一種具有生物活性的無菌膠原液及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有生物活性的無菌膠原液及其制備方法，該膠原液的制備方法為將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒、低溫粉碎，再進行酸溶酶解、過濾除渣、鹽析、純化、灌裝封口、冷凍、低溫輻照滅菌后即可得到無菌的膠原液。本發明在低溫條件下輻照，保持了膠原的活性，避免了膠原在輻照的過程中變性失活或者發生交聯反應，從而影響其功能。本發明采用超濾純化代替傳統的透析純化，同樣的效果是縮短了純化的時間，另外采用自動化系統代替傳統的半自動操作，避免了人手污染，保證了產品的潔凈度、純度、生物活性。
【專利說明】
一種具有生物活性的無菌膠原液及其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種具有生物活性的無菌膠原液及其制備方法。
【背景技術】
[0002]膠原是由三條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀的細胞外蛋白質，占全身蛋白質的30%以上，具有獨特的生理活性。膠原蛋白富含人體必需的甘氨酸、脯氨酸、羥脯氨酸等氨基酸，是細胞外基質中最重要的組成部分，具有強的生物活性及生物功能，能參與細胞的遷移、分化和增殖，使骨腱、軟骨和皮膚具有一定的機械強度，且由于其微弱的抗原性和良好的生物相容性，在燒傷、創傷、眼角膜疾病、美容、硬組織修復、創面止血等醫藥衛生領域用途廣泛。
[0003]膠原是哺乳動物體內含量最多的蛋白質，廣泛分布于角膜、皮膚、骨骼、韌帶、腱等部位，是組成結締組織的重要結構蛋白。因此從動物組織提取膠原是獲得膠原的重要途徑。在提取膠原的生產過程中會產生一些副產品膠原蛋白和明膠，明膠是由膠原變性解螺旋后不再具有生物活性的肽鏈組成。膠原之所以具有生物活性，主要取決于它的三螺旋結構，所以明膠是沒有生物活性的。
[0004]目前，膠原的提取方法主要有堿法、酸法、鹽法及酶法。堿法提取的優點在于反應迅速徹底，其缺點在于造成膠原肽鍵水解，破壞膠原的三螺旋結構，使含有羥基和巰基的氨基酸破壞且產生消旋。其產生的D型氨基酸有毒，有的甚至有致癌、致畸和致突變的危害，因此，堿法提取膠原不適合用于生物醫用材料用膠原的提取。酸法提取膠原主要是通過低離子濃度及酸性環境破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵，從而使膠原纖維溶脹、溶解來提取膠原。其優點在于最大限度的保持膠原分子的三螺旋結構，即生物活性，其缺點主要是產率低。中性鹽法提取膠原的主要缺點是其工藝不穩定，使得提取的膠原分子結構也不穩定。
[0005]現有常規的酶法具有水解反應快、對環境友好等優點，而且提取的膠原純度高、物理化學性質穩定，酶解可切除膠原分子端肽的非螺旋區，降低膠原的抗原性，但其缺點是水解不夠徹底，制備出的膠原的生物活性低。
[0006]目前醫用的膠原對微生物限度具有嚴格的要求，基本上所有的產品都要求達到無菌級別，但提供工藝上目前很難實現。
【發明內容】
[0007]為了解決上述存在問題，本發明通過研究，采用最終滅菌法來控制膠原及其產品的微生物限度，使其達到無菌的同時也不改變其生物活性，從而是其應用更加安全，有效。
[0008]本發明的目的在于提供一種具有生物活性的無菌膠原液。
[0009]本發明的另一目的在于提供一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法。
[0010]本發明所采取的技術方案是:
一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，包括如下步驟:
1)將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒；
2)將上述消毒后的筋腱在超低溫條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維； 3)將粉碎后的筋腱組織進行酸溶酶解，再過濾除渣得膠原原液；
4)將膠原原液進一步鹽析、純化，即可得到高純度的膠原液；
5)將純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下進行灌裝，分裝并封口；
6)將封口好的高純度膠原液進行冷凍；
7)將冷凍后的膠原液放入裝有干冰或超低溫冰盒的泡沫箱或保溫箱中并密封，進行低溫輻照滅菌，解凍后即可得到無菌的膠原液。
[0011 ] 進一步的，上述筋腱為牛筋腱、豬筋腱或鼠尾筋腱。
[0012]一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，步驟2)中所述的粉碎溫度為-150。。?-60 0C ο
[0013]進一步的，上述步驟3)中所述的酸溶酶解的具體操作為:將所獲得的筋腱纖維加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中，以10~50rpm的攪拌速度攪拌3~10小時。
[0014]進一步的，上述純化是采用超濾純化系統進行的純化，超濾系統純化的條件為:進口端壓力為10~40psi,回流端壓力為0~10psi,進行恒體積的6~12倍超濾。
[0015]進一步的，上述步驟6)中所述的冷凍溫度為-80°C?-10°C，冷凍時間為18?72h。
[0016]進一步的，上述步驟7)中所述低溫輻照滅菌的劑量為15~40kGy，溫度為_75°C?(TC。
[0017]進一步的，上述膠原原液的酸溶酶解、鹽析、純化、灌裝過程均在溫度20°C?28 0C，。
[0018]一種具有生物活性的無菌膠原液，所述的膠原液是按照上述任一所述的方法制成的。
[0019]上述具有生物活性的無菌膠原液在制備皮膚損傷修復產品、創面修復產品、醫學美容產品或化妝品中的應用。
[0020]本發明的有益效果是:
I)本發明在低溫條件下對膠原液進行輻照滅菌，可使產品達到無菌(無菌保證水平SAL=1 6)的同時，保持膠原的活性，避免了膠原在輻照的過程中變性失活或者發生交聯反應造成的功能下降甚至失活。
[0021]2)本發明采用超濾純化代替傳統的透析純化，效果是縮短了純化的時間，另外采用自動化系統代替傳統的半自動操作，避免了人手污染，保證了產品的潔凈度、純度、生物活性。
[0022]3)本發明將動物組織在超低溫條件下進行粉碎，破碎組織成粉末狀或細絲狀，使組織在酸溶酶解的過程中大大的增加了反應的接觸面積，使反應的時間縮短和提高產率，有利于膠原保存完好的生物活性。
[0023]
【附圖說明】
[0024]圖1為實施例1制備的膠原液的SDS-PAGE電泳檢測，M為sigma標準品，I為實施例I制備的膠原液。
【具體實施方式】
[0025]一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，包括如下步驟:
1)將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒；
2)將上述消毒后的筋腱在超低溫條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維；
3)將粉碎后的筋腱組織進行酸溶酶解，再過濾除渣得膠原原液；
4)將膠原原液進一步鹽析、純化，即可得到高純度的膠原液；
5)將純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下進行灌裝，分裝并封口；
6)將封口好的高純度膠原液進行冷凍；
7)將冷凍后的膠原液放入裝有干冰或超低溫冰盒的泡沫箱或保溫箱中封口，進行低溫輻照滅菌，解凍后即可得到無菌的膠原液。
[0026]優選的，上述筋腱為牛筋腱、豬筋腱或鼠尾筋腱。
[0027]優選的，上述步驟2)中所述的粉碎溫度為_150°C?-60°C。
[0028]優選的，上述步驟3)中所述的酸溶酶解的具體操作為:將所獲得的筋腱纖維加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中，以10~50rpm的攪拌速度攪拌3~10小時。
[0029]優選的，上述冰醋酸和胃蛋白酶的混合液的體積為筋腱纖維的100~200倍。
[0030]優選的，上述冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中含0.1-0.5mol/L的冰醋酸和300~400mg/L的胃蛋白酶。
[0031]優選的，上述步驟4)中所述的鹽析為將膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析，取沉淀，將沉淀重新加入0.2-0.5mol/L冰醋酸溶液中進行溶解。
[0032]優選的，上述步驟4)中所述的純化是采用超濾純化系統進行的純化，超濾系統純化的條件為:進口端壓力為10~40psi，回流端壓力為0~10psi，進行恒體積的6~12倍超濾。
[0033]優選的，上述步驟6)中所述冷凍時間為18?72h，冷凍溫度為0°C以下，更優選為-80°C?-10°C。
[0034]優選的，上述步驟7)中所述低溫輻照滅菌的輻照劑量為15~40kgy，溫度為0°C以下，更優選為-75°C?(TC。
[0035]優選的，上述膠原原液的酸溶酶解、鹽析、純化、灌裝過程均在溫度20°C?28°C下進行。
[0036]優選的，上述膠原原液生產過程均在萬級環境下進行。
[0037]—種具有生物活性的無菌膠原液由上述所述的方法制成。
[0038]上述方法制成的具有生物活性的無菌膠原液在制備美容、藥劑中的應用。
[0039]實施例1
1)新鮮的健康牛筋腱，切除油脂去筋膜，清洗去除雜質，冷凍后切片，消毒、保存備用
2)取上述消毒過后的牛筋腱在-80°C?-60°C條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維；
3)在筋腱纖維中加入100倍體積的0.5mol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌3小時，環境溫度范圍為25?28°C，攪拌速度50rpm ；
將上述混合液過濾除渣得膠原原液；
4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析，取沉淀，將沉淀重新加入0.5mol/L的冰醋酸進行溶解，通過超濾設備進行純化，超濾系統的條件為:口端壓力為40psi，回流端為lOpsi，進行恒體積的6倍超濾即可得到高純度的膠原液；
5)將上述純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下采用半自動灌裝設備進行灌裝，分裝入鋁箔袋中，封口 ；
6)將封口好的高純度膠原液_18°C以下進行冷凍24小時；
7)將冷凍好的膠原液裝入保溫箱中，保溫箱中裝入4片超低溫冰盒，使保溫箱的溫度維持在0°C以下，密封保溫箱，送到輻照中心進行25kgy的輻照，室溫解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原液。
[0040]實施例2
1)新鮮的健康豬筋腱，切除油脂去筋膜，清洗去除雜質，冷凍后切片，消毒、保存備用
2)取上述消毒過后的豬筋腱在-150°C?-100°C條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維；
3)在筋腱纖維中加入150倍體積的0.4mol/L的冰醋酸和300mg/L的胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌10小時，環境溫度范圍為25?27°C，攪拌速度1rpm ；
將上述混合液采用40目的濾網進行過濾除渣得膠原原液；
4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析，取沉淀，將沉淀重新加入0.4mol/L的冰醋酸進行溶解，通過超濾設備進行純化，超濾系統的條件為:口端壓力為lOpsi，回流端為Opsi，進行恒體積的12倍超濾即可得到高純度的膠原液；
5)將上述純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下進行灌裝，分裝入鋁箔袋中，封口 ；上述所述膠原原液的酸溶酶解、鹽析、純化、灌裝過程均在溫度20°C?28°C下進行；
6)將封口好的高純度膠原液_20°C以下進行冷凍24小時；
7)將冷凍好的膠原液裝入保溫箱中，保溫箱中裝入4kg的干冰，使保溫箱的溫度維持在-75°C?0°C，密封保溫箱，送到輻照中心進行40 kGy的輻照，室溫解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原液。
[0041]實施例3
1)新鮮的健康鼠尾筋腱，去筋膜，清洗去除雜質，冷凍后切段，消毒、保存備用
2)取上述消毒過后的筋腱在_80°C?_60°C條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維；
3)在筋腱纖維中加入200倍體積的0.lmol/L的冰醋酸和400mg/L的胃蛋白酶的混合液中，持續攪拌10小時，環境溫度范圍為27?28°C，攪拌速度15rpm ；
將上述混合液過濾除渣得膠原原液；
4)將上述膠原原液加入等體積的1.4mol/L的氯化鈉溶液進行鹽析，取沉淀，將沉淀重新加入0.5mol/L的冰醋酸進行溶解，通過超濾設備進行純化，超濾系統的條件為:口端壓力為20psi，回流端為Opsi，進行恒體積的8倍超濾即可得到高純度的膠原液；
5)將上述純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下進行灌裝，分裝入鋁箔袋中，封口 ；上述所述膠原原液的酸溶酶解、鹽析、純化、灌裝過程均在溫度20°C?28°C下進行；
6)將封口好的高純度膠原液_25°C以下冷凍20小時；
7)將冷凍好的膠原液裝入保溫箱中，保溫箱中裝入6片超低溫冰盒，使保溫箱內維持(TC以下，密封保溫箱，送到輻照中心進行15kgy的輻照，室溫解凍后即可得到具有生物活性的無菌膠原液。
[0042]上述實施例中制備的具有生物活性的無菌膠原液可注射于人體的皮下組織，起到填充，具有美容的效果，可用于制備美容藥劑；可制備成膠原膜或粉劑，用于創面修復、皮膚損傷修復等。
[0043]SDS-PAGE 電泳檢測下面對實施例1制備的具有生物活性的無菌膠原液進行SDS-PAGE電泳檢測，檢測結果如果圖1所示。從圖1中可以看出，采用上述方法制備的膠原蛋白具有較高的生物活性及純度。
[0044]為本領域的專業技術人員容易理解，以上所述僅為本發明專利的較佳實施例，并不用以限制本發明，凡本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均落在本發明要求的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:包括如下步驟: 1)將動物的筋腱進行脫脂、切片、消毒； 2)將上述消毒后的筋腱在超低溫條件下進行粉碎，得到細絲狀的筋腱纖維； 3)將粉碎后的筋腱組織進行酸溶酶解，再過濾除渣得膠原原液； 4)將膠原原液進一步鹽析、純化，即可得到高純度的膠原液； 5)將純化后的高純度膠原液在十萬級或以上潔凈環境下進行灌裝，分裝并封口； 6)將封口好的高純度膠原液進行冷凍； 7)將冷凍后的膠原液放入裝有干冰或超低溫冰盒的泡沫箱或保溫箱中并密封，進行低溫輻照滅菌，解凍后即可得到無菌的膠原液。2.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:所述筋腱為牛筋腱、豬筋腱或鼠尾筋腱。3.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:步驟2)中所述的粉碎溫度為_150°C?_60°C。4.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:步驟3)中所述的酸溶酶解的具體操作為:將所獲得的筋腱纖維加入冰醋酸和胃蛋白酶的混合液中，以10~50rpm的攪拌速度攪拌3~10小時。5.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:所述的純化是采用超濾純化系統進行的純化，超濾系統純化的條件為:進口端壓力為10~40psi,回流端壓力為0~10psi,進行恒體積的6~12倍超濾。6.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:步驟6)中所述的冷凍溫度為-80°C?-10°C，冷凍時間為18?72h。7.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:步驟7)中所述低溫輻照滅菌的劑量為15~40kGy，溫度為-75°C?0°C。8.根據權利要求1所述的一種具有生物活性的無菌膠原液的制備方法，其特征在于:所述的膠原原液的酸溶酶解、鹽析、純化、灌裝過程均在溫度20°C?28°C，。9.一種具有生物活性的無菌膠原液，其特征在于:所述的膠原液是按照權利要求1~8任一所述的方法制成的。10.權利要求1~8任一所述的方法制成的具有生物活性的無菌膠原液在制備皮膚損傷修復產品、創面修復產品、醫學美容產品或化妝品中的應用。
【文檔編號】A61P17/02GK105985429SQ201510068429
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月9日
【發明人】李奕恒, 陳淡嫦, 曾進朋, 周小潔
【申請人】廣州創爾生物技術股份有限公司