吡唑酞嗪化合物及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明屬藥物合成領域，涉及式1的吡唑酞嗪化合物，尤其涉及一種含哌嗪的吡唑酞嗪化合物，及其制備方法和在醫學上的應用。本發明的化合物通過體外Hedgehog信號通路中的靶基因Gli抑制活性測試，結果顯示，所述的化合物具有良好的Hedgehog信號通路抑制活性，可進一步Hedgehog信號通路抑制劑和制備抗腫瘤藥物。
【專利說明】
吡唑酞嗪化合物及其制備方法和用途
技術領域
[0001] 本發明屬藥物合成領域，涉及新型吡唑酞嗪化合物，制備方法和應用。具體涉及一 種含哌嗪的吡唑酞嗪化合物，及其制備方法和在醫學上的應用。
【背景技術】
[0002] 據報道，惡性腫瘤已成為嚴重危害人民生命健康的常見病。據不完全統計，全世界 每年約有2000萬的新發病例；我國每年的新發病例約為160-200萬，死亡130萬。研究顯 示，由于腫瘤早期具有轉移的能力，臨床診斷的原發腫瘤中約50%的患者已產生遠位轉移， 腫瘤細胞増長快、易變異，從而產生多藥耐藥，導致化療失敗，據有關統計，其中90%以上與 腫瘤細胞的多藥耐藥相關，目前臨床上應用的抗腫瘤藥物遠不能滿足治療的要求。
[0003] 分子靶向抗腫瘤藥物的研究是當前抗腫瘤藥物研究領域的主要潮流和趨勢。近 年來，靶向Hedgeh 〇g(Hh)信號通路的抗腫瘤藥物成為該領域新的研究熱點。研究顯示了 Hedgeh〇g(Hh)信號通路在腫瘤的發生發展中發揮著重要的作用，與人類約1/3的腫瘤有著 密切的聯系。異常激活Hh信號傳導，將導致髓母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、 膀胱癌、卵巢癌等多種腫瘤的發生。Hedgehog是在研究果蠅的發育過程中發現的一種分節 性基因，Hh信號主要是通過跨膜蛋白Ptch和Smo介導向胞內傳遞。無Hh信號時，Ptch與 Smo結合，抑制Smo的作用，導致其下游轉錄因子G1 i轉錄活性的抑制。當有Hh信號時，Hh 與Ptch結合，解除Ptch對Smo的抑制作用，恢復活性的Smo通過級次信號轉遞，激活Gli 轉錄活性，啟動Hh靶基因的轉錄和表達。
[0004] 目前在靶向Hh信號通路的抗腫瘤藥物研究中，已有多個藥物上市或進入臨床研 究，如美國Genentech公司的Vismodegid (⑶C-0449)于2012年已被FDA批準上市，用于皮 膚癌的治療。另外，Erismodegid(LDE225,瑞士 Norvatis 公司）、LEQ_506(瑞士 Norvatis 公司）和LY-2940680 (美國Lilly公司）等正在進行臨床II期及III期，臨床研究顯示對 皮膚癌、腦癌、髓母細胞瘤和其他實體瘤療效顯著。
[0005] 更為有意義的是，有研究顯示，Hedgehog信號通路抑制劑在治療對酪氨酸激酶抑 制劑伊馬替尼產生耐藥的非小細胞肺癌（CML)患者過程中，不僅能減少CML細胞的數量， 還能減少耐伊馬替尼CML細胞的生長，針對目前已有抗腫瘤藥物耐藥性的問題是腫瘤臨床 治療面臨的重要難題，本申請的發明人擬提供具有我國自主知識產權的靶向Hh信號通路 的抗腫瘤藥物，其對改善我國腫瘤患者的經濟負擔，提高腫瘤臨床治療效果，具有重要的意 義。
【發明內容】
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[0006] 本發明的目的是提供具有良好Hedgehog信號通路抑制作用的新型吡唑酞嗪化合 物及其可藥用鹽，具體涉及一種含哌嗪的吡唑酞嗪化合物及其可藥用鹽。
[0007] 本發明的另一目的是提供上述含哌嗪的吡唑酞嗪化合物的制備方法。
[0008] 本發明的吡唑酞嗪化合物具有下述式1的結構：
[0009]
[0010] 本發明的化合物1的制備過程如下：
[0012] 本發明所述的化合物通過體外Hedgehog信號通路抑制活性測試，結果了所述的 化合物具有良好的Hedgehog信號通路抑制活性，可進一步研制開發用于診斷和治療與 Hedgehog通路有關的病變，包括但不限于腫瘤形成、癌癥、瘤形成和非惡性過度增殖性疾病 的藥物。
[0013] 本發明對體外Hedgehog信號通路抑制活性測試結果顯示，所述的化合物1顯示出 較好的Hedgehog信號通路抑制活性，對于Hh信號通路中的靶基因Gli抑制活性IC 5。值小 于2nM ;所述的化合物可進一步制備Hedgehog信號通路抑制劑。
[0014] 本發明中，所采用的藥效學試驗方法，是本領域技術人員所熟知的方法；
[0015] 本發明中，所采用的NIH3T3細胞、雙熒光素酶報告檢測試劑盒、Ptch+/-P53-/_小 鼠和Brdu Cell Proliferation Kit試劑盒是本領域技術人員可通過市購的途徑所獲得 的。
[0016] 本發明的吡唑酞嗪化合物及其藥用鹽可制備治療腫瘤的藥物組合物，其中包含治 療有效量的所述的化合物及其藥用鹽。
[0017] 本發明的吡唑酞嗪化合物尤其可制備Hedgehog信號通路抑制劑和抗惡性腫瘤藥 物。鑒于異常激活Hh信號傳導，將導致髓母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、膀胱 癌、卵巢癌等多種腫瘤的發生，本發明所述的Hedgehog信號通路異常激活所致的相關腫瘤 包括，髓母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、膀胱癌、卵巢癌、皮膚癌。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發明化合物對ptch+/-p53-/_小鼠髓母細胞瘤移植瘤模型體內抗腫瘤活 性結果。
【具體實施方式】：
[0019] 實施例1 :制備化合物1，2-(6-(4-(4-芐基酞嗪-1-基）-3_氮雜環丁醇-基）-吡 啶-3-基）_丙-2-醇
[0020] 1)合成6-哌嗪煙酸乙酯
[0021] 在乙腈（100ml)中加入 6-氯煙酸乙酯（12g, 0? 06mol)和哌嗪（8. 35g, 0? lOmol) 〇 加入碳酸鉀（17. 87g, 0? 13mol)。氮氣保護下，100°C回流，過夜反應。TLC(DCM:MeOH = 20:1) 監測反應完全，抽濾，濾除碳酸鉀，蒸干濾液。加入乙酸乙酯、水分液，少量水洗兩次，取有機 層。加入無水硫酸鈉，靜置。濾液旋干，即得產品11. 63g(乳白色固體），無須純化直接用于 下一步反應。粗品產率：86. 6%。HPLC-MS(ESI+) : [M+H] + :236. 1.
[0022] 2)合成6-(4-(4-氯酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）煙酸乙酯
[0023] 在 NMP (10ml)中加入 1，4-二氯酞嗪（1. 5g, 7. 6mmol, 1. 2equiv)、6_ 哌嗪煙酸乙酯 (1. 5g, 6. 4mol, 1. Oequiv)。碳酸鉀（1. 8g, 12. 8mmol, 2. Oequiv)氮氣保護下，80°C 下攪拌 12h。TLC(PE:EA= 1:1)監測反應完全，反應液傾至水（50ml)中，加入乙酸乙酯（50ml)，分 液，水層EA (50ml X 3)萃取，合并有機層，飽和氯化鈉（50ml X 3)洗NMP，無水硫酸鈉干燥， 減壓蒸去溶劑，柱層析純化（PE:EA = 2:1~1:1)，EA重結晶，得6-(4-(4_氯酞嗪-1-基） 哌嗪-1-基）煙酸乙酯1. 8g (淡黃色固體），產率：59. 5 %。4-匪1?(400MHz，DMS0-d6) 8 (ppm) :8. 84(d, J = 2. 3Hz, 1H), 8. 31 - 8. 22 (m, 1H), 8. 17 - 8. 03 (m, 2H), 8. 00 -7. 88 (m, 2H), 6. 69 (d, J = 9. 0Hz, 1H), 4. 34 (q, J = 7. 1Hz, 2H), 3. 96-3. 94 (m, 4H), 3. 66 = 3. 63 (m, 4H), L 37 (t, J = 7. 1Hz, 3H). HPLC-MS (ESI+) : [M+H]+: 398. 0, 400. 0.
[0024] 3)合成6-(4-(4-(1-甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）煙酸乙酯
[0025] 在20ml微波管中依次加入化合物6-(4-(4-氯酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）煙酸乙 酯（60〇11^，1.5臟〇1)、1-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1，3,2-二氧硼烷-2-基）-111-吡唑 (628mg, 3. Ommol)、K3P04/3H20(804mg, 3. Ommol), KF(175mg, 3. Ommol)，二甲苯（10ml)，氣氣 流吹3分鐘，加入？(1腫113)2(]1 2(10511^，0.15_31)，氬氣流吹3分鐘，密閉。微波下〇3；[(^區6 microwave reacter, 12CTC，High absorption)福射 3h，TLC(PE:EA= 1:1)監測反應完全， 將反應液傾至水（50ml)中，加入乙酸乙酯（50ml)，分液，水層EA (20ml X 2)萃取，合并有 機層，飽和氯化鈉（50ml X 3)洗滌，無水硫酸鈉干燥，旋干溶劑，得粗品500mg，柱層析純化 (PE:EA = 1:1~1:2)洗脫，得6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）P辰嗪-1-基） 煙酸乙酯 400mg(白色固體）產率：60. 1%。HPLC-MS(ESI+) : [M+H] + :444. 3.
[0026] 4)合成2- (6- (4- (4- (1-甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基）-吡 啶-3-基）_丙-2-醇
[0027] THF(50ml)中加入6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞嗪-1-基）哌嗪-1-基） 煙酸乙酯（200mg，0. 45mmol)，恒壓滴液漏斗裝置密閉體系，氬氣保護下轉移碘甲烷格式 試劑（CH3MgI，1. 4mmol/ml，1M1)至恒壓滴液漏斗，冰浴下滴入格氏試劑，滴加完后，常溫 反應5h。TLC(EA)監測反應完全，加入飽和氯化銨溶液30ml，EA(20mlX2)萃取，旋干，得 粗品220mg，制備薄層層析純化，EA展開3次，得2-(6-(4-(4-(1_甲基吡唑-6-基）酞 嗪-1-基）哌嗪-1-基）_吡啶-3-基）_丙-2-醇72mg(淡黃色固體）產率：16.6%。4 NMR(400MHz，CDCl3)S(ppm):8.35(d，J = 2. 4Hz，lH)，8.18 (d，J = 8.0Hz，1H)，8.07 (d，J =7. 7Hz, 1H), 7. 91-7. 83 (m, 2H), 7. 71 (dd, J = 8. 8, 2. 5Hz, 1H), 7. 65 (d, J = 1. 9Hz, 1H), 6. 75(d, J = 8. 8Hz, 1H), 6. 59 (d, J = 1. 9Hz, 1H), 4. 05 (s, 3H), 3. 83 (d, J = 6. 4, 4H)，3. 74 (d, J = 6. 3, 4H), 1. 58 (s, 6H) ? HPLC-MS (ESI+) : [M+H]+: 430. 2.。
[0028] 實施例2 :體外Hedgehog信號通路抑制活性測試試驗
[0029] 轉錄因子Gli的雙熒光素酶報告基因實驗：NIH3T3細胞接種至48孔板，24h后以 lipo2000 轉染試劑轉染 Gli-firefly luciferase reporter 和 TK-Renilla luciferase r印orter載體至NIH3T3細胞。轉染36h后，將鼠源重組的SHH及待測藥物加至48孔板（每 組設3復孔；n = 3)。常規培養36h后，細胞用PBS洗1次，以雙熒光素酶報告檢測試劑盒 (Promega公司）測定Gli-luciferase活性，作為判斷Hh通路活性指標；
[0030] 結果表明（如表1所不），本發明的化合物1顯不出較好的Hedgehog信號通路抑 制活性，對于Hh信號通路中的靶基因Gli抑制活性IC 5。值小于2nM ;本發明的化合物可以 進一步研制開發Hedgehog信號通路抑制劑，作為新型抗腫瘤藥物。
[0031] 表1是本發明化合物的Hedgehog信號通路的體外抑制活性結果。
[0032] 表 1
[0033]
Q
[0034] 實施例3 :對髓母細胞瘤的體外抗腫瘤活性測試試驗
[0035] 從？1：(：11+/-?53-/-小鼠分離髓母細胞瘤，機械剪碎，0.25%膠原酶（(3〇1138611&86 I)消化后獲得的髓母細胞瘤細胞培養于添加B-27supplement (Invitrogen)，EGF 20ng/ml (Invitrogen) , bFGF 20ng/ml (Invitrogen) , nonessential amino acids (Invitrogen), N-acetyl cysteine 60mg/ml,和 Glutamax(Invitrogen)的 Neurobasal A 培養基（Invitrogen);
[0036] 髓母細胞瘤細胞接種于96空培養板，加各種濃度的化合物1作用36h。Brdu實驗 采用Merck Millipore的Brdu Cell Proliferation Kit試劑盒，按照試劑盒說明進行；
[0037] 結果表明（如表2所示），本發明的化合物1顯示出較好的對ptch+/-p53-/_小 鼠髓母細胞瘤體外抑制活性，其IC 5。值為40. 4nM ;本發明的化合物可以進一步研制開發 Hedgehog信號通路抑制劑，作為新型抗腫瘤藥物。
[0038] 表2是本發明化合物對ptch+/-p53-/_小鼠髓母細胞瘤的體外抑制活性結果。
[0039] 表 2
[0040] ?〇
[0041] 實施例4 :體內抗腫瘤活性測試實驗
[0042] 取生長良好的Ptch+/-P53-/_小鼠，待髓母細胞瘤長到合適大小，取出，剪切成 1.5_左右，在無菌條件下，接種于5周齡雌性裸鼠（華阜康）的左側腋窩皮下，待移植瘤體 積長至110mm 3左右，剔除移植瘤過大、過小以及未見生長的裸小鼠，隨機分組給藥，實驗組 灌胃給藥（12.5、25、50mg/kg，一天兩次，灌胃給藥），陰性對照組同時給等量的溶媒0.5% CMC-Na ；
[0043] 腫瘤體積（tumor volume, TV)的計算公式為：TV = 1/2X長X寬X寬，根據測 量的結果計算相對瘤體積（relative tumor volume，RTV)，計算公式為：RTV = Vt/V0其中 V0為分籠給藥時測量所得的腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積；
[0044] 結果表明（如圖1所示），本發明的化合物1顯示出較好的對髓母細胞瘤的體內抑 制活性，在 12. 5mg/kg(bid, ig)、25mg/kg(bid, ig)、50mg/kg(bid, ig)三個不同劑量下均顯 示很強的體內抗腫瘤活性；本發明的化合物可以進一步研制開發Hedgehog信號通路抑制 劑，作為新型抗腫瘤藥物。
【主權項】
1. 化挫獻嗦化合物，其特征在于，所述的化合物為含贓嗦的化挫獻嗦化合物及其可藥 用鹽，為具有下述結構的化合物1及其可藥用鹽，P2. 權利要求1的化挫獻嗦化合物在制備化dgehog信號通路抑制劑中的用途。3. 權利要求1的化挫獻嗦化合物在制備治療惡性腫瘤藥物中的用途。4. 按權利要求3的用途，其特征在于，所述的惡性腫瘤是化dgehog信號通路異常激活 所致的相關腫瘤，包括髓母細胞瘤、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、結腸癌、膀脫癌、卵巢癌、皮膚 癌。5. 包含治療有效量的權利要求1所述的化合物及其藥用鹽的藥物組合物。
【文檔編號】C07D401/14GK105985321SQ201510072260
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月11日
【發明人】趙偉利, 董肖椿, 陸秀宏, 譚文福, 楊君, 鮑小龍, 王娟, 彭元求, 劉原
【申請人】復旦大學