異戊二烯合成酶基因及其應用

異戊二烯合成酶基因及其應用
【專利摘要】本發明涉及一種異戊二烯合成酶基因及應用，其解決了利用工程菌合成異戊二烯效率不高的技術問題，本發明提供了一種異戊二烯合成酶基因、其表達的蛋白質、含有異戊二烯合成酶基因的原核表達載體及工程菌以及產異戊二烯工程菌的制備方法及應用。本發明可廣泛用于異戊二烯制備領域。
【專利說明】
異戊二烯合成酶基因及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種異戊二烯合成酶基因及其應用。
【背景技術】
[0002] 自然界中，異戊二烯主要是由某些植物葉片排放至大氣中的，而工業生產中，目 前異戊二烯主要是由石油裂解物C5餾分萃取蒸餾而來。然而隨著石油資源日益枯竭及不 可再生，天然植物釋放的異戊二烯收集又事倍功半，通過微生物工程菌生產異戊二烯成為 一種可持續發展的必然趨勢。
[0003] 據報道，每年植物釋放到大氣中的異戊二烯達到5百萬噸，細菌自身又不具有異 戊二烯合成酶基因，因此植物是異戊二烯合成酶（ISPS)很好來源。利用基因工程技術開展 異戊二烯合成酶基因研究已取得了一些進展，研究人員分離鑒定得到了少量的異戊二烯合 成酶基因，但國內尚未有這方面的報道。
[0004] 2000年，Miller B首次在楊樹（白楊X顫楊）中獲得了全長IspS 基因，并且在大腸桿菌中得到了 7. 7nmol/mgDCW的異戊二烯（Miller B et al.Planta. 2001213 (3): 483-7) ;2005 年，Sasaki 克隆得到了 白楊的 IspS 基因 （Sasaki K et al.FEBS Lett. 2005579(11) :2514-8) ;Thomas D. Sharkey 于 2005 年克隆得到蒙大 拿葛 IspS cDNA 全長（Sharkey TD et al. Plant Physiol. 2005137 (2) :700-12.),隨后又 擴充了數個楊柳科IspS基因，并且得到了刺槐的IspS cDNA全長序列（Sharkey TD et al，Evolution 201367 (4):1026-1040)。
[0005] 可見國內外目前獲得的異戊二烯合成酶大多限于楊柳科和豆科植物，特別是楊柳 科的幾種異戊二烯合成酶基因同源性很高，在豆科植物上關于異戊二烯合成酶基因的研究 主要集中在葛根、刺槐上，而在紫穗槐中并無研究報道，基因庫中也沒有紫穗槐異戊二烯合 成酶基因。

【發明內容】

[0006] 本發明就是為了解決利用工程菌合成異戊二烯效率不高的技術問題，提供一種具 有較高合成效率的異戊二烯合成酶基因及應用。
[0007] 為達到上述目的，一種異戊二烯合成酶基因，其是如下（a)或（b)的基因：（a)所 述基因 cDNA的核昔酸序列如序列表的序列1所7K ; (b)所述基因是編碼如下蛋白質的基 因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有 異戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨基酸序列組成的蛋白質衍生的蛋白質。
[0008] 本發明同時提供一種異戊二烯合成酶基因表達的蛋白質，其是如下（a)或（b)的 蛋白質：(a)由序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；(b)在（a)中的氨基酸序 列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二烯合成酶活性的由（a)衍生的 蛋白質；序列表的序列2所7K的氨·基酸序列組成的蛋白質是由序列表的序列1所不喊基序 列編碼。
[0009] 本發明還提供一種異戊二烯合成酶基因的原核表達載體。
[0010] 本發明還提供異戊二烯合成酶基因原核表達載體的產異戊二烯工程菌。
[0011] 本發明同時提供產異戊二烯工程菌在制備異戊二烯中的應用。
[0012] 本發明的有益效果：根據植物在自然界異戊二烯的釋放速率，本發明選擇了釋放 量較高的紫穗槐異戊二烯合成酶基因進行了分離鑒定和克隆，成功構建異戊二烯生產菌 株，為生物法生產異戊二烯尋找到一個高效的異戊二烯合成酶。本發明利用基因工程手段， 克隆得到了紫穗槐基因 AflspS，應用到大腸桿菌和釀酒酵母中，使用氣相色譜進行檢測，大 腸桿菌和釀酒酵母都具備生產異戊二烯的能力，本發明對于使用微生物進行異戊二烯大規 模工業生產提供了一個高效有效的酶。
【附圖說明】
[0013] 圖1是紫穗槐總RNA的瓊脂糖電泳結果；
[0014] 圖2是紫穗槐AflspS基因片段的瓊脂糖電泳結果；
[0015] 圖3是紫穗槐AflspS基因3' -RACE的瓊脂糖電泳結果；
[0016] 圖4是紫穗槐AflspS基因5' -RACE的瓊脂糖電泳結果；
[0017] 圖5是紫穗槐AFISPS氨基酸序列BlastP分析結果圖；
[0018] 圖6是RACE原理圖；
[0019] 圖7是紫穗槐AFISPS蛋白在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE結果；
[0020] 圖8是異戊二烯標準品的氣相色譜結果；
[0021] 圖9是紫穗槐AflspS基因在大腸桿菌中應用的氣相檢測結果；
[0022] 圖10是紫穗槐AflspS基因在釀酒酵母中應用的氣相檢測結果；
[0023] 圖11是紫穗槐AFISPS蛋白經過取代突變之后在大腸桿菌中應用的氣相檢測結 果；
[0024] 圖12是紫穗槐AFISPS蛋白經過添加突變之后在大腸桿菌中應用的氣相檢測結 果；
[0025] 圖13是紫穗槐AFISPS蛋白經過缺失突變之后在大腸桿菌中應用的氣相檢測結 果。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0027] 下述實施例中，大腸桿菌 BW25113 (Baba T et al. Mol Syst Biol. 2006 ; 2:2006. 0008.)是一株非病原菌，遺傳背景清楚，世代時間短、容易培養且培養基原料低廉。 大腸桿菌BW25113公眾可從中國科學院微生物研究所獲得，釀酒酵母BY4741a是模式菌， 也可以從中國科學院微生物研究所獲得，以上所述生物材料只為重復本發明的相關實驗所 用，不可作為其它用途使用。
[0028] 實施例1 :基因片段的獲得
[0029] 1.提取紫穗槐葉片總RNA
[0030] 采集紫穗槐葉片，使用RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen公司）提取楊樹葉片總 RNA，按照試劑盒說明方法進行，進行電泳（圖1)驗證RNA提取質量，可見RNA完整性良好， 可以進行后續實驗。
[0031] 2. RT-PCR
[0032] 以01ig〇(dT)2(^j(為反轉錄引物，按照反轉錄試劑盒Superscript. III First-Strand Synthesis System for RT_PCR(Invitrogen 公司）說明將核酸反轉錄為 cDNA ；
[0033] 反應體系如下：
[0034] RNA 1 μ g
[0035] 10mM dNTP 1 μ 1
[0036] 01igo(dT)20(0. 5μ g/μ 1) 1 μ 1
[0037] 65°C 5min,置于冰上lmin,加入下面的10 μ 1的mix
[0038] 10XRT buffer 2 μ 1 25mM MgCl2 4 μ 1 0. 1MDTT 2 μ 1 RNase0UT?(40U/u 1) 1 w 1 Superscript? III RT 1 μ 1
[0039] 5(TC 50min，85°C 15min 加入 1 μ 1 RNase H，37°C 20min
[0040] 反應完畢，加入100 μ 1水稀釋cDNA，得到cDNA第一鏈。
[0041] 3.簡并引物設計
[0042] 根據楊柳科及豆科植物的已知氨基酸序列的保守區，并且參考所有已知IspS的 核酸序列及單萜合成酶的核酸序列設計的簡并引物ZSHF1及ZSHR1 :
[0043] ZSHF1 :5'TTCCTNCAAGAAGCAAAATGG 3'
[0044] ZSHR1 :5'YTGRTANGTGCARTGNGA 3'
[0045] 4.簡并PCR反應
[0046] 反應體系
[0047]
[0050] 擴增出450bp左右的片段（圖2)，擴增產物于1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，產物單一 明亮。
[0051] 備注：所示明亮單一條帶為ZSHF1和ZSHR1引物組擴增產物，Marker為TAKARA 100bp DNA Ladder〇
[0052] 5.連接T載體，Sanger測序
[0053] 將單一明亮的條帶回收，連接PMD18-T (TAKARA公司）載體，轉化至 trans5a (TransGen公司）感受態細胞，第二天選擇白斑進行驗證，選取陽性克隆，送至生 工Sanger測序。
[0054] 6.測序及序列分析，
[0055] 測序結果經序列比對，顯示與黑洋槐的IspS基因同源性達到79%，與蒙大拿葛 IspS同源性達到76 %，可以猜測此序列為豆科IspS基因，此片段命名為AflspS基因片段， 序列如SEQ ID No. 3所示。
[0056] 核酸序列進行翻譯后氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
[0057] 實施例2 :AfIspS基因編碼區全長的獲得
[0058] 獲得 cDNA 全長的方法為 SMARTer-RACE，使用 SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit (Clontech公司）進行，以下使用的引物及試劑除GSP均為SMARTer? PCR cDNA Synthesis Kit內提供，按照試劑盒說明方法進行。
[0059] 1. RACE-Ready cDNA 的制備
[0060] RACE-Ready cDNA第一鏈的反轉錄體系如下：
[0061]
[0063] 2.基因特異性引物的設計：
[0064] 根據已經獲得的ΑΠ spS片段的序列設計基因特異性引物（GSP)，RACE-Ready cDNA做模版，GSP及通用引物（Universal Primer Mix, UPM)做引物進行擴增，可以得到 3'-RACE cDNA片段及5' -RACE cDNA片段。引物位置如圖6所示，中間黑色部分為簡并 PCR獲得序列，兩側黑色部分為通用引物序列，白色部分為需要得到的未知序列部分。
[0065] 共8個GSP序列，如下表：
[0066]
[0067] 3. 3' -RACE cDNA末端序列的獲得
[0068] 使用紫穗槐的3' -RACE-Ready cDNA為模版，UPM與GSP為引物進行擴增
[0069] 反應體系：
[0070]
[0072] 反應條件：
[0073]
[0074] 3' -RACE的瓊脂糖凝膠檢測結果如圖（圖3):
[0075] 得到一個單一明亮的紫穗槐DNA擴增條帶，連接T載體，轉化感受態細胞，挑選陽 性克隆Sanger測序，得到3'端cDNA序列。
[0076] 4. 5' -RACE cDNA末端序列的獲得
[0077] 使用紫穗槐的5' -RACE-Ready cDNA為模版，UPM與GSP為引物進行擴增.
[0078] 反應體系：
[0081] 反應條件：
[0082]
[0083] 5' -RACE的瓊脂糖凝膠檢測結果如圖（圖4):
[0084] 由圖可見得到單一明亮的擴增條帶，選擇其一連接T載體，轉化感受態細胞，挑選 陽性克隆Sanger測序，得到5'端cDNA序列。
[0085] 5.全長序列的獲得
[0086] 根據3' -RACE及5' -RACE測序結果，進行序列比對，得到該基因 cDNA全長序列 (SEQ ID No. 1所示序列），對DNA、氨基酸序列進行分析：該基因有1770bp，編碼589個氨 基酸，有ATG起始密碼子和TGA終止密碼子，說明該基因的完整性；其編碼的氨基酸含有一 個IspS高度保守標簽序列DDXXD區域，同時也包含了 RRX8W保守區域。利用BLAST軟件在 NCBI中進行同源比對，結果如圖5,顯示該基因為Isoprenoid_Biosyn_Clsuperfamily成 員，與蒙大拿葛（Pueraria montana var. lobata)異戊二烯合成酶同源性達到77% ;與刺 槐（Robinia pseudoacacia)的異戊二烯合成酶有81 %同源性，與紫藤（wisteria sp.)的 異戊二烯合成酶有76%的同源性，說明我們得到的是異戊二烯合成酶基因，簡寫為AflspS 基因，得到了編碼AFISPS蛋白的氨基酸序列（SEQ ID No. 2所示序列）。
[0087] 實施例3 :大腸桿菌異戊二烯生產菌株的構建
[0088] 全長引物ZSHFa及ZSHRa序列如下：
[0089] ZSHFa :5'GTCATGCCATGGGGTGTGCATTGAGCACACAGGATACTC 3'
[0090] ZSHRa :5'TATCGAGCTCTTCTGCAATTAATTGGAATAGGGTCAAG 3'
[0091] 1.大腸桿菌表達載體pBAD-AflspS構建
[0092] 將使用引物ZSHFa及ZSHRa獲得的AflspS基因片段進行Ncol和Kpnl (TAKARA公 司）雙酶切，并將pBAD-HisB表達載體（購自Invitrogen公司）進行Ncol和ΚρηΙ雙酶 切，AflspS基因連接至pBAD-HisB載體后轉化至trans5 α感受態細胞，選取陽性克隆進行 測序，pBAD-AflspS的核苷酸序列是SEQ ID No. 5。
[0093] 2.異戊二烯生產菌株MV/pAfispS的構建
[0094] 將構建好的pBAD-AflspS與質粒pi及p2共轉化至BW25113宿主得到異戊二烯生 產菌株 MV/pAfispS。
[0095] 并且構建對照菌株MV/pBAD，方法為將pBAD-HisB與質粒pi及p2共轉至BW25113 宿主，得到無異戊二烯合成酶基因的對照菌株MV/pBAD。
[0096] 上述異戊二烯生產菌的構建方法中，pl，p2包含異戊二烯合成途徑-甲羥戊酸 (MVA)途徑基因。其中pi由MvaE (乙酰輔酶A乙酰轉移酶）基因、MvaS(HMG-乙酰輔酶A 合成酶）基因及MVK(甲羥戊酸激酶）基因組成，所述MvaE基因編碼由SEQ ID No. 8所示的 氣基酸序列組成的蛋白質；所述MvaS基因編碼由SEQ ID No. 9所不的氣基酸序列組成的蛋 白質；所述MVK基因編碼由SEQ ID No. 10所示的氨基酸序列組成的蛋白質。p2由PMK(磷 酸甲羥戊酸激酶）基因、MVD(焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶）基因及idi (異戊二烯焦磷酸異構 酶）基因組成，所述PMK基因編碼由SEQ ID No. 11所不的氨1基酸序列組成的蛋白質；所述 MVD基因編碼由SEQ ID No. 12所示的氨基酸序列組成的蛋白質；所述idi基因編碼由SEQ ID No. 13所示的氨基酸序列組成的蛋白質。
[0097] 其中，pi為鏈霉素抗性阿拉伯糖誘導型表達載體，pi的核苷酸序列是SEQ ID No. 6,包含MVA上游途徑基因表達盒，MVA上游途徑基因表達盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 6的第1307-5821位，SEQ ID No. 6的第89-964位為阿拉伯糖啟動子，SEQ ID No. 6的 第5930-6087位為TrrnB終止子，SEQ ID No. 6的第1307-3729位是MvaE基因的編碼序列， SEQ ID No. 6的第3730-4904位是MvaS基因的編碼序列，SEQ ID No. 6的第4905-5821位 是MVK基因的編碼序列。
[0098] P2為氯霉素抗性阿拉伯糖誘導型表達載體，p2的核苷酸序列是SEQ ID No. 7,包 含MVA下游途徑基因表達盒，MVA下游途徑基因表達盒的核苷酸序列是SEQ ID No. 7的第 1309-4442位，SEQ ID No. 6 的第 89-964位為阿拉伯糖啟動子，SEQ ID No. 6 的第 4569-4726 位為TrrnB終止子，SEQ ID No. 6的第1309-2661位是PMK基因的編碼序列，SEQ ID No. 6 的第2677-3864位是MVD基因的編碼序列，SEQ ID No. 6的第3894-4442位是idi基因的 編碼序列。
[0099] 實施例4 :AfIspS基因在大腸桿菌中的應用
[0100] 1、ISPS蛋白表達
[0101] 上述大腸桿菌工程菌MV/pAfispS，使用L-arab誘導之后，蛋白表達結果SDS-PAGE 如圖所示（圖7)，可見不含異戊二烯合成酶的大腸桿菌宿主本身不表達異戊二烯合成酶 ISPS，AfispS基因的轉入使宿主細胞表達ISPS蛋白。
[0102] 備注：圖為AFISPS蛋白在大腸桿菌工程菌中表達情況。
[0103] 2、大腸桿菌發酵產物的檢測
[0104] 將上述2個菌株進行發酵，方法如下：將工程菌以百分之一的接種量轉接到 30mL(500mL三角瓶）含有鏈霉素、氯霉素及氨芐抗性的阿拉伯糖自誘導培養基（ZYM)中， 30°〇，280印111培養2011后。41：，4000印111離心收集菌液，用含有4%葡萄糖的19培養基重懸 至600D菌體濃度，取lmL重懸菌液置于20mL頂空瓶內，37°C，280rpm震蕩培養30h。
[0105] 含有鏈霉素、氯霉素及氨芐的自誘導培養基自誘導培養基ZYM配方如下：100mL A+2mL B+2mL C+200yL D+100yL E (以下均為質量百分比濃度）；
[0106] A. ZY :1%胰蛋白胨，0.5%酵母粉；
[0107] Β· 50XM :1. 25M Na2HP04,1. 25M ΚΗ2Ρ04,2· 5M NH4C1 和 0· 25M Na2S04 ;
[0108] C. 50X5052 :25%甘油，2· 5%葡萄糖，10%乳糖；
[0109] D. 1Μ MgS04 ；
[0110] Ε· 1000X 微量元素：50Mm FeC13,20mM CaC12,10mM MnC12,10mM ZnS04, CoC12、 NiC12、Na2Mo4、Na2Se03 和 H3B03 各 2mM ;
[0111] 鏈霉素：終濃度50mg/L、氯霉素終濃度34mg/L、氨芐終濃度100mg/L。
[0112] M9培養基配方如分子克隆實驗指南（科學出版社）第三版1595頁所示。
[0113] 反應結束后，進行氣相色譜（GC)分析，使用的氣相色譜分析儀為Agilent 7890A GC Sysytem及Agilent7697A headspace Sampler頂空進樣器,氣相分離柱為HP-5。頂空取 樣方法如下，Time :GC cycle time 20min, Vial equib time 6min ；Temperature (°C ) ：0ven 51, Loop/Valve 55, Transfer line 60。GC 方法如下：流速：2mL/min, Omin ~4min 50°C, 4min ~8. 5min 50 ~280°C，8. 5min ~10. 6min 280°C。
[0114] 此方法下異戊二烯標準品（Sigma公司）出峰時間為1. 75min (圖8)，大腸桿菌工 程菌MV/pAfispS及陰性對照菌株MV/pBAD的GC色譜圖（圖9)，可見MV/pAfispS在1. 75min 的保留峰，而對照沒有。可見未加入AflspS基因的菌株不具備異戊二烯生產能力，轉入 AflspS基因后使得大腸桿菌具備了生產異戊二烯的能力，大腸桿菌中產量可達237. 96mg/ L〇
[0115] 實施例5 :經過氨基酸突變的AFISPS蛋白在大腸桿菌中的應用
[0116] 對AFISPS蛋白進行取代、添加和缺失突變，使用實施例3構建的pBAD-AflspS為 模版，按照Fast Mutagenesis System(TransGen公司）試劑盒說明進行突變。
[0117] 1、AFISPS蛋白的氨基酸突變
[0118] 氨基酸的取代突變：將53位氨基酸N突變為T，即將核酸序列157-159位的AAT突 變為ACT，使用突變引物為1F和1R ;
[0119] 氨基酸的添加突變：25位氨基酸Q后面添加一個P氨基酸，即將核酸序列75位之 后添加 CCG堿基，使用的突變引物為2F和2R ;
[0120] 氨基酸的缺失突變：將25位氨基酸Q去掉，即將核酸序列73-75位堿基CAA去掉， 使用的突變引物為3F和3R。
[0121] 突變引物序列如下：
[0122]
[0123] 備注：有下劃線堿基為突變堿基
[0124] PCR 體系
[0125] Control Plasmid 1-§ ng Control Primers 1 μ 1 5 X Trans Start Fast Pfii buffer 10 u 1 10 ml dNTPs： 1 μ 1 Tr.ansStart FUs.tPfti. DNA Polymer.ase 1 u 1 ddH20 to SO μ 1
[0126] PCR 條件
[0127]
[0129] 電泳檢測
[0130] 取10 μ 1 PCR產物，1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0131] 觀察到目的條帶大小正確，可用DMT酶消化及轉化反應。
[0132] PCR產物的消化
[0133] 加 1 μ 1 DMT酶于PCR產物中，混勻，37 °C孵育lh。
[0134] 轉化
[0135] a.加入2-5 μ 1 DMT酶消化產物于50 μ 1 DMT感受態細胞中（在感受態細胞剛剛 解凍時加入產物），輕彈混勻，冰浴30分鐘。
[0136] b. 42°C準確熱激45秒，立即置于冰上2min。
[0137] c.加 250 μ 1平衡至室溫的S0C，225轉，37°C培養1小時。
[0138] (1.取20(^1菌液鋪板，培養過夜（為得到較多的克隆，4000印111離心11^11，棄掉部 分上清，保留100-150 μ 1，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，培養過夜）
[0139] 用對照質粒模板（4. 5Kb)檢驗突變效率，在含氨芐的平板上涂8 μ 1500mM IPTG， 40μ1 40mg/mlX-gal，突變成功的菌落呈藍色。
[0140] 挑選藍色菌落進行質粒抽提（Plasmid Mini Kit 1，0MEGA公司），Sanger測序。得 到正確突變克隆，取代突變株命名為pBAD-AflspScl，添加突變株命名為pBAD-AnspSc2， 取代突變株命名為pBAD-AfIspSc3。
[0141] 2、異戊二烯生產菌株MV/pAfispSc的構建
[0142] 將構建好的pBAD-AflspScl與質粒pi及p2共轉化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產菌株 MV/pAfispScl ;
[0143] 將構建好的pBAD_AnspSc2與質粒pi及p2共轉化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產菌株 MV/pAfispSc2 ;
[0144] 將構建好的pBAD-AfIspSC3與質粒pi及p2共轉化至BW25113宿主得到異戊二烯 生產菌株 MV/pAfispSc3。
[0145] 3、大腸桿菌發酵產物的檢測
[0146] 具體檢測方法同實施例4所述方法。MV/pAfispScl得到的氣相檢測結果如圖11， MV/pAfispSc2得到的氣相檢測結果如圖12，MV/pAfispSc3得到的氣相檢測結果如圖13所 示，可見MV/pAfispScl、MV/pAfispSc2及MV/pAfispSc3菌株同樣具備生產異戊二烯的能 力，產量分別達到 45. 68mg/L，32mg/L 及 43. 56mg/L。
[0147] 實施例6 :釀酒酵母異戊二烯生產菌株構建
[0148] 將AflspS整合到釀酒酵母菌株BY4741a染色體基因組中。
[0149] 本實施例用使用的引物序列如下：

[0154] 共進行5輪PCR擴增，每一輪擴增反應體系所用的模版、引物1及引物2分別如下 表所列。
[0155]
[0156] 其中，質粒 pSFS2,參考文獻為 Gene(2004)341:119 - 127, GeneBank 數據庫的 登錄號為：AY524979,來源于中國科學院微生物所。質粒pUC57-ispS為帶有本發明所 述IspS基因完整編碼區序列，來源于中國科學院微生物所。質粒pAG32,參考文獻為 Yeast (1999) 15 (14) : 1541-53,帶有TEF啟動子和終止子序列，來源于中國科學院微生物 所。DNA聚合酶是寶生物工程有限公司的Pyrobest DNA聚合酶，或者是NEB公司的Phusion DNA聚合酶，活性單位均為5U/ μ 1。
[0157] PCR循環條件為：
[0158] 94度2分鐘 （預變性階段）
[0159] 94度20秒，58度20秒，72度1~6分鐘 （30個循環擴增階段）
[0160] 72度10分鐘 （最后延伸階段）
[0161] 2、DNA 純化
[0162] 反應結束后，取5 μ 1上述PCR樣品進行瓊脂糖電泳檢測，證明擴增所得的DNA片 段大小與預計的一樣，而且沒有雜帶，利用PCR純化試劑盒（購自Omega公司）進行純化和 濃縮，為后面的轉化準備DNA樣品。
[0163] 3、LiAc法酵母轉化
[0164] 釀酒酵母轉化主要參照參考文獻Methods Enzymol (2002) 350:87-96。從平板接 種酵母至2ml YH)試管，30°C搖床培養過夜，添加3-5ml培養基繼續培養至對數生長中期。 按 lml 分裝離心收集菌體，400 μ 1 LiAc/TE 溶液（0· 1M LiAc, 10mM Tris-HCl (pH 7. 5)，ImM EDTA ;用lOXLiAc和10XTE稀釋）洗一遍，菌體重懸于100 μ 1 LiAc溶液。加入5 μ 1變性鮭 魚精DNA(使用前95°C，5min，立即置于冰上）和1 一 5μ 1轉化DNA，混勻，室溫放置5min， 加入 280 μ 1 PEG/LiAc/TE 溶液（用滅菌 50% PEG4000 配制 IX LiAc/TE 溶液）。顛倒 4 一 6次混勻。30°C放置45min后加入39μ1 DMS0,42°C水浴熱擊5min。離心，菌體用ddH20洗 一遍，重懸于100 μ 1 ddH20,涂抗性篩選YPD平板（含100 μ g/ml clonNAT)，放置30°C培 養箱內培養至單菌落出現。
[0165] 4、篩選抗性菌落
[0166] 將上述抗性平板上長出的單菌落分別接種到lml YH)培養基的離心管中，加 clonNAT至終濃度為100μ g/ml，220轉/分鐘，30°C搖床培養。出現生長，說明帶有抗性，證 明抗性基因已經整合到菌體基因組中并發揮作用，這部分菌落用于下一步驗證。沒有出現 生長的菌落，說明是假陽性，等同于出發菌株，停止處理。
[0167] 5、鑒定釀酒酵母異戊二烯生產菌株
[0168] 上面出現生長的抗性菌落，接種YH)液體培養基培養過夜，吸取500 μ 1菌液，利用 寶生物工程有限公司的基因組提取試劑盒制備基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進 行。以獲得的基因組DNA為模版，Scl8Sup和Scl8Sdown為引物進行PCR擴增。檢測引物 退火位點分別位于釀酒酵母菌株BY4741a染色體基因組整合位點的上下游，PCR擴增產物 的大小分別為1. 7k(整合前）和3. 6k(整合后）。如果IspS基因沒有整合到釀酒酵母菌 株BY4741a染色體基因組整合位點，PCR擴增產物的大小為1. 7kb。如果IspS基因整合到 釀酒酵母菌株BY4741a染色體基因組整合位點，PCR擴增產物的大小則為3. 6kb。鑒定為陽 性的菌株，再進一步經菌落純化和相同方法的鑒定，得到本發明所述的釀酒酵母異戊二烯 生產菌株。
[0169] 實施例7 :釀酒酵母異戊二烯生產菌株生產異戊二烯的檢測
[0170] 從平板接種酵母單菌落至2ml YPD(1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖）試 管，30°C搖床培養過夜，離心收集菌體，菌體重懸于YPG (1 %酵母提取物，2 %蛋白胨，2%半 乳糖）至0D600約為0. 5,轉lml上述菌液于10ml頂空瓶內，密封，30°C搖床培養3天，氣相 色譜檢測方法同實施例5中檢測方法，檢測到釀酒酵母異戊二烯生產菌株有20 μ g/L的異 戊二烯產量。對照菌株為野生型釀酒酵母BY4741a，檢測不到異戊二烯（圖10)。
【主權項】
1. 一種異戊二烯合成酶基因，其特征是如下（a)或（b)的基因： (a) 所述基因 cDNA的核苷酸序列如序列表的序列1所示； (b) 所述基因是編碼如下蛋白質的基因：序列表的序列2所示的氨基酸序列中經過取 代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二烯合成酶活性的由序列表的序列2所示氨 基酸序列組成的蛋白質衍生的蛋白質。2. 如權利要求1所述的異戊二烯合成酶基因表達的蛋白質，其特征是如下（a)或（b) 的蛋白質： (a) 由序列表的序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質； (b) 在（a)中的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有異戊二 烯合成酶活性的由（a)衍生的蛋白質； 所述序列表的序列2所7K的氨·基酸序列組成的蛋白質是由序列表的序列1所不喊基序 列編碼。3. -種含有如權利要求1所述異戊二烯合成酶基因的原核表達載體。4. 一種含有如權利要求3所述異戊二烯合成酶基因原核表達載體的產異戊二烯工程 菌。5. 如權利要求4所述的產異戊二烯工程菌在制備異戊二烯中的應用。
【文檔編號】C12N15/60GK105985977SQ201510071163
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月10日
【發明人】李春, 賴小勤, 胡開蕾, 毋鴻江, 傅深展, 陶勇
【申請人】中國科學院微生物研究所, 中科鴻基生物科技有限公司