賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑的成分包括蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種或多種混合物；所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2％～5％。
【專利說明】
賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑
技術領域
[0001] 本發明屬于醫藥技術領域，具體涉及一種改善賴氨酰肽鏈內切酶穩定性的凍干及 貯存保護劑以及酶溶液保護劑。
【背景技術】
[0002] 賴氨酰肽鏈內切酶（Lysyl Endopeptidase，Lep)，EC3.4.21.50,分子量約為30KD， 屬于絲氨酸蛋白酶家族成員之一，能特異切割肽鏈中賴氨酸殘基或氨乙基半胱氨酸C端的 肽鍵，能顯著提高酶切轉化率和純度，故常用于蛋白質序列分析中的質譜分析和Lys-X的化 合物酶催化合成。目前表達Lep的野生菌有銅綠假單胞菌，促溶無色桿菌和產酶溶桿菌。產 酶溶桿菌產酶比無色桿菌活性高，本發明所用菌株為促溶無色桿菌M497-1(ATCC 21456)， 從美國模式菌種保藏中心購得。酶的發酵和純化步驟參考文獻方法(Masaki T，Tanabe M， Nakamura K，et al. Studies on a new proteolytic enzyme from Achromobacter lyticus M497-1I.Purification and some enzymatic properties[J].Biochimica Et Biophysica Acta，1981，660(1) :44-50)。純化得到Lep之后，對其凍干處理是長期保存此酶 的重要方法。但凍干過程牽涉到復雜的相變過程，在凍結、凍融干燥、儲存過程中，存在多種 誘導蛋白變性的因素，又因該酶自身的氨基酸序列中含有賴氨酸殘基，因此在凍干和溶液 保存時，易失活或自身酶切，故需要開發新的方法以提高其穩定性。
[0003] 專利CN102973526A公開人抗凝血酶制劑冷凍干燥過程中的保護劑，包括使用蔗 糖、賴氨酸、酪氨酸、天冬氨酸的一種進行保護。
[0004] 專利CN101893639A公開了穩定血清α-羥丁酸脫氫酶和乳酸脫氫酶活性的方法，使 用了牛血清蛋白、海藻糖(或蔗糖）、甘露醇和甘氨酸作為保護劑進行凍干。
[0005] 盡管添加糖類和氨基酸作為保護劑用于制備酶制劑已屬公知技術，但是由于酶結 構組成的千差萬別，目前尚沒有一種可以直接套用的保護劑組成進行各種酶的保護，因此， 針對具體酶而言為改善其穩定性，仍需要大量的試驗進行保護劑的篩選。文獻檢索表明：目 前尚沒有已經公開一種穩定的賴氨酰肽鏈內切酶混合物和方法。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是，解決賴氨酰肽鏈內切酶在凍干過程中和溶液狀態保 存時的自身酶解問題，最大程度地提高酶的穩定性，滿足長期貯存的需要。
[0007] 本發明提供了一種賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑的成分包括 蔗糖，海藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一 種，兩種或多種混合物;所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇. 2% ~5% 〇
[0008]其中，優選地，所述的保護劑的pH為4~10。
[0009]其中，優選地，所述的保護劑還包括roS緩沖液、Tris-Hcl緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩 沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
[0010]優選地，所述的保護劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。
[0011]優選地，所述的保護劑pH為5或10。
[0012] 進一步優選地，所述的保護劑選擇如下混合物，
[0013] 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0014] 蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0015] 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0016]蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0017] 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0018] 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0019] 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0020]右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0021 ]乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0022]乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0023]乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0024]乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物；
[0025]蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0026] 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0027] 海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0028] 優選地，所述的混合物的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1%。
[0029] 進一步優選地，所述的保護劑選自如下優選地的混合物，
[0030] 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0031] 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0032] 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物；
[0033] 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0034]優選地，所述的保護劑pH為5-10。
[0035] 優選地，所述的保護劑選自的混合物，所述由兩種成分組成的混合物中的成分在 酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇 .2%，0.5%，1%，2.5%或5 %。
[0036] 其中，優選地，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖在酶凍干溶液中的質量體 積百分濃度為0.5%，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1%;所述右旋 糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇. 5%，甘 氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇. 5%。
[0037] 本發明還涉及一種賴氨酰肽鏈內切酶的凍干劑，其特征在于，包括如下組分:如上 所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在酶凍干溶液中的質量體積 百分濃度為〇. 2 %~5% ;和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切酶酶凍干溶液中的 質量體積百分濃度為〇. 0001 % -〇. 02 %。
[0038] 優選地，所述的凍干劑的pH為4~10。
[0039] 另一方面，一種賴氨酰肽鏈內切酶的貯存溶液，包括如下組分：
[0040] 如上所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在酶凍干溶液 中的質量體積百分濃度為0.2%~5% ;
[0041 ]和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切酶在酶貯存溶液中的質量體積百分 濃度為0.0001 %-0.02 %。
[0042] 所述的保護劑選用蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶 貯存溶液中的質量體積百分濃度為1 %。
[0043] 上述混合物，是所述物質包含兩種或多種成分的組成物。
[0044] 上述的兩種成分組成的混合物，包括但不限于上述的蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物及海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。
[0045] 上述的酶凍干溶液，是賴氨酰肽鏈內切酶的凍干前的最終溶液。上述的酶貯存溶 液，是賴氨酰肽鏈內切酶貯存時的溶液。
【附圖說明】
[0046] 圖1是十肽底物在賴氨酰肽鏈內切酶的酶切產物的液相分析。
[0047]其中，底物峰保留時間為14.3min;酶切底物后，產物1保留時間分別是6.8min，產 物21保留時間是3.3min。
【具體實施方式】
[0048]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更為明顯易懂，下面結合附圖對本發明 的【具體實施方式】做詳細的說明。
[0049] 所述的"包括"表示本發明的保護劑除了含有所述成分如蔗糖，海藻糖，乳糖等或 組合物等，還可以包含一些用于調整保護劑pH的物質，如用于調整保護劑pH的緩沖液等。
[0050] 根據本申請的某些實施方式，所述保護劑包括蔗糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇等單一 成分，也包括由蔗糖、甘氨酸或其鹽、賴氨酸或其鹽、聚乙二醇4000和右旋糖酐其中三種成 分組成的混合物，及包括由甘氨酸或其鹽、蔗糖、海藻糖和右旋糖苷其中兩種成分組成的混 合物;例如，保護劑為蔗糖，海藻糖，甘氨酸或其鹽，甘露醇，右旋糖酐，聚乙二醇4000，乳糖， 賴氨酸或其鹽及蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混 合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽 的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽 的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 賴氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和賴氨酸或 其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和賴氨 酸或其鹽的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物;其中優選地，蔗糖，甘露醇，甘氨酸或其鹽，乳糖、聚乙 二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖和甘氨 酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。其中混合物各成分的比例，可由混 合物中的各成分在酶凍干溶液的濃度決定。
[0051] 在本申請的某些實施方式中，在賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存溶液中，包括上述 的保護劑，其中保護劑的成分在酶凍干溶液中的溶度(質量體積)為〇.2%~5%，例如0.2% ~1%，0.3%~1%，0.4%~1%，0.5%~1%，0.6%~1%，0.7%~1%，0.8%~1%，0.9% ~1%，0.2%~0.5%，0.3%~0.5%，0.4%~0.5%，0.2%~2.5%，0.3%~2.5%，0.4% ~2·5%，0·5%~2·5%，0·6%~2·5%，0·7%~2·5%，0·8%~2·5%，0·9%~2·5%，1% ~2·5%，1·5%~2·5%，2%~2·5%，0·2%~5%，0·3%~5%，0·4%~5%，0·5%~5%， 0.6%~5%，0.7%~5%，0.8%~5%，0.9%~5%，1%~5%，1.5%~5%，2%~5%， 2.5%~5%，優選地0.2%~0.5%，0.5%~1%，0.2%~2.5%，0.5%~2.5%，0.2%~ 5%，1%~2.5%，1%~5%，2.5%~5%。具體實施時，采用如上所述的三種成分混合物或 兩種成分的混合物，如蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其 鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸 或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸 或其鹽的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸的混合物，右旋糖酐、聚乙二醇4000和 賴氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、甘露醇和賴氨酸或 其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物，乳糖、聚乙二醇4000和賴氨 酸或其鹽的混合物，以及蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合 物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，其涉及成分蔗糖，左旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，甘 露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽，在酶凍干溶液中的濃度為1 %，又如蔗糖和甘氨酸或 其鹽的混合物，右旋糖酐和甘氨酸的混合物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所涉及的蔗 糖、甘氨酸或其鹽、右旋糖酐和海藻糖在酶凍干溶液中的濃度為〇 .2%，0.5%，1%，2.5%， 5%〇
[0052] 在某些實施方式中，在賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑中，在賴氨酰肽鏈內 切酶凍干及貯存保護溶液中，所述的凍干及貯存保護劑和凍干及貯存保護溶液的pH為4~ 10,例如5~10,6~10,7~10,8~10,9~10,5~9,5~8,5~7,5~6,6~8,6~7,6~8,6~9， 7~8，7~9，8~9，其優選地，pH為5~10。具體實施時，通過在賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存 保護劑中或在賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護溶液中添加 pH緩沖液以調節其pH，例如pH 為5-8的roS緩沖液，pH為7-9的巴比妥鈉-鹽酸緩沖液，pH為4-5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，pH為 7-10的Tris-Hcl緩沖液和碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
[0053] 實施例中，采用的賴氨酰肽鏈內切酶的酶切反應體系如下，
[0054] 在1.5ml EP管加入20μ1十肽底物，再加入60μ1 0.1mol/L的pH9.5Tris緩沖液，震 蕩10s，30°C水浴孵育5min，然后加入4μ1待測酶液，于30°C水浴反應20min后立即加入16μ1 10 % TFA進行終止，然后進行HPLC分析。
[0055] 十肽底物:N-Tyr-Tyr-Ala-Lys-Tyr-Phe-Gly-Arg-Phe-Phe-C。
[0056] 十肽底物和酶切產物液相分析如圖1所示。
[0057]十肽底物峰保留時間為14.3min，酶切底物后，產物1保留時間分別是6.8min，產物 21保留時間是3.3min。試驗中以單位時間內產物1的產生量來評價酶活。該產物的量可以通 過產物1峰面積進行計算。
[0058] 具體實施時，賴氨酰肽鏈內切酶的終濃度為(W/V)為0.0001 %~0.02%。
[0059] 實施例1
[0060]蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽保護劑分別配制為20%的濃度，并在_20°C保存備用。 本實施例采用3種緩沖液濃度，分別為5/20/50mmol/L的PBS緩沖液和Tris-HCl緩沖液，每一 種濃度都包含7個pH值，PH4/5/6/7/8/9/HLPH值為4/5/6/7時用roS緩沖液調節，pH值為8/ 9/10時用Tris-HCl緩沖液調節。取84x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加 100μΙ的對應保護 劑，100μΙ的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，1800μ1對應緩沖液，不加保護劑的為對照組，對照組即 每瓶添加 100μΙ的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，1900μ1對應緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取 出用2ml超純水溶解，按上述酶切反應體系進行反應，然后用液相分析結果。結果處理時，取 凍干前酶活檢測為100%。單個保護劑結果如表1所示：
[0061]
[0062] 表 1
[0063] 結果由表1所示，參照表1可知：
[0064] 1)在添加保護劑蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的凍干溶液及未添加保護的賴氨酰 肽鏈內切酶凍干溶液，未添加保護劑的凍干酶在pH 4-5下酶活約為凍干酶活的30%，在 PH6-10下，酶活約為凍干酶活的50-70%;在添加保護劑蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽，凍干 后的酶活約為凍干酶活的50-90%。
[0065] 2)通過比對蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽作為保護劑的凍干酶活，蔗糖的凍干保 護效果最優，甘氨酸次之，甘露醇再次。
[0066] 3)通過比對蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽作為保護劑的凍干后形態相比，甘氨酸 或其鹽的凍干后的形態最優，甘露醇次之，蔗糖再次。
[0067] 4)其中，pH 5或10下，凍干酶活較優。
[0068] 實施例2
[0069]在實施例1基礎上，增加了右旋糖酐，乳糖，聚乙二醇4000，賴氨酸或其鹽這幾種保 護劑。每種保護劑依然配制為20%濃度，_20°C保存備用。復合保護劑添加方式如上述表格， 根據實施例1結果，緩沖體系優選pH5，50mmo 1/LPBS和pHl 0，50mmo 1/LTr i s-HCl。取26x3只西 林瓶，每只西林瓶按表格各加 100μΙ的對應保護劑，100μΙ的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，Ι600μ1 對應緩沖液，不加保護劑的為對照組，對照組即每瓶添加1〇〇μ1的賴氨酰肽鏈內切酶溶液， 1900μ1對應緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取出用2ml超純水溶解，按上述酶切反應體系 進行反應，然后用液相分析結果。結果處理時，取凍干前酶活檢測為100%。復合保護劑結果 如表2所示：
[0071] 表2
[0072] 結合由表2所示，可知，
[0073] 1)在保護劑存在的條件下，賴氨酰肽鏈內切酶的凍干后的酶活，添加保護劑的凍 干保持在80%~110%，明顯優于未添加保護劑的凍干酶活。
[0074] 2)在如上的三種成分混合物的保護劑中，乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽及其鹽 的混合物，蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽及其語言的混合物的凍干后酶活較優。 [0075] 3)在如上三種成分混合物的保護劑中，添加有聚乙二醇4000的混合物的酶活優于 添加有甘露醇的混合物;針對酶凍干形態相比，含有聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的結果 較優;同時，在pH為10的條件下，酶活結果優于pH為5的混合物。
[0076] 實施例3
[0077]在實施例2基礎上，增加了海藻糖這一保護劑，配制為20 %濃度，-20 °C保存備用。 本實驗探索蔗糖、右旋糖酐、海藻糖和甘氨酸或其鹽終濃度為0.2%，0.5,1 %，2.5%和5% 五個濃度的復合保護劑對酶活影響。保護劑添加按照上述表格，根據實施例1和2結果，本次 實驗緩沖液用pH10,50mmol/L Tris-Hcl緩沖液。取76x3只西林瓶，每只西林瓶按表格加100 μL的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，然后從〇. 2 %蔗糖、0.2 %甘氨酸或其鹽開始編號1，0.5 %蔗 糖、0.2%甘氨酸或其鹽編號6,依次到5%海藻糖、5%甘氨酸或其鹽編號75。0.2%的保護劑 需向凍干體系中加20yL，0.5 %的保護劑需向凍干體系中加50yL，1 %的保護劑需向凍干體 系中加 l〇〇yL，2.5 %的保護劑需向凍干體系中加250μ1，5 %的保護劑需向凍干體系中加500 yL，其余用緩沖液補充。不加保護劑的為對照組76號，對照組即每瓶添加 100μΙ的賴氨酰肽 鏈內切酶溶液，1900μ1對應緩沖液，然后搖勻，凍干。凍干后，取出用2ml超純水溶解，按上述 酶切反應體系進行反應，然后用液相分析結果。結果處理時，取凍干前酶活檢測為100%。復 合保護劑結果如表3所示：
[0079] 表 3
[0080] 在本實施例中，采用兩種組分混合物作為保護劑，即蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合 物，右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物，表3顯示，不同濃 度保護劑成分對凍干酶活具有不同程度的保護作用;其中，復合保護劑凍干形態相比，添加 1 %右旋糖酐和1 %甘氨酸或其鹽作為保護劑時，酶液凍干后形態完整，無塌陷。在凍干酶活 方面，其中，甘氨酸或其鹽的濃度為1 %時，凍干酶活優于其濃度為0.5%和0.2 %。蔗糖和右 旋糖酐濃度為〇. 5 %時，凍干酶活較優。海藻糖濃度為1 %時，凍干酶活優于濃度為0.5 %和 0.2%的酶活。在各保護劑濃度為2.5%和1%，其酶活活性接近(結果相關不大），同時各保 護劑濃度為5 %時，其酶活的活性接近濃度為2.5%的活性，但濃度為5%的酶活活性較差。 其中，濃度(凍干溶液)為〇. 5%的蔗糖和濃度(凍干溶液)為1 %的甘氨酸或其鹽的混合物的 凍干酶活較優，濃度(凍干濃度)為〇. 5 %的右旋糖酐和濃度(凍干濃度)為0.5 %的含有甘氨 酸成分的混合物的凍干酶活較優。
[0081 ] 實施例4
[0082]除考察這些保護劑對凍干過程中酶的穩定性的影響外，還研究了這些保護劑對于 提高溶液貯存狀態下酶的穩定性的效果。配制20%蔗糖和20%的甘氨酸，_20°C保存備用。 配制PH5-7的PBS和pH8-10的Tris-HCl緩沖液，緩沖液濃度均為50mmol/L。取12x3只西林瓶， 每只西林瓶加 100μΙ的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，100μΙ蔗糖，100μΙ甘氨酸，1700μ1對應緩沖 液。不加保護劑的為對照組，對照組即每瓶添加1〇〇μ1的賴氨酰肽鏈內切酶溶液，1900μ1對 應緩沖液。保存于4°C，并分別于第0(1、7(1、14(1、21(1、28(1取出進行酶活分析。按上述酶切反應 體系進行反應，然后用液相分析結果。結果處理時，取第〇d的酶活為100%，酶溶液穩定性數 據結果如表4所示：
[0085] 表 4
[0086] 在本實施例提供賴氨酰肽鏈內切酶的貯存溶液，采用蔗糖和甘氨酸或其鹽組成的 混合物，其蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶貯存溶液中的濃度為1%，其中加有保護劑的酶的保存 效果優于未添加保護劑的效果，保護劑在pH為5-10的范圍下具有較好的保存效果。
[0087] 本發明雖然已以較佳實施例公開如上，但其并不是用來限定本發明，任何本領域 技術人員在不脫離本發明的精神和范圍內，都可以利用上述揭示的方法和技術內容對本發 明技術方案做出可能的變動和修改，因此，凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明 的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化及修飾，均屬于本發明技術方案 的保護范圍。
【主權項】
1. 賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述保護劑的成分包括蔗糖，海 藻糖，乳糖，左旋糖酐，聚乙二醇4000，甘露醇，甘氨酸或其鹽和賴氨酸或其鹽的一種，兩種 或多種混合物;所述保護劑的各成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇. 2%~5%。2. 如權利要求1所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護 劑的pH為4~10。3. 如權利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的 保護劑還包括PBS緩沖液、Tri s-Hc 1緩沖液、乙酸-乙酸鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液和 碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。4. 如權利要求1-3任一項所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所 述的保護劑選自蔗糖、甘露醇、甘氨酸或其鹽的一種。5. 如權利要求4所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的保護 劑pH為5或10。6. 如權利要求1或2所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的 保護劑選擇如下混合物， 蔗糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、甘露醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、甘露醇和賴氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和甘氨酸或其鹽的混合物； 乳糖、聚乙二醇4000和賴氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物； 海藻糖和甘氨酸或其鹽的混合物。7. 如權利要求6所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的混合 物的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1 %。8. 如權利要求6或7所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的 保護劑選自如下優選地的混合物， 乳糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖、聚乙二醇和甘氨酸或其鹽的混合物； 蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物； 右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物。9. 如權利要求6或7所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的 保護劑pH為5-10。10. 如權利要求6所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述的混 合物，由兩種成分組成的混合物中的成分在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.2%， 0.5%，1%，2.5%和5%〇11. 如權利要求8所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，其特征在于，所述蔗糖 和甘氨酸或其鹽的混合物，蔗糖在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇. 5%，甘氨酸或其 鹽在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為1 % ;所述右旋糖酐和甘氨酸或其鹽的混合物，右 旋糖酐在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為0.5%，甘氨酸或其鹽在酶凍干溶液中的質 量體積百分濃度為0.5%。12. -種賴氨酰肽鏈內切酶的凍干劑，其特征在于，包括如下組分： 權利要求1-11任一項所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在 酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇.2%~5% ; 和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切在酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為 0.0001%-0.02%。13. 如權利要求12所述的一種賴氨酰肽鏈內切酶的凍干劑，其特征在于，所述的凍干劑 的pH為4~10。14. 一種賴氨酰肽鏈內切酶的貯存溶液，其特征在于，包括如下組分： 權利要求1-11任一項所述的賴氨酰肽鏈內切酶凍干及貯存保護劑，所述保護劑成分在 酶凍干溶液中的質量體積百分濃度為〇.2%~5% ; 和賴氨酰肽鏈內切酶，所述的賴氨酰肽鏈內切酶在酶貯存溶液中的質量體積百分濃度 為 0·0001%-0·02%。15. 如權利要求14所述的一種賴氨酰肽鏈內切酶的貯存溶液，其特征在于，所述的保護 劑選用蔗糖和甘氨酸或其鹽的混合物，所述蔗糖和甘氨酸或其鹽在酶貯存溶液中的質量體 積百分濃度為1 %。
【文檔編號】C12N9/52GK105985942SQ201610269634
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】吳勇, 徐帆, 徐一帆, 李亞茹
【申請人】上海多米瑞生物技術有限公司, 上海醫藥工業研究院