為87.2%、90.5%、91.8%和90.6%，即約 90 %的DC可表達PAP抗原，證明約90 %左右的DC可被PAP抗原刺激，DC的抗原攝取、加工和提 呈率較高。
[0096] B.樹突狀細胞(DC)表達的⑶分子水平的檢測
[0097] DC表達⑶80、⑶83以及⑶86的水平與DC的功能呈正相關。用與步驟A相同的檢測方 法，即分別采用熒光標記的針對這三種CD分子的抗體(購自美國BD公司）對步驟一獲得的被 本發明AAV/PAP的病毒載體感染的DC表達CD80、CD83以及CD86的水平進行常規的流式細胞 技術檢測。AAV/PAP的病毒載體感染的DC表達CD80、CD83以及CD86水平的檢測結果分別如圖 8 &-8〇所示，被44￥"^?感染的0(：所表達的^分子水平較高（平均表達率分別為42.07%、 82.54%和74.21 % )，有利于刺激細胞免疫反應。證明構建和制備的PAP抗原基因的rAAV病 毒感染DC后，所誘導的DC的功能強大。
[0098] C.細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達的γ干擾素（IFN-γ )水平的檢測 [0099] CTL的功能及其殺傷腫瘤細胞的能力與IFN-γ的表達水平呈正相關。用與步驟Α類 似的方法檢測被本發明rAAV病毒感染的DC所誘導的CTL表達IFN-γ的水平（以無刺激的DC 所誘導的CTL為對照）AC與外周血淋巴細胞混合培養結束后，收獲細胞，采用傳統的胞內染 色法進行細胞熒光染色標記，所用抗體為針對IFN-γ的熒光標記抗體(購自美國BD公司）， 最后利用流式細胞儀檢測結果。其中，以攜帶CMV啟動子(CMVp)的重組腺相關病毒AAV/PAP 的病毒載體為例，檢測其感染的DC所刺激產生的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)表達的伽瑪干擾 素（IFN-γ)水平，如圖9所示，其中，左圖為對照組，右圖為實驗組，結果顯示，其CTL表達 IFN- γ的水平(平均表達率為39.0% )明顯高于對照，提示細胞免疫反應較強，CTL的殺傷活 性高。證明被本發明構建和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導的CTL功能強大。 [0100]三、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)殺傷腫瘤細胞試驗
[0101]被AAV/PAP的病毒載體感染的DC與淋巴細胞混合培養結束后，將被AAV/PAP的病毒 載體感染的DC所誘導的細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)按20:1(淋巴 細胞:腫瘤細胞)與PAP陽性的腫瘤細胞混合后，采用傳統的51Cr(鉻-51)殺傷試驗，檢測CTL 殺傷腫瘤細胞的活性、MHC class I限制性和殺傷特異性。如圖10所示，以攜帶CMV啟動子 (CMVp)的重組腺相關病毒載體AAV/PAP的病毒載體為例，其感染的DC所誘導的CTL體外殺傷 PAP陽性和陰性細胞的51Cr (鉻-51)實驗結果。被本發明的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘 導的CTL能夠有效地裂解(殺傷)PAP陽性的前列腺癌細胞和前列腺細胞，前列腺癌細胞的平 均殺傷率近60%，而對PAP陽性的前列腺細胞的平均殺傷率近35%，明顯低于前列腺癌的殺 傷率，可能與正常的前列腺細胞的PAP低水平表達有關。
[0102] 以PAP抗原陰性的肺、乳腺細胞、肝和腎臟的上皮細胞為對照，再用上述相同的方 法檢測上述被AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導的CTL殺傷細胞的特異性。被本發明構建 和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導的CTL對上述PAP抗原陰性的細胞無殺傷作 用，如圖10所示，證明被本發明構建和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導的CTL具 有抗原特異性，即對抗原陰性的細胞無殺傷作用。
[0103] 對于上述PAP陽性的前列腺癌細胞和前列腺細胞，分別先用MHC I類抗體(購自美 國R&D公司)或前列腺酸性磷酸酶的單克隆抗體進行預處理后，再采用傳統的51Cr(鉻-51)殺 傷試驗，以檢測CTL的殺傷活性。檢測結果表明對PAP陽性細胞的殺傷效果明顯下降。該結果 證明被本發明構建和制備的AAV/PAP感染的DC所誘導的CTL具有MHC Class I限制性和PAP 抗原特異性。
[0104] 圖10中的檢測結果表明CTL殺傷(裂解)PAP陽性的前列腺癌細胞以及前列腺細胞 的效率分別為約60%和35%，但對PAP抗原陰性的肺、乳腺、肝和腎細胞無殺傷作用。而且預 先分別經PAP抗體以及MHC I抗體封閉后，CTL對PAP陽性的前列腺癌細胞以及前列腺細胞殺 傷作用明顯下降。實驗結果提示該殺傷作用具有PAP抗原特異性和MHC I抗原限制性，具有 CTL殺傷作用的特征。綜合上述檢測結果，證明被本發明構建和制備攜帶前列腺酸性磷酸酶 (PAP)抗原基因的rAAV病毒感染的DC所誘導的CTL對PAP陽性細胞具有較好的殺傷效果，有 可能用于臨床抗前列腺癌的靶向性細胞免疫治療。
[0105] 實施例4、以PAP為靶點的抗前列腺癌的靶向性細胞免疫治療初步臨床試驗
[0106] 本實施例提供一種攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體或者其相關產品在制 備抗腫瘤藥物中的應用，尤其是在抗PAP陽性的惡性腫瘤藥物中的應用，其中PAP陽性的惡 性腫瘤包括但不限于前列腺癌等。
[0107]抗腫瘤藥物的活性成分為上述攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體或與攜帶 PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產品。藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑 的選擇是多種多樣的，如細胞培養液(基）、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時候， 在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體，所述載體可包括藥學領域常規 的稀釋劑、吸收促進劑和表面活性劑等。
[0108] 如以本發明的PAP重組腺相關病毒為載體，將PAP基因導入單核細胞-樹突狀細胞 系，并誘導產生樹突狀細胞(Dendritic Cells，DC)，以達到患者體外和體內免疫刺激細胞 免疫反應的目的，用以殺滅PAP抗原陽性的腫瘤細胞，或以該DC刺激產生的細胞毒性T淋巴 細胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)，以CTL直接殺滅PAP陽性的腫瘤細胞。也即用藥方式 可為先分離出腫瘤患者體內的單核細胞，再將AAV/PAP的病毒載體感染或轉染患者的單核 細胞或樹突狀細胞(DC)，再將轉化有PAP抗原基因的DC或其刺激產生的細胞毒性T淋巴細胞 (CTL)回輸腫瘤患者。為提高療效，上述藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物 等進行組合治療。
[0109] 上述藥物的用量一般AAV/PAP: 100M0I/單核細胞/次，可根據實際情況調整。
[0110] 本實施例還提供一種體外殺滅PAP陽性的腫瘤的方法，包括以下步驟：
[0111] 1)將腫瘤所在體系（該體系可通過人工模擬的方式產生或腫瘤患者體內）中自然 產生的單核細胞-樹突狀細胞(DC)被AAV/PAP的病毒載體感染或轉染，或被與AAV/PAP載體 相關的產品處理，各自得到處理后的細胞；
[0112] 2)將步驟1)中處理后的單核細胞-DC加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤;或將未被處 理的T淋巴細胞與所述處理后的單核細胞-DC混合培養形成抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞 ( CTL)，再將該抗原特異性CTL加入腫瘤所在體系中殺滅PAP陽性的腫瘤;或將被處理的CTL 和未被處理的單核細胞-DC加入腫瘤所在體系中殺滅PAP陽性的腫瘤。
[0113]也即，給予一個腫瘤患者回輸PAP抗原特異性CTL，該細胞由來源于患者的自然產 生的T淋巴細胞與來源于該患者的單核細胞-DC混合培養產生的。在混合培養之前，這些在 單核細胞-DC已經被本發明攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒的病毒載體感染或者轉染， 或被與本發明重組腺相關病毒載體相關的產品處理;或者，給予一個腫瘤患者回輸來源于 患者的單核細胞-DC。在回輸之前，這些在單核細胞-DC已經被本發明攜帶PAP抗原基因的重 組腺相關病毒的病毒載體感染或者轉染，或被與本發明重組腺相關病毒載體相關的產品處 理。
[0114] 本例中具體為:將實施例3中被AAV/PAP的病毒載體感染從腫瘤患者分離的樹突狀 細胞(DC)所誘導的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)回輸6例內分泌治療失敗并復發，血清PSA和 PAP升高的前列腺癌癥患者，以患者的血清PSA和PAP的變化為標準判斷療效。
[0115] 輸注細胞數為1 X 108-5 X 108個CTL細胞(本例中，輸注量為100μ1/5Χ 106個單核細 胞/每次）。治療療程:通常為6個月，每月2次，如圖11和12所示，分別為重組腺相關病毒AAV/ ΡΑΡ病毒感染的DC所誘導的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特異性抗原 (PSA)和PAP水平的變化情況，結果顯示經過6個月的治療，被本發明的rAAV的病毒載體感染 的DC所誘導的CTL在大部分受試患者體內能夠發揮一定的療效，可降低血清PSA和PAP的水 平，甚至恢復正常以及改善癥狀。經治療，患者的血清PSA和PAP的變化呈一致性，其中4例的 血清PSA和PAP水平明顯降低，甚至恢復正常，1例變化不明顯，1例出現上升。所有患者在治 療過程中無明顯的毒副作用發生。該試驗結果提示通過該種技術制備的CTL不僅具有一定 的療效而且安全性較高，未來可用于臨床抗前列腺癌的靶向性細胞免疫治療。
[0116] 工業應用性
[0117] 實驗證明，被本發明攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關病毒 (AAV/PAP)的病毒載體感染的樹突狀細胞(DC)和所誘導的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)可有效 地抑制PAP陽性的前列腺癌細胞的生長或者殺滅該種腫瘤細胞。因而，本發明的PAP重組腺 相關病毒載體(AAV/PAP)或與本發明PAP重組腺相關病毒載體相關的產品可被用于制備抗 腫瘤藥物進行規模化和標準化生產，在前列腺癌的臨床治療應用中具有重要的意義。
[0118]以上內容是結合具體的優選實施方式對本發明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發明的具體實施只局限于這些說明。對于本發明所屬技術領域的普通技術人員來說，在 不脫離本發明構思的前提下做出若干替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應當視為 屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關病毒載體，其特征在于:將 腺相關病毒載體中的腺相關病毒的結構基因替換為PAP抗原基因得到的重組腺相關病毒載 體。2. 根據權利要求1所述的重組腺相關病毒載體，其特征在于:所述重組腺相關病毒載體 中的啟動子為AAV p5啟動子、巨噬細胞病毒啟動子、β-肌動蛋白啟動子或SV40早期啟動子 中的一種。3. -種攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關病毒載體的構建方法，其特征在于:在腺相關病 毒載體中，將腺相關病毒的結構基因剔除，在剔除的位置上插入ΡΑΡ抗原基因，得到重組腺 相關病毒載體。4. 根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于:還包括以下步驟:將所述腺相關病毒 的ρ5啟動子替換為下述三種啟動子中的一種：巨細胞病毒啟動子、β-肌動蛋白啟動子、 SV40早期啟動子。5. 根據權利要求3或4所述的構建方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 獲取PAP cDNA; 2) 將已構建的攜帶有啟動子的AAV 2型pBR322質粒和步驟1)得到的PAP cDNA進行限制 性內切酶反應，然后進行DNA連接反應，得到攜帶有啟動子和PAP cDNA的重組腺相關病毒載 體。6. 根據權利要求5所述的構建方法，其特征在于:所述步驟1)中包括以下步驟：11)從前 列腺癌組織中提取PAP的總mRNA，由總mRNA進行逆轉錄反應，合成總cDNA; 12)以所述總cDNA 為模板，在引物 1: CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2: CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引導下進行 PCR擴增，得到所述PAP cDNA。7. -種與攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產品，其特征在于:所述產品 為PAP重組腺相關病毒的質粒載體、PAP重組腺相關病毒的病毒載體、或被所述PAP重組腺相 關病毒的病毒載體感染或轉染的細胞系;所述PAP重組腺相關病毒的質粒載體由權利要求1 ~2所述的或者權利要求3~6任一項所述的構建方法制得的攜帶PAP抗原基因的重組腺相 關病毒載體制得;所述PAP重組腺相關病毒的病毒載體由所述PAP重組腺相關病毒的質粒載 體進行細胞培養得到。8. 如權利要求7所述的產品，其特征在于:所述細胞系為單核-樹突狀細胞系，該單核-樹突狀細胞系為PAP陽性的前列腺癌所在體系中自然產生的，被所述PAP重組腺相關病毒的 病毒載體感染或轉染得到；或者所述細胞系為PAP抗原特異性細胞毒性T淋巴細胞系，該細 胞系是PAP陽性的前列腺癌所在體系中自然產生的T淋巴細胞與被所述PAP重組腺相關病毒 的病毒載體感染或轉染的單核-樹突狀細胞系混合培養形成的。9. 一種與攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體相關的產品的制備方法，其特征在 于： PAP重組腺相關病毒的質粒載體的制備:將如權利要求1~2所述的或者權利要求3~6 任一項所述的構建方法制得的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體導入基因工程大腸 桿菌DH5a感受態細胞，用含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB平板進行抗性篩選，挑取白色單菌落， 提取質粒并純化，得到PAP重組腺相關病毒的質粒載體； PAP重組腺相關病毒的病毒載體的制備：以所述PAP重組腺相關病毒的質粒載體和 pHelper質粒共轉染AAVp細胞得到PAP重組腺相關病毒的病毒載體； PAP重組腺相關病毒的病毒載體感染或轉染的細胞系的制備：用所述PAP重組腺相關病 毒的病毒載體感染或轉染單核細胞或樹突狀細胞得到，所述細胞系包括單核細胞-樹突狀 細胞系。10. -種如權利要求1所述的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關病毒載體或者權利要求7 所述相關的產品在制備抗PAP抗原陽性的前列腺癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/28GK105985984SQ201610416754
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年6月14日
【發明人】劉勇, 史鵬燕, 董文娟, 高洪吉, 李帆, 馮雪
【申請人】深圳益世康寧生物科技有限公司, 劉勇