Lgr4蛋白片段及其在制備治療破骨細胞誘導的骨病的藥物中的用圖
【專利摘要】本發明提供一種分離的具有SEQ ID NO.1所示的LGR4蛋白片段，該蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的蛋白序列。本發明還提供該蛋白片段在用于制備治療破骨細胞誘導的骨病的藥物中的用途，其中所述蛋白片段可抑制體內破骨細胞分化。進一步的，本發明還提供該蛋白片段在用于研究體外或體內抑制破骨細胞分化的用途。
【專利說明】
LGR4蛋白片段及其在制備治療破骨細胞誘導的骨病的藥 物中的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域的 LGR4 (Leucine-rich repeat containing G-protein coupled receptor 4,富亮氨酸重復基序G蛋白偶聯受體4)的蛋白片段，具體地，本發明涉 及一類與骨質疏松癥與骨巨細胞瘤相關的LGR4蛋白片段，以及其在制備治療破骨細胞誘 導的骨病的藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 近年來關于破骨細胞調節人體生理功能的研究不斷增多，越來越多的研究證明破 骨細胞不僅參與生物體骨代謝的自身平衡，在免疫系統調節中也占有一席之地（Immunol Rev. 2005Dec ;208:19-29.)。更重要的是，在許多病理狀態下，破骨細胞功能缺失或者過度 活化都時有發生，以至增加疾患者的痛苦與治療復雜性。比如，類風濕關節炎病癥患者往往 伴隨破骨細胞功能亢進，導致嚴重的骨質丟失，使病人飽受痛苦；乳腺癌患者晚期往往易發 生骨轉移，轉移至骨的癌細胞能促進破骨細胞過度活化，也能導致骨質疏松，對患者的治療 和生活狀態都帶來極大不便；畸形性骨炎中破骨細胞的過度活化是患者骨骼畸形的主要原 因；骨巨細胞瘤中破骨樣細胞劇烈活化，致患者骨質嚴重丟失，致殘致畸；骨胳石化癥患者 中破骨細胞功能丟失，疾患骨密度過高，易畸形，這些都給生活帶來不便。此外，正常生理狀 況下，婦女絕經后也易發生骨丟失，其主要原因也正在于破骨細胞功能亢進（Nat Rev Drug Discov. 2012 May ;11(5) :401-19. doi:10· 1038/nrd3705.)。因此，針對破骨細胞開發藥物 靶點的研究在骨疾病領域尤其是骨質疏松癥占了絕大比例。
[0003] 目前針對破骨細胞相關疾病（包括骨質疏松癥及骨巨細胞瘤）的藥物治療可以分 為兩大類，一類是小分子化合物，如雙磷酸鹽類藥物；二是蛋白類藥物，如RANKL誘導受體 RANK-Fc及0PG蛋白、RANKL單抗地諾單抗（Denosumab)。具體而言，小分子化合物方面，雙 磷酸鹽能夠促進成熟破骨細胞凋亡，從而對破骨細胞相關疾病能有治療作用。截止目前，雙 磷酸鹽類藥物發展經歷了三代：第一代雙磷酸鹽是不含氮的雙磷酸鹽，包括依替膦酸鈉、氯 屈膦酸鈉及替魯膦酸鈉。由于它們的結構與雙磷酸基很相似，因此當破骨細胞吸收骨表面 礦化區后，它們在二型RNA氨基轉移合成酶的作用下能插入到新合成的腺苷三磷酸（ATP) 中，這種不可水解的ATP類似物在胞內不斷累積后會抑制由ATP介導的多種細胞過程，從而 對破骨細胞產生細胞毒作用，導致破骨細胞凋亡；與初代雙磷酸鹽不同的是，第二代及第三 代雙磷酸鹽（阿侖膦酸鈉、利塞膦酸鈉、埃本膦酸鈉、帕米膦酸鈉以及唑來膦酸）在R 2側鏈 處存在氮原子，它們引起破骨細胞凋亡的機理與初代雙磷酸鹽不同。研究表明這兩代雙磷 酸鹽能結合并抑制法尼基焦磷酸合成酶，而這種酶調節甲羥戊酸代謝為膽固醇及其他甾醇 以及類異戊二烯脂質，由此，調節破骨細胞核心活性（如應力纖維裝配、膜皺褶及存活）的 蛋白（包括Rab、Rac及Rho)的翻譯后修飾（異戊二烯化）會受到抑制并最終引起破骨細胞 凋亡。臨床上，雙磷酸鹽對破骨細胞的這一作用使它廣泛應用于多種與破骨細胞功能亢進 相關的疾病中，包括多種類型的骨質疏松癥（如青春期的、絕經后的或是年老后的骨質疏 松癥，糖皮質激素誘發的骨質疏松，器官移植及長時間不動引發的骨質疏松以及去雄激素 相關的骨質疏松癥）、佩吉特氏骨病、成骨不全癥、高血鈣癥及惡性腫瘤骨轉移（Mayo Clin Proc. 2008Sep ；83 (9) : 1032-45. doi : 10. 4065/83. 9. 1032.) 〇
[0004] 蛋白類藥物方面，目前基礎科研與臨床應用主要針對破骨細胞分化及活化所需 的RANKL蛋白進行研發，較為知名的是RANKL競爭型受體蛋白及近年來已用于部分臨床病 癥的地諾單抗。已有兩種針對RANKL開發的競爭型受體蛋白見諸報道：一是包含RANK受 體部分結構域的RANK-Fc多肽，它由RANK的胞外段CRD結構域與IgGl的Fc結構域構成。 RANK-Fc能特異性地結合RANKL而不與其他TNF家族配體相互作用，從而在一些臨床前模型 中發揮抑制骨吸收的作用；二是〇PG-Fc多肽。0PG是天然的RANKL誘餌受體，能夠與RANK 受體競爭結合RANKL從而阻斷RANKL-RANK信號通路。OPG-Fc多肽的研發經歷了多個階 段，早期研究發現大劑量（>10-30mg/kg)的重組0PG全長多肽能有效抑制小鼠體內的骨吸 收現象，這種0PG全長多肽的結構比較固化，因此它的藥代動力學參數很不樂觀。隨著研究 深入，又研發出了只包含N末端CRD結構域而缺失C末端發夾結構的0PG多肽，這種多肽的 藥代動力學水平得到了明顯提高，經過對0PG截短體進行大規模篩選后，研究者發現人類 0PG蛋白的22-194氨基酸多肽片段與IgGl的Fc結構域融合后形成的OPG-Fc多肽能比全 長0PG蛋白有近200倍的活性提高，且這一多肽在體內也具有更長的半衰期。利用原核表 達系統得到的OPG-Fc多肽的一期臨床實驗表明它在體內能濃度梯度依賴地迅速促進骨更 新，這一實驗首次說明阻斷RANKL信號對人類骨更新是有效果的。同時，另一種由哺乳動 物細胞表達的〇PG-Fc多肽（AMGN-0007)也具有這一效果，且其半衰期更長（近10倍于原 核表達的OPG-Fc多肽），效果也要好2-3倍，這可能是因為真核系統中0PG還發生了糖基 化之故。總的來說，針對RANKL設計的競爭受體能有效抑制體內破骨細胞的活性，從而改善 骨丟失現象。除去競爭受體之外，近年來還有研究團隊開發出了 RANKL特異性抗體地諾單 抗，開啟了破骨細胞的抗體治療途徑。地諾單抗是一類IgG2單克隆抗體，與人RANKL蛋白 具有極高親和力，其解離平衡結合常數（Kd)為3pM，它與可溶性形式及膜結合形式的RANKL 都能相互作用，但不識別小鼠及大鼠的RANKL蛋白。臨床研究表明，地諾單抗療效與安全性 兼備，對骨質疏松癥及癌癥引起的骨丟失與骨破壞均具有顯著療效。進一步研究還發現地 諾單抗還能遲滯與預防前列腺癌及乳腺癌骨轉移的發生。此外，還有研究表明地諾單抗對 骨巨細胞瘤患者也有療效（Nat Rev Drug Discov.2012May ;11(5) :401-19. doi:10. 1038/ nrd3705.)。這些研究表明針對RANKL設計研發形成的藥物能有效抑制破骨細胞活性，且對 破骨細胞相關的骨質疏松癥及骨巨細胞瘤具有顯著效果。因此，抑制RANKL分子的藥物開 發具有廣泛用途與價值。
[0005] 中國專利申請201310047174、發明名稱"珍珠母蛋白N16的制備方法及其在制備 防治骨科疾病藥物中的應用"公開了一種利用基因重組法在細菌中表達珍珠母蛋白N16,建 立了 N16的分離純化方案。所制備得到的N16能抑制前體破骨細胞的增殖，抑制RANKL誘導 前體破骨細胞分化成為成熟的破骨細胞，抑制破骨細胞標志性酶酸性磷酸酶TRAP的活性， 抑制破骨細胞的形成，抑制破骨細胞分化相關基因的表達，抑制破骨細胞分化成熟。實驗結 果表明，N16蛋白不僅能促進成骨細胞分化，更能抑制破骨細胞分化，從而達到抗骨質疏松 和治療骨折的目的。這預示著該蛋白有可能用于增強成骨細胞的礦化功能，治療去卵巢引 起的骨質疏松癥。
[0006] 中國專利申請201210232648、發明名稱"包含cFms胞外片段的融合蛋白質及其 制備方法和應用"公開了一種包含巨噬細胞刺激因子受體（cFms)胞外片段的融合蛋白質， 該蛋白具有結合白細胞介素-34(IL-34)和結合巨噬細胞刺激因子（M-CSF)，阻斷IL-34/ M-CSF配體跟共用受體cFms的結合的作用，適合治療異常情況下由IL-34/M-CSF所引起的 疾病。對自身免疫性疾病、炎癥性疾病、骨質疏松癥和腫瘤具有潛在的治療前景。
[0007] 國際專利申請TO2010/117011、發明名稱為"anti-Siglec 15 antibody"公開了一 種能夠靶向由在破骨細胞中強烈表達的基因編碼的蛋白的抗體。該抗體特異性靶向在巨細 胞瘤中特異性表達的Siglec 15基因，并抑制破骨細胞形成的活性，取得良好的效果。
[0008] 如上所述，目前用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質類疾病的蛋白類藥物，多 集中在制備特異性抗體、抑制劑或RANKL競爭型受體方面，而針對G蛋白偶聯受體（GPCR) 靶點設計開發治療破骨細胞相關的骨質疏松癥與骨巨細胞瘤很少有報道。近些年隨著各類 生物基因組測序的完成和比較基因組學的發展，人們發現在脊椎動物和非脊椎動物中還存 在許多與上述糖蛋白激素受體結構相似或具有同源性的受體蛋白。在脊椎動物中，按照這 些受體蛋白被發現的時間先后順序，依次命名為LGR4、LGR5、LGR6、LGR7和LGR8等。這些 結構相似的蛋白構成了 GPCR超家族中一個亞家族，即富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受 體（LGR，Leucine-rich G-protein Coupled Receptor)。系統進化分析法顯不 LGRs 可以 分成三個亞組：第一組為經典的糖蛋白激素受體，包括卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone, FSH)受體、促甲狀腺激素 （thyroid stimulating hormone，TSH)受體以及黃體 生成素 （luteinizing hormone, LH)受體，其各自與糖蛋白激素 FSH，TSH和LH/hCG結合。 第二組由LGR4-6組成，一度因其功能和同源配體不明而歸屬于孤兒受體，近期有研究發現 Rspondin家族成員能與LGR家族的胞外段結構發生相互作用并激活WNT信號通路，因此， Rspondin家族成員被認為是LGR家族的天然配體。第三組包括LGR7與LGR8,最近發現分別 是松弛素和萊迪希膜島素樣肽（Leydig insulin-like peptide or relaxin-like factor 3, INSL3)受體。迄今為止，LGR已知的生理學功能主要涉及到眼部或腎臟發育和生殖。
[0009] 關于LGR4,人類LGR4基因定位于染色體的11ρ14~13上（Am J Med Genet A. 2011 Jun ;155A(6) :1272-80. doi:10. 1002/ajmg. a. 33878.)，屬G蛋白偶聯受體（GPCR)A家族，又 屬于富亮氨酸重復基序G蛋白偶聯受體（LGR)家族（Development 136,2747-2756(2009) doi : 10. 1242/dev. 033571)，編碼一個含有951個氨基酸的細胞膜受體蛋白。鼠 Lgr4基 因定位于2號染色體上，也編碼一個含有951個氨基酸的細胞膜受體蛋白。LGR4在體內 分布相當廣泛，包括生殖系統、腎臟、腎上腺、骨骼等等，并且早在小鼠胚胎的第7天，LGR4 就已開始表達，提示LGR4在小鼠發育中的重要作用（Katoh-Fukui Y，0waki A, Toyama Y, et al. Mouse Polycomb M33 is required for splenic vascular and adrenal gland formation through regulating Ad4BP/SFl expression. Blood, 2005, 106(5):1612-20.)〇 另外，LGR4基因敲除小鼠子宮內發育遲緩以及出生后的高死亡率也說明LGR4對小鼠的 胚胎發育具有非常重要的影響（Mendive F, Laurent P, Van Schoore G，et al. Defective postnatal development of the male reproductive tract in LGR4 knockout mice. Dev Biol, 2006, 290(2) :421-34.)，但迄今為止對于LGR4在具體器官胚胎期發育中的 功能尚未見有文獻報道。而目前研究較為深入的是LGR4對小鼠生殖系統出生后發 育的影響。LGR4基因敲除小鼠輸出小管和附睪出生后發育異常，延伸和擴展障礙，并 引起管道堵塞和睪丸積水，最終導致雄性小鼠不育。究其原因可能是LGR4影響生殖 道細胞的增殖和分化（Hoshii T，Takeo T，Nakatata N，et al.LGR4 Regulates the Postnatal Development and Integrity of Male Reproductive Tracts in Mice. Biol R印rod, 2007, 76 (2) : 303-13.)。此外，LGR4也參與腎臟的發育，LGR4缺陷導致腎小球數目 減少（Lala DS, Rice DA, Parker KL, et al. Steroidogenic factor I, a key regulator of steroidogenic enzyme expression, is the mouse homolog of fushi tarazu-factor I. Mol Endocrinol, 1992, 6 (8) : 1249-58.)。最近還發現LGR4能促進腫瘤細胞的轉移，但 對細胞的增殖似乎沒有影響（Honda S，Morohashi K, Nomura M，et al.Ad4BP regulating steroidogenic P_450gene is a member of steroid hormone receptor superfamily. J Biol Chem，1993, 268(10) :7494-502.)。目前對于LGR4功能的認識僅限于以上所述。
【發明內容】
[0010] 本發明原理在于，發明人是首次創新地研究發現LGR4的蛋白片段（laa-504aa， LGR4-ECD)能與RANK競爭結合RANKL，從而抑制破骨細胞分化與功能的分子機理，說明LGR4 蛋白片段可用于開發RANKL競爭多肽藥物從而抑制破骨細胞活性的可能性。鑒于以上發 現，發明人利用原核表達系統，以重組表達LGR4的蛋白片段，發現原代骨髓單核吞噬細胞 經該蛋白處理后，其由RANKL或成骨細胞誘導的向成熟破骨細胞分化的能力能被完全抑 制，并呈現濃度梯度依賴性。此外，該蛋白片段還能有效抑制病理狀態下骨巨瘤患者腫瘤細 胞中巨細胞的分化；同時，在兩種小鼠骨質疏松動物模型中的研究進一步發現，該蛋白片段 既能預防又能治療由于破骨細胞過度活化所致的骨丟失現象。
[0011] 因此，本發明第一個目的是提供一種分離的具有LGR4蛋白質胞外段結構的蛋白 片段，所述蛋白片段的序列是選自如下所示的蛋白序列之任一種：
[0012] (1)如SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列；
[0013] (2)與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列具有至少90%同一性且具有相同功能的蛋 白；
[0014] (3)在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列中發生一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加、但具有相同功能的蛋白；
[0015] (4)在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列的基礎之上經過一至數個堿基替 換和/或一至數個堿基的插入和/或缺失、以及大片段的核苷酸序列插入、缺失、移位、或倒 位后，所表達的且具有相同功能的蛋白片段；或
[0016] (5)在中度嚴格條件下能夠與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列雜交且編 碼得到的具有相同功能的蛋白片段。
[0017] 在一個實施方案中，所述蛋白序列優選還包括是發生1至5個突變、并與SEQ ID NO. 1序列具有至少99%同源性的蛋白的其他蛋白序列，其中該蛋白具有相同功能。在優選 的實施方案中，所述突變是1-4個，更優選是1-3個，或者更優選是1或2個，最優選是發生 1個突變。其中，所述突變優選是替換、插入或缺失突變。應當指出的是，本發明所涉及的蛋 白序列，其通過具有一定序列組成的蛋白所形成的特有空間構象，與RANK競爭結合RANKL， 從而抑制破骨細胞分化與功能，其并非直接作用于相關位點或發揮功能來抑制抑制破骨細 胞分化與功能。而SEQ ID NO. 1所示蛋白序列全長504aa，其具有99%同源性的序列與所 述SEQ ID NO. 1所示蛋白序列，二者差別不到5個aa的突變。而對于本領域技術人員而言， 對于相同來源（人類基因組）的多個蛋白序列，彼此之間具有99%的同源性且不到5個突 變的序列，其更多情況被證實具有相同的功能，而不是被證實其功能缺失。因此本領域技術 人員可以預見，在限定上述序列、有限同源性以及突變數量的前提下，所述的其他蛋白序列 同樣具有相同或相似的功能。
[0018] 在一個實施方案中，上述（1)中所述如SEQ ID NO: 1所示的蛋白片段為人源的 LGR4-ECD (以下簡稱h4)，其能與核因子κ B配體的受體激活子相結合。
[0019] 在其它的實施方案中，所述蛋白片段具有抑制RANKL、或抑制RANKL-RANK的結合 的功能，從而抑制或治療因破骨細胞引起的骨質類疾病。
[0020] 本發明第二個目的是提供以上蛋白片段的基因編碼序列或其簡并序列。
[0021] 本發明第三個目的在于提供上述蛋白片段在制備治療破骨細胞誘導的骨病的藥 物中的用途。其中，所述蛋白片段用于抑制體內破骨細胞分化。進一步地，包括所述蛋白片 段在骨質疏松癥與骨巨細胞瘤疾病治療中的應用，包括所述蛋白片段在制備治療骨質疏松 癥與骨巨細胞瘤疾病的藥物中的應用。
[0022] 在一個實施方案中，所述蛋白片段能抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化。
[0023] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能抑制由RANKL過度刺激所引起的體內骨質減 少。
[0024] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能緩解患有骨質疏松癥小鼠的骨質減少，緩解 由于骨質疏松引起的骨質減少。
[0025] 在另一實施方案中，所述蛋白片段能抑制骨巨瘤患者的破骨細胞活性。
[0026] 在上述實施方案中，上述制藥用途包括制備抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥 物、或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。在一具體的實施方案中，其中，所述的抑制破骨細胞引 起的骨質疏松癥的藥物是用于治療類風濕性關節炎、關節炎、腫瘤轉移引起的骨組織吸收 過多所致的骨質疏松癥的藥物；其中，抑制腫瘤生長和轉移的藥物指抑制骨巨瘤或骨巨細 胞瘤的藥物，包括制備治療骨原發的良性侵襲性腫瘤的藥物。
[0027] 在上述實施方案中，所述藥物還包括藥學上可接受的鹽、載體或輔料成分。
[0028] 在另外的實施方案中，上述藥物還可與其他藥物活性成分聯合制備上述疾病的藥 物。
[0029] 本發明第四個目的在于提供上述蛋白片段用于研究體外或體內抑制破骨細胞分 化的用途。
[0030] 在一個實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內抑制破骨細胞 分化的用途。例如，將本發明所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑制破骨細胞分化的藥 物。
[0031] 在另一個實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內抑制成骨細 胞誘導的破骨細胞分化的用途。例如，將本發明所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑制 成骨細胞誘導的破骨細胞分化的藥物。
[0032] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內抑制成由 RANKL過度刺激所引起的體內骨質減少的用途。例如，將本發明所述蛋白片段用于制備在體 外或體內抑制由RANKL過度刺激所引起的體內骨質減少的藥物。
[0033] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內緩解患有骨質 疏松癥小鼠的骨質減少的用途。例如，將本發明所述蛋白片段用于制備在體外或體內緩解 由于骨質疏松癥引起的骨質減少的藥物。
[0034] 在另一實施方案中，所述用途是利用上述蛋白片段研究體外或體內抑制骨巨瘤患 者的破骨細胞活性的用途。例如，將本發明所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑制骨巨 瘤中破骨細胞活性的藥物。
[0035] 在以上實施方案中，更具體的用途是利用上述蛋白片段，用于篩選抑制或緩解上 述疾病或癥狀的藥物的用途。上述疾病或癥狀包括，成骨細胞誘導的破骨細胞分化，由 RANKL過度刺激所引起的體內骨質減少，由于骨質疏松癥引起的骨質減少，骨巨瘤中及破骨 細胞活性。
[0036] 術語和定義
[0037] 術語"G蛋白偶聯受體（G-protein Coupled Receptor, GPCR) "，是一類具有古老起 源的保守的細胞表面受體，其對多種環境刺激起反應，引起細胞內的應答，在許多生理學過 程中發揮重要作用并且是藥物研究的重要靶點。
[0038] 術語"蛋白片段"，指LGR4活性蛋白中的部分片段。
[0039] 術語"人源LGR蛋白"指具有富亮氨酸重復基序的人源G蛋白偶聯受體（leucine rich repeat containing G prtein coupled receptor)家方矣。
[0040] 術語"人源LGR4蛋白片段"指具有SEQ ID NO: 1所示序列的氨基酸的蛋白片段， 其長度為504aa。其中，人LGR4蛋白的全長為951aa，其NCBI登錄號為NP_060960. 2,該全 長蛋白的功能為調控了眼、腎、睪丸、卵巢、子宮的臟器及智力發育，并能作為調控白色脂肪 向棕色脂肪轉換的開關，激活Wnt信號通路并促進結腸癌等癌癥的發生。
[0041 ]術語"RANK"，指受體激活型核受體因子 κ B(Receptor activator of nuclear factor κ B)，其NCBI登錄號為NP_033425. 3,其功能為引起乳腺癌發生，促進破骨細胞形成 并調節骨質，促進淋巴結發育，增強T細胞生長及樹突狀細胞的功能。
[0042] 術語"RANKL"，指受體激活型核受體因子κ B配體（Receptor activator of nuclear factor κ B ligand)，其NCBI登錄號為NP_035743. 2,其功能為促進破骨細胞形成， 促進樹突狀細胞的存活，增強T細胞生長及樹突狀細胞的功能。
[0043] 術語"RANKL-RANK"，指RANKL與RANK蛋白的相互作用。
[0044] 術語"Opg敲除小鼠"，指Opg基因敲除小鼠，目前是一種公認的骨質疏松動物模 型。
[0045] 術語"至少90%同一性"，指序列彼此之間相同位點數目的比例超過90%。本發明 中，所述蛋白序列優選是具有91%、92%、93%、或94%同一性，更優選是具有95%、96%、 或97%同一性，最優選是具有98%、或99%同一性。
[0046] 術語"中等嚴格條件"指0· 1XSSPE(或0· 1XSSC)、0. l%SDS(w/v)的溶液中，65°C 條件下雜交并洗膜的條件。
【附圖說明】
[0047] 圖1所示為LGR4蛋白片段的純化表達圖，其中，
[0048] 圖la所示為LGR4蛋白片段SDS-PAGE考馬斯亮藍結果圖，箭頭所示為純化得到的 LGR蛋白片段。
[0049] 圖lb所示為LGR4蛋白片段蛋白免疫印跡結果圖，h4組的目的條帶為經His標簽 抗體檢測確認的LGR4蛋白片段。NC，陰性對照。
[0050] 圖2所示為LGR4蛋白片段與RANKL相互作用圖，其顯示LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶） 過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結果，RANKL可與LGR4 E⑶發生共沉淀， RSP0-1為陽性對照。
[0051] 圖3所示為LGR4蛋白片段與RANK競爭結合RANKL圖，其顯示LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶）過表達293T細胞裂解液、RANK過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結果。 RANKL與RANK的相互作用隨著LGR4 E⑶加入濃度的提高而不斷減弱。
[0052] 圖4所示為LGR4蛋白片段體外抑制破骨細胞分化圖，其中，
[0053] 圖4a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)酶活檢測結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細 胞，該結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由RANKL誘導的破骨細胞分化。
[0054] 圖4b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制RANKL誘導的破骨細胞分化計量數據 分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 3，p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 001定義為 ***，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3個重復孔。
[0055] 圖5所示為LGR4蛋白片段抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化圖，其中，
[0056] 圖5a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞。該 結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由成骨細胞誘導的破骨細胞分化。
[0057] 圖5b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化計量數 據分析圖，其中*P〈〇. 05, η = 3。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為 *，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3 個重復孔。
[0058] 圖6所示為LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨細胞分化及骨質丟失的動 物實驗綜合圖，其中
[0059] 圖6a_l顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色信號為破骨細胞；該 結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）能抑制RANKL誘導的體內急性破骨細胞分化。圖6a-2 顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制RANKL誘導的體內急性破骨細胞分化破骨細胞表面 積計量數據分析圖，其中***P〈〇. 001，η = 6。p值經student T-test檢驗而得，p值小于 〇. 001定義為*#，以示LGR4蛋白片段抑制體內破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示 該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0060] 圖6b-l所示為microCT結果顯示注射LGR4胞外段蛋白染色結果圖，箭頭所示為 骨損傷及蛋白片段處理后的修復區，該結果表明注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能緩解 RANKL注射所引起的骨質丟失；圖6b-2顯示LGR4蛋白片段緩解RANKL注射引起的骨質丟 失的骨量計量數據分析圖，其中*P〈〇. 05，**P〈0. 01，n = 6。p值經student T-test檢驗而 得，P值小于〇. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制體內破骨細 胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0061 ] 圖7所示為LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠破骨細胞的過度活化及骨質疏松癥 狀的動物實驗綜合結果圖
[0062] 圖7a所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果顯示注射LGR4蛋白片段 (LGR4-ECD，即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠顱骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號 為破骨細胞。圖7a-l為染色結果圖，圖7a-2為數據分析圖。**P〈0. 01，***P〈0. 001，η = 6。ρ值經student T-test檢驗而得，ρ值小于0. 01定義為**，ρ值小于0. 001定義為***， 以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實 驗一組使用了 6只小鼠。
[0063] 圖7b所示為microCT結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1) 能緩解Opg小鼠顱骨的骨質疏松癥狀，箭頭所示為骨損傷及蛋白片段處理后的修復區。圖 7b-l為染色結果圖，圖7b-2為數據分析圖。*P〈0. 05, #P〈0. 01，η = 6。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段緩 解Opg敲除小鼠骨質丟失有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0064] 圖7c所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果顯示注射LGR4蛋白片段 (LGR4-ECD，即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠脛骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號 為破骨細胞。圖7c-l為低倍鏡顯示結果，圖7c-2為高倍鏡顯示結果，圖7c-3為數據分析 圖。***Ρ〈0· 001，η = 11。p 值經 student T-test 檢驗而得，p 值小于 0· 001 定義為 ***， 以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 11表示該 實驗一組使用了 11只小鼠。
[0065] 圖7d所示為microCT結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1) 能緩解〇pg小鼠脛骨的骨質疏松癥狀。圖7d-l為染色結果圖，圖7d-2為數據分析圖。 *P〈0. 05，n = 11。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為*，以示LGR4蛋 白片段緩解〇pg敲除小鼠骨質丟失有無顯著性差異；η = 11表示該實驗一組使用了 11只 小鼠。
[0066] 圖8所示為LGR4蛋白片段體外抑制骨巨細胞瘤患者中巨細胞活化結果圖，其中，
[0067] 圖8a所示為抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞； 該結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞的分化。圖 8b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞分化的計量數據 分析圖，其中*P〈〇. 05, **p〈0. 01，η = 3。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05 定義為*，P值小于〇. 〇1定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制骨巨細胞瘤中破骨細胞分化有 無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3個重復孔。
【具體實施方式】
[0068] 現結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內 容不局限于以下實施例。在不背離發明構思的精神和范圍下，本領域技術人員能夠想到的 變化和優點都被包括在本發明中，并且以所附的權利要求書為保護范圍。實施本發明的過 程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常 識，本發明沒有特別限制內容。
[0069] 實施例一：LGR4蛋白片段的純化表達
[0070] PCR擴增LGR4基因，將擴增產物構建到PET-28a(+)原核表達載體上，PET-28a-ECD 轉化Rosetta菌（全式金，cd801_03)，構建過程參照表1。
[0074] 根據"生物物理學報2010年9月第26卷第9期：790-798"報道的一般原核表達 方法，將上述載體轉化Rosetta菌，誘導表達LGR4蛋白片段，實驗結果見圖1。
[0075] 圖la :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD，h4) SDS-PAGE考馬斯亮藍結果圖，箭頭所示為純 化得到的LGR蛋白片段。
[0076] 圖lb :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD，h4)蛋白免疫印跡結果圖，h4組的目的條帶為經 His標簽抗體檢測確認的LGR4蛋白片段。NC，陰性對照。
[0077] 實施例二：LGR4蛋白片段結合RANKL實驗
[0078] 使用lipofectamine2000按照制造商方案將含有上述LGR4片段的質粒（構建過 程參見下文）過表達于293T細胞中，轉染24小時后，細胞以PBS洗一遍，用細胞刮刀刮下， 經12000rpm離心一分鐘后將細胞塊以RIPA弱裂解液于冰上裂解15分鐘，經12000rpm 4 度離心10分鐘后取上清于新EP管中，分別加入500ngRANKL及200ngRSP0-l (陽性對照）； EP管置靜音混合器上4攝氏度孵育過夜（〈12小時），翌日每管加入5微升FLAG-M2珠子， 繼續于4攝氏度孵育3小時，后以3000rpm于4度離心1分鐘，去上清，用PBS洗3遍后以 1XSDS上樣緩沖液裂解珠子，100攝氏度煮沸10分鐘后進行免疫印跡實驗。免疫印跡實驗 具體流程如下：
[0079] 1)配置10 %分離膠
[0080] 2)將全部樣品上到膠孔中，60伏跑30分鐘，120伏繼續跑至溴酚藍到膠底（約75 分鐘）
[0081] 3)轉膜，100伏轉，40KD以下蛋白轉45分鐘，40KD~130KD蛋白轉90分鐘
[0082] 4) 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時
[0083] 5) -抗4攝氏度結合過夜
[0084] 6) PBST洗滌4次，每次5分鐘，后上相應熒光二抗，室溫1小時
[0085] 7)PBST洗滌3次，每次5分鐘，后用Licor Oddessy機子掃膜，記錄結果
[0086] 實驗結果見圖2
[0087] 圖2 :LGR4蛋白片段（LGR4 E⑶）過表達293T細胞裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀 結果，RANKL可與LGR4 E⑶發生共沉淀，RSP0-1為陽性對照。
[0088] 表 2
[0089]
[0090] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段能夠與RANKL結合，具有抑制RANKL的效 果，本發明所述蛋白片段可用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質類疾病。
[0091] 實施例三：LGR4蛋白片段抑制RANKL-RANK結合實驗
[0092] 使用lipofectamine2000按照制造商方案將10ug LGR4片段質粒（參見表2)、 6ugRank、4ug FLAG-Vector以及2ugEGFP-N3分別過表達于293T細胞中，轉染24小時后， 細胞分別以PBS洗一遍，用細胞刮刀刮下，經12000rpm離心一分鐘后將細胞塊以RIPA弱 裂解液于冰上裂解15分鐘，經12000rpm4攝氏度離心10分鐘后取上清于新EP管中，按 如下設計混合蛋白裂解液：2ugEGFP-N3+2ugFLAG、2ugRANK+2ugFLAG、2ugRANK+2ugLGR4 片 段、2ugRANK+8ugLGR4片段，而后再分別加入lOOngRANKL ;EP管置靜音混合器上4攝氏度 孵育過夜，翌日每管先加入4微升RANK抗體（1 :50)，4攝氏度孵育3小時，再加入20微升 proteinA/G珠子，繼續于4攝氏度孵育3小時，后以3000rpm于4攝氏度離心1分鐘，去上 清，用PBS洗3遍后以1XSDS上樣緩沖液裂解珠子，100攝氏度煮沸10分鐘后進行免疫印跡 實驗。免疫印跡實驗具體流程如下：
[0093] 1)配置10 %分離膠
[0094] 2)將全部樣品上到膠孔中，60伏跑30分鐘，120伏繼續跑至溴酚藍到膠底（約75 分鐘）
[0095] 3)轉膜，100伏轉，40KD以下蛋白轉45分鐘，40KD~130KD蛋白轉90分鐘
[0096] 4) 5%脫脂牛奶室溫封閉1小時
[0097] 5) -抗4攝氏度結合過夜
[0098] 6) PBST洗滌4次，每次5分鐘，后上熒光二抗，室溫1小時
[0099] 7)PBST洗滌3次，每次5分鐘，后用LicorOddessy機子掃膜，記錄結果
[0100] 實驗結果見圖3
[0101] 圖3 :LGR4蛋白片段（LGR4 ECD)過表達293T細胞裂解液、RANK過表達293T細胞 裂解液與RANKL蛋白免疫沉淀結果。RANKL與RANK的相互作用隨著LGR4 ECD加入濃度的 提高而不斷減弱。
[0102] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段具有抑制RANKL-RANK的結合的效果，本 發明所述蛋白片段可用于抑制或治療因破骨細胞引起的骨質類疾病。
[0103] 實施例四：LGR4蛋白片段體外抑制破骨細胞分化
[0104] 取6周大野生型與敲除型小鼠股骨與脛骨組織，剔除非骨組織，經酒精消毒及PBS 洗滌后，用剪刀剪開股骨與脛骨的兩端，使用10毫升注射器及27G針頭按2~3ml α -MEM 培養基/股骨將骨髓單核吞噬細胞沖出至50毫升離心管中，細胞懸液經lOOOrpm離心8分 鐘后去除上清，以5毫升含雙抗的無血清α -MEM培養基重懸細胞，后加入20毫升紅細胞 裂解液，上下混勻后靜置2分鐘，再加入25毫升含10 %血清的α-MEM培養基終止裂解，經 1000印111離心8分鐘后去上清，用適量含10%血清的€[-|^1培養基重懸細胞，加入51^/1111 吞噬細胞集落刺激因子，待細胞貼壁過夜后取懸浮細胞至新培養皿中，加入l0ng/ml吞噬 細胞集落刺激因子培養，待細胞貼壁長滿后，以Versene消化細胞并按104個/孔接入24孔 板中，以核因子κΒ受體激活子配體（100ng/ml)及吞噬細胞集落刺激因子（10ng/ml))刺 激骨髓單核吞噬細胞向破骨細胞分化，在加入l00ng/ml RANKL誘導分化的同時加入濃度梯 度（20ng/ml、100ng/ml、200ng/ml)的 LGR4 蛋白片段（LGR4-ECD，即 h4)(參見表 1)處理細 胞，經6天分化后根據TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數統 計細胞分化情況。
[0105] 實驗結果見圖4。
[0106] 圖4a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)酶活檢測結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細 胞，該結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由RANKL誘導的破骨細胞分化。
[0107] 圖4b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制RANKL誘導的破骨細胞分化計量數據 分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 3，p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 001定義為 ***，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3個重復孔。
[0108] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段對破骨細胞的分化具有抑制作用。本發 明所述蛋白片段能夠抑制由RANKL誘導的破骨細胞的分化。
[0109] 實施例五：LGR4蛋白片段抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化
[0110] 根據實施例四方法取得原代骨髓單核吞噬細胞（BMM);同時，選取出生后4天的乳 鼠取得成骨細胞，具體方法為：分離4天齡小鼠顱骨，經75 %酒精洗滌晾干后用解剖刀刮干 凈顱骨表面至浸泡PBS中骨面呈白色為止；其后將顱骨置12孔板中，加入3. 5毫升普通強 度消化液（3. 5毫升α -MEM培養基、35微升10mg/ml膠原酶P、88微升0. 05%胰酶）于37 攝氏度培養箱中消化30分鐘，用無菌鑷子轉移顱骨至6孔板中，加入800微升高強度消化 液（1毫升α -MEM培養基、20微升10mg/ml膠原酶P、25微升0. 05%胰酶），用無菌剪刀將 顱骨剪成小碎片，以一片完整顱骨剪成均勻的30~40片為宜，于37攝氏度培養箱消化60 分鐘，最后加入2毫升培養基（42毫升α-MEM培養基、7. 5毫升胎牛血清、500微升100X雙 抗）終止消化待其貼壁；貼壁細胞即為成骨細胞。
[0111] 于96孔板中每孔接入1X104個BMM細胞與1X10 3個成骨細胞，24小時貼壁培養后 加入濃度梯度的LGR4蛋白片段（LGR4-ECD ;20ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)處理細胞，經7天 培養后根據TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數統計細胞分 化情況。
[0112] 實驗結果見圖5。
[0113] 圖5a顯示抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞。該 結果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制由成骨細胞誘導的破骨細胞分化。
[0114] 圖5b顯示LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）抑制成骨細胞誘導的破骨細胞分化計量數 據分析圖，其中*P〈〇. 05, η = 3。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義為 *，以示LGR4蛋白片段抑制破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3 個重復孔。
[0115] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段對破骨細胞的分化具有抑制作用。本發 明所述蛋白片段能夠抑制由成骨細胞誘導的破骨細胞的分化。
[0116] 實施例六：LGR4蛋白片段抑制RANKL注射引起的破骨細胞分化及骨質丟失的動物 實驗
[0117] 分別設立對照蛋白組、RANKL單注射組、LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶，即h4)單注射組 及RANKULGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4)共注射組；將表達蛋白注射于6周齡的C57BL/6 小鼠顱骨皮下，連續注射14天后取小鼠顱骨，經4%甲醛固定后，根據TRAP染色試劑盒說明 書所述（Sigma公司）對顱骨整體進行TRAP染色，于37攝氏度染色2小時；同時，顱骨樣品 由上海腫瘤研究所進行micro-CT檢測（SKYSCAN公司）。上述實驗結果見圖6。
[0118] 圖6a_l :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色信號為破骨細胞；該結 果表明LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶）能抑制RANKL誘導的體內急性破骨細胞分化。圖6a-2顯 示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制RANKL誘導的體內急性破骨細胞分化破骨細胞表面積計 量數據分析圖，其中***P〈〇. 〇〇l，n = 6。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 001 定義為***，以示LGR4蛋白片段抑制體內破骨細胞分化有無顯著性差異；η = 6表示該實驗 一組使用了 6只小鼠。
[0119] 圖6b-l :micr〇CT結果顯示注射LGR4胞外段蛋白染色結果圖，箭頭所示為骨損傷 及蛋白片段處理后的修復區，該結果表明注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能緩解RANKL注 射所引起的骨質丟失；圖6b-2顯示LGR4蛋白片段緩解RANKL注射引起的骨質丟失的骨量 計量數據分析圖，其中*Ρ〈〇· 05, **Ρ〈0· 01，η = 6。p值經student T-test檢驗而得，p值 小于〇. 05定義為*，p值小于0. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制體內破骨細胞分化 有無顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0120] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段能夠抑制由RANKL過度刺激引起的破骨 細胞分化、及體內骨質減少。
[0121] 實施例七：LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠破骨細胞的過度活化及骨質疏松癥狀 的動物實驗
[0122] 對5月齡的野生型小鼠及Opg敲除小鼠分別設立對照蛋白組、LGR4蛋白片段 (LGR4-E⑶，即h4)注射組；將表達蛋白分別注射于野生型小鼠及Opg敲除小鼠顱骨皮下，連 續注射14天后取小鼠顱骨，經4%甲醛固定后，根據TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公 司）對顱骨整體進行TRAP染色，于37攝氏度染色2小時，實驗結果見圖7a ;同時，顱骨樣 品由上海腫瘤研究所進行micro-CT檢測（SKYSCAN公司），實驗結果見圖7b ;
[0123] 對5月齡的Opg敲除小鼠的左腿與右腿分別注射PBS及LGR4蛋白片段h4 ;將表 達蛋白分別注射于〇pg敲除小鼠的脛骨皮下，連續注射14天后取小鼠脛骨，經4%甲醛固定 24小時后，進行脫鈣包埋切片，具體流程如下：脛骨樣品經清水洗滌后用新鮮4%甲醛再固 定6小時，清水洗滌，置0. 5MEDTA (PH8. 0)分別常溫脫鈣7天，后用雙蒸水清洗10次，置PBS 中常溫浸泡3小時，之后進行組織石蠟包埋過程，過程如下：樣品分別置50%、75%、75% (4 攝氏度過夜）、85 %、95 %、95 % (4攝氏度過夜）、100 %、100 %酒精中脫水2小時，后分別置 50%二甲苯（酒精為稀釋溶劑）、100%二甲苯、100%二甲苯中透化2小時，再置融化的石蠟 油中60攝氏度過夜、新鮮蠟油中2小時，樣品包埋；包埋樣品經Leica切片機（RM2235)切 成6uM切片后進行TRAP染色，染色具體流程如下：
[0124] 1)切片經60攝氏度化臘1小時；
[0125] 2)切片分別經100%二甲苯、100%二甲苯、50%二甲苯（酒精為稀釋溶劑）、100% 酒精、95%酒精、85%酒精、75%酒精、雙蒸水、雙蒸水水化，每道流程均處理5分鐘；
[0126] 3)根據TRAP染色試劑盒說明書所述（Sigma公司）對切片進行TRAP染色，于37 攝氏度染色2小時；
[0127] 4)切片置雙蒸水中終止染色，0. 1%甲基綠中復染，封片；
[0128] 5)切片于Olympus顯微鏡下采集結果，利用osteomeasure分析軟件（查爾斯骨計 量公司）進行破骨細胞參數分析，實驗結果見圖7c ;同時，脛骨樣品由上海腫瘤研究所進行 micro-CT檢測（SKYSCAN公司），實驗結果見圖7d。
[0129] 圖7a :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶， 即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠顱骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號為破骨細胞。 **Ρ〈0· 01，***Ρ〈0· 001，n = 6。p 值經 student T-test 檢驗而得，p 值小于 0· 01 定義為 **， P值小于〇. 001定義為***，以示LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內破骨細胞分化有無 顯著性差異；η = 6表示該實驗一組使用了 6只小鼠。
[0130] 圖7b :microCT結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1)能緩解 〇pg小鼠顱骨的骨質疏松癥狀，箭頭所示為骨損傷及蛋白片段處理后的修復區。*P〈〇. 05， **Ρ〈0· 01，n = 6。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0· 05定義為*，p值小于0· 01 定義為**，以示LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠骨質丟失有無顯著性差異；η = 6表示該 實驗一組使用了 6只小鼠。
[0131] 圖7c :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶， 即h4,參見表1)能抑制Opg敲除小鼠脛骨中破骨細胞的過度活化，酒紅色信號為破骨 細胞。圖7c-l為低倍鏡顯示結果，圖7c-2為高倍鏡顯示結果，圖7c-3為數據分析圖。 ***Ρ〈0· 001，η = 11。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0· 001定義為***，以示 LGR4蛋白片段抑制Opg敲除小鼠體內破骨細胞分化有無顯著性差異；n= 11表示該實驗一 組使用了 11只小鼠。
[0132] 圖7d :microCT結果顯示注射LGR4蛋白片段（LGR4-ECD，即h4,參見表1)能緩解 Opg小鼠脛骨的骨質疏松癥狀。*P〈〇. 05, η = 11。p值經student T-test檢驗而得，p值 小于〇. 05定義為*，以示LGR4蛋白片段緩解Opg敲除小鼠骨質丟失有無顯著性差異；η = 11表示該實驗一組使用了 11只小鼠。
[0133] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段能夠緩解骨質疏松癥及骨質減少，能夠 抑制破骨細胞的過度活化，能夠抑制由于〇pg敲除引起的破骨細胞過度活化，并治療由于 〇pg敲除引起破骨細胞過度活化而導致的骨質疏松癥。
[0134] 實施例八：LGR4蛋白片段體外抑制骨巨細胞瘤患者中巨細胞活化
[0135] 于患者原代分離的骨巨細胞瘤中加入濃度梯度的LGR4蛋白片段（LGR4-E⑶，即 h4,參見表1 ;100ng/ml、500ng/ml、2000ng/ml)處理細胞，經4天處理后，根據TRAP染色試 劑盒說明書所述（Sigma公司）進行TRAP染色并計數統計細胞分化情況。實驗結果見圖8。
[0136] 圖8a :抗酒石酸堿性磷酸酶（TRAP)染色結果圖，酒紅色巨細胞為破骨細胞；該結 果表明LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)能抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞的分化。圖8b 顯示LGR4蛋白片段（LGR4-ECD)抑制骨巨細胞瘤原代細胞中破骨細胞分化的計量數據分析 圖，其中*p〈〇. 05，**p〈0. 01，n = 3。p值經student T-test檢驗而得，p值小于0. 05定義 為*，P值小于〇. 01定義為**，以示LGR4蛋白片段抑制骨巨細胞瘤中破骨細胞分化有無顯 著性差異；η = 3表示該實驗一組設計了 3個重復孔。
[0137] 根據實驗結果可見，本發明所述蛋白片段能夠抑制骨巨細胞瘤，能夠抑制骨巨細 胞瘤中破骨細胞的活性，從而抑制腫瘤生長和轉移。
【主權項】
1. 一種具有LGR4蛋白質胞外段結構的蛋白片段，其特征在于，所述蛋白片段的序列是 具有如下所示的序列： (1) 如SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列； (2) 與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列具有至少90%同一性且具有相同功能的蛋白； (3) 在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列發生一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和 /或添加、但具有相同功能的蛋白； (4) 在SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列的基礎之上經過一至數個堿基替換和 /或一至數個堿基的插入和/或缺失、以及大片段的核苷酸序列插入、缺失、移位、或倒位 后，所表達的且具有相同功能的蛋白片段；或 (5) 在中度嚴格條件下能夠與SEQ ID NO. 1所示的蛋白序列的編碼序列雜交且編碼得 到的具有相同功能的蛋白片段。2. 編碼如權利要求1所述蛋白片段的編碼序列或其簡并序列。3. 權利要求1所述的蛋白片段或權利要求2所述序列所編碼的蛋白片段在制備治療破 骨細胞誘導的骨病的藥物中的用途。4. 如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段能抑制成骨細胞誘導的破骨 細胞分化，或能抑制由RANKL過度刺激所引起的體內骨質減少，或能緩解由于骨質疏松引 起的骨質減少，或能抑制骨巨瘤中的破骨細胞活性。5. 如權利要求3所述的用途，其特征在于，所述藥物包括抑制破骨細胞引起的骨質疏 松癥的藥物、或抑制腫瘤生長和轉移的藥物。6. 如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述抑制破骨細胞引起的骨質疏松癥的藥 物是用于治療類風濕性關節炎、關節炎、腫瘤轉移引起的骨組織吸收過多所致的骨質疏松 癥的藥物；所述抑制腫瘤生長和轉移的藥物是抑制骨巨瘤或骨巨細胞瘤的藥物，優選包括 制備治療骨原發的良性侵襲性腫瘤的藥物。7. 如權利要求3-6之任一項所述的用途，其特征在于，所述藥物還包括藥學上可接受 的鹽、載體或輔料成分，和/或所述藥物與其他藥物活性成分聯合制備的藥物。8. 權利要求1所述的蛋白片段或權利要求2所述序列所編碼的蛋白片段在制備用于在 體外或體內抑制破骨細胞分化的藥物中的用途。9. 如權利要求8所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑 制成骨細胞誘導的破骨細胞分化的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑制由 RANKL過度刺激所引起的體內骨質減少的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內 緩解由于骨質疏松癥引起的骨質減少的藥物；或，所述蛋白片段用于制備在體外或體內抑 制骨巨瘤中破骨細胞活性的藥物。10. 如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述蛋白片段用于篩選抑制或緩解上述疾 病或癥狀的藥物的用途。
【文檔編號】A61P35/04GK105985426SQ201510094956
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年3月3日
【發明人】羅劍, 楊正峰, 劉明耀
【申請人】華東師范大學