抑制β2GPI表達的核酸的制作方法

抑制β2GPI表達的核酸的制作方法
【專利摘要】本發明提供了具有抑制β2GPI表達的活性的核酸、包含該核酸的醫藥組合物，以及提供了含有該核酸的、用于自身免疫病(例如APS、SLE等)以及血液透析中血栓的預防或治療性藥物。
【專利說明】
抑制β26ΡΙ表達的核酸
技術領域
[0001]本發明涉及用于抑制KGPI表達的核酸以及包含該核酸的醫藥組合物。
【背景技術】
[0002] β2-糖蛋白l(i32GPI)(又名為載脂蛋白H，ap〇H)是由326個氨基酸構成的糖蛋白，其 具有5個結構域相連而成的高級結構。02GPI被認為具有許多不同的生理作用，據報道，其涉 及血小板凝集反應、凝固和纖溶反應，以及巨噬細胞對氧化LDL的攝取(非專利文獻1)。
[0003] 在與疾病相關的方面，已知02GPI是抗磷脂抗體綜合征(APS)和系統性紅斑狼瘡 (SLE)這樣的自身免疫性疾病中所出現的抗磷脂抗體的主要對應抗原。抗02GPI抗體與疾病 的病理形成也深度相關，通過使用動物模型的研究和臨床研究已闡明，02GPI與抗02GPI抗 體形成的復合體在血管內皮細胞、單核細胞、血小板、滋養層細胞等多種細胞的膜受體上產 生活化信號，其繼而可引起血栓和異常妊娠等APS的特征性病理(非專利文獻2)。雖然預期 可通過特異性抑制KGPI和抗02GPI抗體形成的免疫復合物的形成，來預防或者治療上述疾 病，然而，由于02GPI在血液中以50~500μg/ml的相對高濃度存在，難以使用例如常規抗體 藥物實現對全部KGPI的持續抑制(非專利文獻3)。
[0004] 在另一方面，作為抑制基因自身表達的方法，利用例如RNA干擾(下文稱為RNAi)等 方法是已知的。具體而言，發現通過引入具有與靶序列相同的序列的雙鏈RNA，特異性地抑 制了靶基因的表達，所述RNA被命名為短干擾RNA(siRNA)(專利文獻1)。此外，作為除RNA干 擾之外的抑制基因表達的方法，反義方法也是已知的（專利文獻2)。
[0005] 盡管靶向人02GPI基因的siRNA序列的一部分已經被公開，抑制人02GPI基因表達 的siRNA序列仍是未知的(專利文獻3、4)。
[0006] 現有技術文獻
[0007] 專利文獻
[0008] 專利文獻 1:W0 2001/75164
[0009] 專利文獻2:W0 98/56905
[0010] 專利文獻3:W0 2005/116204
[0011] 專利文獻4:W0 2008/043561
[0012] 非專利文獻
[0013] 非專利文獻 1:Αηη·Ν·Y.Acad.Sci.，1285,44-58(2013)
[0014] 非專利文獻2:N.Engl.J.Med.，368，1033-1044(2013)
[0015] 非專利文獻3:J.Thromb.Haemost.，9，1275-1284(2011)

【發明內容】

[0016] 發明所要解決的課題
[0017] 本發明的目的在于提供一種抑制I32GPI表達的核酸。本發明的目的還在于提供一 種用于預防或治療KGPI表達相關疾病的醫藥組合物。
[0018] 解決課題的手段
[0019] 本發明涉及以下的（1)~（13)。
[0020] (1) 一種雙鏈核酸，其降低I32GPI基因的表達，所述雙鏈核酸由有義鏈和反義鏈組 成，所述雙鏈核酸包含至少11個堿基對的雙鏈區，其中在上述反義鏈中的鏈長為至少17個 核苷酸且至多30個核苷酸的寡核苷酸鏈與選自表1 -1至表1 -16中所述的組中的靶標f32GP I mRNA序列互補。
[0021 ] (2)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其中所述雙鏈區為11~27個堿基對，與選自表 1-1至表1-16中所述的組中的靶標02GPI mRNA序列互補的所述反義鏈中，從5'端起算的第2 個核苷酸與該靶標KGPI mRNA序列的從3 '端起算的第2個脫氧核糖核苷酸互補。
[0022] (3)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈的3'端和所述反義鏈的5'端形 成平末端。
[0023] (4)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈為21個核苷酸長，并且所述反 義鏈為21個核苷酸長。
[0024] (5)如上述(4)中所述的雙鏈核酸，其降低02GPI基因的表達，其為含有19個堿基對 的雙鏈區的經修飾雙鏈核酸，所述雙鏈區中的核苷酸中的40~65 %包含2 ' -0-甲基修飾核 苷酸。
[0025] (6)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其中所述反義鏈包含選自表1-1至1-16和表3-1 至3-5的"反義鏈"所記載的組。
[0026] (7)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈包含選自表1-1至1-16和表3-1 至3-5的"有義鏈"所記載的組。
[0027] (8)如上述（1)中所述的雙鏈核酸，其包含選自表1-1至1-16和表3-1至3-5所記載 的有義鏈/反義鏈所組成的組的1對有義鏈/反義鏈的序列。
[0028] (9)如上述(1)~(8)中任一項所述的雙鏈核酸，其包含配體。
[0029] (10)-種單鏈核酸，其僅由如上述(1)~(9)中任一項所述的雙鏈核酸中的反義鏈 組成。
[0030] (11)醫藥組合物，其包含如上述(1)~（10)中任一項所述的核酸。
[0031] (12)-種治療抗02GPI抗體所介導疾病的方法，其包括下述步驟：向有此治療需要 的人施用治療有效量的如上述(1)~（10)中任一項所述的核酸或者如上述(11)中所述的醫 藥組合物。
[0032] (13)如上述(12)所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫病或者血栓。
[0033]發明的效果
[0034]通過施用本發明的核酸或者包含該核酸的醫藥組合物，可抑制02GPI的表達。特別 地，可用于治療或預防與KGPI表達相關的疾病。
【具體實施方式】
[0035]作為本發明的核酸靶向的β2GPI基因（編碼β2GPI的基因），可舉出對應于以 Genbank登錄號NM_000042登錄的β2GPIcDNA(SEQIDN0:3541)的產生全長β2GPImRNA的 基因。
[0036] 1.本發明的核酸
[0037] 在本發明中，包含與02GPI mRNA互補的核苷酸序列的核酸被稱為反義鏈核酸，包 含與反義鏈核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸也被稱為有義鏈核酸。在本說明書 中，除非另有指明，"本發明的核酸"以涵蓋反義鏈核酸和有義鏈核酸，以及有義鏈和反義鏈 核酸配對的雙鏈核酸的含義使用。
[0038] 作為本發明的核酸，可以是由核苷酸或者具有與核苷酸同等功能的分子聚合而成 的任意的分子，可舉出例如，作為核糖核苷酸的聚合物的RNA，作為脫氧核糖核苷酸之聚合 物的DNA，由RNA和DNA構成的嵌合核酸，以及這些核酸的至少一個核苷酸被具有與核苷酸同 等功能的分子所替換的核苷酸聚合物。此外，這些核酸中含有至少一個與核苷酸同等功能 的分子的衍生物也被本發明的核酸所涵蓋。尿嘧啶(U)能夠毫無疑義地讀為胸腺嘧啶(T)。
[0039] 與核苷酸具有同等功能的分子的實例包括例如核苷酸衍生物等。作為核苷酸衍生 物，可以是通過對核苷酸施以修飾而獲得的任意的分子，例如，較之RNA或DNA，為改進核酸 酶抗性或者使其穩定，增強對互補鏈核酸的親和力，增強細胞通透性，或者使之可視化，通 過對核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸等施以修飾而獲得的分子是優選使用的。
[0040] 作為通過對核苷酸施以修飾而獲得的分子，可舉出例如糖部分經修飾的核苷酸、 磷酸二酯鍵經修飾的核苷酸、堿基經修飾的核苷酸、其中糖部分、磷酸二酯鍵和堿基中至少 之一經修飾的核苷酸等。
[0041] 作為糖部分經修飾的核苷酸，可以是針對核苷酸中糖的化學結構的部分或全部以 任意取代基進行了修飾或者取代而成的核苷酸，或者是以任意原子進行了取代而成的核 酸，但是2 修飾核苷酸是優選使用的。
[0042] 作為2 ' -修飾核苷酸，可舉出例如：核糖的2 ' -OH基被選自Η、OR、R、R ' OR、SH、SR、 NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl，Br和I(R是烷基或芳基，優選碳原子數為l~6的烷基，R'是亞烷 基，優選碳原子為1~6的亞烷基)的取代基取代的核苷酸，優選為2 ' -OH基被H、F或甲氧基取 代的核苷酸，更優選2 ' -OH基被F或甲氧基取代的核苷酸。此外，還可舉出2 ' -OH基被選自2-(甲氧基）乙氧基、3-氨基丙氧基、2-[(N，N-二甲基氨基)氧基]乙氧基、3-(N，N-二甲基氨基） 丙氧基、2-[2-(N，N-二甲基氨基）乙氧基]乙氧基、2-(甲基氨基)-2-氧基乙氧基、2-(N-甲基 氨基甲酰基）乙氧基和2-氰基乙氧基等取代基取代而成的核苷酸。
[0043]對于雙鏈核酸區內的核苷酸而言，2 ' -0-甲基修飾的核苷酸優選以10~70 %被含 有，更優選以20~40%被含有，特別優選以40~65%被含有。此外，對于有義鏈中的核苷酸 而言，2 ' -0-甲基修飾的核苷酸優選以20~40 %被含有，更優選以40~60 %被含有，特別優 選以60~100 %被含有。此外，對于反義鏈中的核苷酸而言，2 ' -0-甲基修飾的核苷酸優選以 0~40 %被含有，更優選以10~20 %被含有，特別優選以20~40 %被含有。
[0044] 作為糖部分經修飾的核苷酸，可舉出通過向糖部分引入交聯結構而得到的具有兩 個環狀結構的交聯結構型人工核酸(Bridged Nucleic Acid，BNA)，具體可舉出：其中2'位 氧原子和4'位碳原子通過亞甲基交聯的鎖人工核酸(Locked Nucleic Acid，LNA)、亞甲基 交聯結構型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid，ENA) [Nucleic Acid Research， 32，el75(2004)]等，以及肽核酸（PNA)[Acc.Chem.Res.，32,624(1999)]、氧-肽核酸（OPNA) [J.Am.Chem.Soc.，123,4653(2001)]、肽核糖核酸（PRNA)[ J.Am.Chem.Soc.，122,6900 (2000)]等。
[0045] 作為磷酸二酯鍵經修飾的核苷酸，可以是針對磷酸二酯鍵的化學結構的部分或者 全部以任意取代基進行了修飾或取代而成的核苷酸、或者以任意原子進行取代而成的核苷 酸，例如，磷酸二酯鍵被硫代磷酸酯鍵取代的核苷酸，磷酸二酯鍵被烷基磷酸酯鍵取代的核 苷酸，磷酸二酯鍵被亞磷酰胺鍵取代的核苷酸，等。
[0046] 作為堿基修飾的核苷酸，可以是針對核苷酸的堿基的化學結構的部分或者全部以 任意取代基進行了修飾或取代而成的核苷酸、或者以任意原子進行了取代而成的核苷酸， 例如，堿基中的氧原子被硫原子取代而成的核苷酸，氫原子被碳原子數為1~6的烷基、鹵素 等取代而成的核苷酸，甲基被氫、羥甲基、碳原子數為2~6的烷基取代而成的核苷酸，氨基 被碳原子數為1~6的烷基、碳原子數為1~6的烷酰基、氧基、羥基等取代而成的核苷酸。
[0047] 作為核苷酸衍生物，可舉出在核苷酸或糖部分、磷酸二酯鍵和堿基至少之一被修 飾的核苷酸衍生物上直接或者介由接頭附加了肽、蛋白質、糖、脂質、磷脂、酚嗪、葉酸、菲 啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素、染料等其他化學物質而成的物質，具體可舉出，附 加有5 聚胺的核苷酸衍生物，附加有膽固醇的核苷酸衍生物，附加有類固醇的核苷酸衍生 物，附加有膽酸的核苷酸衍生物，附加有維生素的核苷酸衍生物，附加有Cy5的核苷酸衍生 物，附加有Cy3的核苷酸衍生物，附加有6-FAM的核苷酸衍生物，以及附加有生物素的核苷酸 衍生物等。
[0048]核苷酸衍生物可以與核酸中的其他核苷酸或核苷酸衍生物形成交聯結構，例如亞 烷基結構、肽結構、核苷酸結構、酯結構、及這些結構中的至少一種組合而成的結構等等。
[0049] 本發明的核酸還涵蓋核酸分子中的部分或全部原子被不同質量數的原子（同位 素)取代而成的核酸。
[0050] 在本說明書中，"互補"意為兩個堿基能夠形成堿基配對的關系，表示例如腺嘌呤 和胸腺嘧啶或尿嘧啶之間的關系、鳥嘌呤和胞嘧啶之間的關系這樣的介由疏松的氫鍵在整 個雙鏈區采取雙螺旋結構的形式。
[0051 ]在本說明書中，"互補的"不僅意為兩個核苷酸序列之間完全互補，還包括核苷酸 序列之間有0~30%、0~20%或0~10%的錯配堿基，例如與02GPI mRNA互補的反義鏈表示 可在與mRNA部分核苷酸序列完全互補的核苷酸序列中含有一個或更多個堿基取代，具體 地，反義鏈可含有相對于靶標基因的靶序列而言1~8個(優選1~6個、1~4個、1~3個，特別 是2個或1個)錯配的堿基。例如，當反義鏈為21個堿基長時，其相對于靶標基因的靶序列而 言可含有6、5、4、3、2或1個錯配，該錯配的位置可以是序列的5'端或3'端。
[0052]此外，"互補的"涵蓋了一條核苷酸序列與其他核苷酸序列完全互補而且添加/或 缺失了一個或更多個堿基的核苷酸序列的情況。KGPI mRNA與本發明的反義鏈核酸可由于 在反義鏈中添加和/或缺失堿基，而在反義鏈和/或靶標02GPI mRNA區域含有1或2個凸出堿 基。
[0053]本發明的核酸為包含與02GPI mRNA的一部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的核 酸和/或包含與所述核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸即可，其可由任意的核苷 酸或其衍生物構成。對本發明的雙鏈核酸而言，只要包含與靶標02GPI mRNA序列互補的核 苷酸序列的核酸與包含和該核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸能夠形成雙鏈，就 可以是任意長度，能夠形成雙鏈的序列長度一般是11~35個堿基，優選15~30個堿基，更優 選17~25個堿基，進一步優選17~23個堿基，特別優選19~23個堿基。
[0054]作為本發明的反義鏈核酸，可以使用包含與靶標02GPI mRNA序列互補的核苷酸序 列的核酸，也可使用該核酸中的1~3個堿基(優選1~2個堿基，更優選1個堿基)缺失、替換 或者添加而成的核酸。
[0055] 作為本發明的抑制02GPI表達的核酸，優選使用:包含與靶標02GPI mRNA序列互補 的核苷酸序列且能夠抑制02GPI表達的單鏈核酸，或者包含與靶標02GPI mRNA序列互補的 核苷酸序列的核酸與包含和該核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸所構成的且能 夠抑制i32GP I表達的雙鏈核酸。
[0056] 在本發明中，雙鏈核酸表示其中兩條核苷酸鏈配對、具有雙鏈區域的核酸。雙鏈區 表示:構成雙鏈核酸的核苷酸或其衍生物構成堿基配對從而形成雙鏈的部分。雙鏈區通常 為11~27個堿基對，優選15~25個堿基對，更優選15~23個堿基對，進一步優選17~21個堿 基對，特別優選17~19個堿基對。
[0057] 構成雙鏈核酸的單鏈核酸通常為11~30個堿基，優選15~29個堿基，更優選15~ 27個堿基，進一步優選15~25個堿基，特別優選17~23個堿基，最優選19~21個堿基。
[0058] 當本發明的雙鏈核酸在緊連著雙鏈區的3'側或者5'側具有不形成雙鏈的額外核 苷酸或核苷酸衍生物時，這稱為突出部(overhang)。當存在突出部時，構成突出部的核苷酸 可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者其衍生物。
[0059] 作為具有突出部的雙鏈核酸，可以使用在至少一條鏈的3'端或者5'端具有1~6個 堿基(通常為1~3個堿基)形成的突出部的雙鏈核酸，優選使用具有2個堿基形成的突出部 的雙鏈核酸，例如可舉出具有dTdT或UU構成的突出部的雙鏈核酸。突出部可存在于僅反義 鏈中、僅有義鏈中、或者存在于反義鏈和有義鏈兩者中，在本發明中，優選使用在反義鏈和 有義鏈兩者中均具有突出部的雙鏈核酸。需要說明的是，反義鏈包含雙鏈區以及隨后的突 出部，該反義鏈在由至少17個核苷酸且至多30個核苷酸組成的寡核苷酸鏈中與選自表1-1 至表1-16中所記載的組中的靶標02GPI mRNA序列完全互補。此外，作為本發明的雙鏈核酸， 也可使用例如Dicer等核酸酶作用于上述雙鏈核酸生產的核酸分子(W02005/089287)、不含 有3 '端或5 '端的突出部的形成平末端的雙鏈核酸、僅有義鏈突出的雙鏈核酸（US2012/ 0040459)等。
[0060] 作為本發明的雙鏈核酸，可使用：由與靶標基因的核苷酸序列或其互補鏈的核苷 酸序列相同的序列組成的核酸，也可使用該核酸的至少一條鏈的5'端或3'端缺失1~4個堿 基所得的核酸與含有和該核酸的核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸形成的雙鏈核酸。 [0061 ] 本發明的雙鏈核酸可以是RNA彼此形成雙鏈的雙鏈RNA(dsRNA)、DNA彼此形成雙鏈 的雙鏈DNA(dsDNA)，或者RNA與DNA形成雙鏈的雜合核酸。或者，雙鏈中的一條鏈或者兩條鏈 可以是DNA和RNA的嵌合核酸。優選雙鏈RNA(dsRNA)。
[0062]優選地，本發明的反義鏈的從5'端起算的第2個核苷酸與靶標02GPI mRNA序列的 3'端起算的第2個脫氧核糖核苷酸互補，更優選地，反義鏈的5'端起算的第2~7個核苷酸與 靶標02GPI mRNA序列的3'端起算的第2~7個脫氧核糖核苷酸完全互補，進一步優選地，反 義鏈的5'端起算的第2~11個核苷酸與靶標02GPI mRNA序列的3'端起算的第2~11個脫氧 核糖核苷酸完全互補。此外，優選地，本發明的反義鏈的從5'端起算的第11個核苷酸與靶標 02GPI mRNA序列的3'端起算的第11個脫氧核糖核苷酸互補，更優選地，反義鏈的5'端起算 的第9~13個核苷酸與靶標02GPI mRNA序列的3'端起算的第9~13個脫氧核糖核苷酸完全 互補，進一步優選地，反義鏈的5 '端起算的第7~15個核苷酸與靶標02GPI mRNA序列的3 '端 起算的第7~15個脫氧核糖核苷酸完全互補。
[0063] 作為產生本發明核酸的方法，沒有特別限制，可舉出已知的使用化學合成的方法 或者酶轉錄的方法等。作為已知的使用化學合成的方法，可以是亞磷酰胺法、硫代磷酸酯 法、磷酸三酯法、CEM法[Nucleic Acid Research，35,3287(2007)]等，例如，可通過ABI3900 高通量核酸合成儀來合成。合成結束之后，進行從固相脫離，保護基解保護以及目標產物純 化等。期望通過純化而獲得純度90 %以上、優選95%以上的核酸。在雙鏈核酸的情況下，可 將合成和純化得到的有義鏈和反義鏈以合適的比例（例如相對于1當量的反義鏈而言，0.1 ~1 〇當量，優選〇. 5~2當量，更優選0.9~1.1當量，進一步優選等摩爾量的有義鏈)混合之 后進行退火再使用，或者可省去退火步驟直接使用。退火可以在能夠形成雙鏈核酸的任意 條件下進行，通常如下所述進行:將有義鏈、反義鏈等摩爾量混合，94°C加熱約5分鐘，然后 緩慢冷卻至室溫。作為制備本發明核酸的酶轉錄法，可使用以下方法:使用具有目標核苷酸 序列的質粒或DNA作為模板，使用噬菌體RNA聚合酶例如T7、T3或SP6RNA聚合酶進行轉錄。
[0064] 本發明的核酸可通過轉染用載體(優選陽離子型脂質體等陽離子型載體)被引入 到細胞內。此外，也可通過磷酸鈣法、電穿孔法、直接細胞內注射法來引入。
[0065] 本發明的核酸中5'端、3'端和/或序列內部可以被1個或更多個配體和熒光團所修 飾，配體或熒光團修飾的核酸也稱為核酸綴合物。在固相上進行延長反應時，可通過用能夠 在固相上反應的修飾劑進行反應，從而在5'端、3'端和/或序列內部施以修飾。此外，也可預 先合成并純化引入了氨基、巰基、疊氮基或者三鍵等官能團的核酸，通過修飾劑與它們發生 作用從而得到核酸綴合物。作為配體，可以是與生物分子有親和力的分子，可舉出例如膽固 醇、脂肪酸、生育酚、維甲酸等脂類，Ν-乙酰基葡萄糖胺(GalNAc)、甘露糖(Man)等糖類，完整 抗體、Fab、VHH等抗體類，低密度脂蛋白（LDL)、血清白蛋白等蛋白類，RGD、NGR、R9、CPP等肽 類，葉酸等小分子，合成聚氨基酸等合成聚合物，核酸適配體等，它們也可組合使用。作為熒 光團，可舉出Cy3系列、Alexa系列、黑洞淬滅劑等。
[0066] 可使用在引入到細胞后能夠表達本發明核酸的載體，來代替本發明的核酸。具體 地，可將編碼本發明核酸的序列插入到表達載體中啟動子的下游從而構建表達載體，然后 將表達載體引入到細胞中，由此表達該核酸。作為表達載體，可以是pCDNA6.2-GW/miR (Invitrogen公司制）、pSilencer 4. l_CMV(Ambion公司制）、pSINsi_hHl DNA(寶生物公司 制）、pSINsi_hU6DNA(寶生物公司制）、pENTR/U6(Invitrogen公司制）等。
[0067] 此外，可將本發明的核酸編碼序列插入到病毒載體的啟動子下游，將該載體引入 包裝細胞，用以生產重組病毒載體。作為病毒載體，可以是逆轉錄載體、慢病毒載體、腺病毒 載體、腺相關病毒載體等。
[0068] 2.具有抑制02GPI表達活性的核酸
[0069] 可基于例如以Genbank Accession Ν〇·ΝΜ_000042登錄的人02GPI全長mRNA的cDNA (有義鏈)核苷酸序列（SEQ ID N0:3541)來設計本發明的反義鏈和有義鏈。
[0070] 作為具有抑制I32GPI表達活性的核酸，可以是下述具有抑制02GPI表達活性的雙鏈 核酸，其由含有與KGPI mRNA互補的核苷酸序列的本發明反義鏈核酸以及含有與上述核酸 的核苷酸序列互補的核苷酸序列的本發明有義鏈核酸組成。構成所述雙鏈核酸的單鏈核酸 通常是11~30個堿基，優選15~29個堿基，更優選15~27個堿基，進一步優選15~25個堿 基，特別優選17~23個堿基，最優選19~21個堿基。所述雙鏈核酸具有通常15~27個堿基 對、優選15~25個堿基對、更優選15~23個堿基對、進一步優選15~21個堿基對、特別優選 15~19個堿基對的雙鏈區。
[0071]可通過將所述雙鏈核酸導入細胞，來抑制I32GPI的表達。例如，將數PM-數nM濃度的 本發明雙鏈核酸導入細胞，之后可在24小時以上例如48小時的培養階段中抑制02GPI mRNA 的表達。
[0072]此外，對本發明的雙鏈核酸的02GPI mRNA表達抑制活性的評價可通過以下方式進 行:使用陽離子脂質體等將該核酸等轉染到人細胞系等，培養一段時間后，對該人細胞系中 02GPI mRNA的表達水平進行定量。
[0073]作為具有02GPI表達抑制活性的核酸，除了上述雙鏈核酸之外，也可以是含有與β 2GPI mRNA的部分核苷酸序列互補的核苷酸序列的核酸，并且其是抑制02GPI表達的單鏈核 酸。構成該核酸的單鏈核酸通常是8~30個堿基，優選12~30個堿基，更優選12~20個堿基。 [0074] 通過將這些單鏈核酸導入細胞，也可抑制I32GPI表達。例如，將數pM-數nM濃度的本 發明單鏈核酸導入細胞，之后可在24小時以上例如48小時的培養階段中抑制02GPI mRNA的 表達。
[0075]此外，對本發明的單鏈核酸的02GPI mRNA表達抑制活性的評價可通過以下方式進 行:使用陽離子脂質體等將該核酸等轉染到人細胞系等，培養一段時間后，對該人細胞系中 02GPI mRNA的表達水平進行定量。
[0076] 3.本發明的醫藥組合物
[0077] 本發明還涉及含有上述雙鏈核酸、單鏈核酸等核酸作為有效成分的醫藥組合物。 本發明的醫藥組合物可用作APS、SLE等自身免疫病和血液透析中血栓的治療劑或預防劑。
[0078] 該醫藥組合物可包含能有效地將核酸轉移到細胞內的運載體。作為將核酸有效轉 移到細胞內的運載體，可以是，例如陽離子型運載體。作為陽離子型運載體，可以是陽離子 型脂質體或者陽離子型聚合物等。此外，作為能有效將核酸轉移到細胞內的運載體，可以是 利用了病毒包膜的運載體。作為陽離子型聚合物，優選使用JetSKQbiogene公司）、Jet_PEI (聚乙稀亞胺，Qbiogene公司）等。作為利用了病毒包膜的運載體，優選使用GenomeOne(HVJ-E脂質體，石原產業公司）等。
[0079] 包含本發明核酸和上述運載體的組合物可通過本領域技術人員已知的方法制得。 例如，可通過將合適濃度的運載體分散液和核酸溶液混合來制備。當使用陽離子型運載體 時，由于核酸通常在水溶液中帶負電荷，可通過常規方法在水溶液中混合從而容易地制備。 作為為了制備所述組合物使用的水性溶劑，可以是例如注射用水、注射用蒸餾水、生理鹽水 的電解質溶液，例如葡萄糖溶液、甘露糖溶液的糖溶液，等等。此外，制備所述組合物時的pH 和溫度等條件可由本領域技術人員適當選擇。在必要時，還可通過超聲分散裝置、高壓乳化 裝置等進行分散處理，來形成均一組合物形式的所述組合物。因為包含運載體和核酸的組 合物制備的最合適方法及條件基于所用的運載體，本領域技術人員可選擇對所用運載體來 說最合適的方法，而不限于上述方法。
[0080] 此外，作為本發明的醫藥組合物，還可優選使用例如核酸和引導顆粒作為組成部 分的復合顆粒構成的組合物，該復合顆粒覆蓋了脂質膜。作為引導顆粒，可舉出例如脂質組 裝體、脂質體、乳液顆粒、聚合物、金屬合金、微顆粒制劑等，優選可使用陽離子性脂質體。本 發明的引導顆粒可以以脂質組裝體、脂質體、乳液顆粒、聚合物、金屬合金、微顆粒制劑等中 兩種以上組合得到的復合物作為組成成分，或者以脂質組裝體、脂質體、乳液顆粒、聚合物、 金屬合金、微顆粒制劑等與其他化合物(例如糖、脂質、無機化合物等)組合而成的復合物作 為組成成分。
[0081]作為覆蓋所述復合顆粒的脂質膜，可以是，例如非陽離子型脂質、抑制顆粒聚集的 脂質以及作為組成成分的陽離子脂質。
[0082] 該組合物可通過例如W0 2006/080118公開等所記載的方法制備。
[0083]本發明的醫藥組合物中所含的核酸和運載體的混合比例合適地為相對于每1重量 份的核酸而言1~200重量份的運載體。優選為相對每1重量份的核酸而言2.5~100重量份 的運載體，更優選為相對每1重量份的核酸而言7~25重量份的運載體。
[0084] 關于本發明醫藥組合物的大小，優選地，平均粒徑約10nm~300nm，更優選約30nm ~200nm，進一步優選約50nm~150nm。
[0085] 除了上述運載體之外，本發明的醫藥組合物還可包含醫藥可接受的載體 (carrier)、稀釋劑等。醫藥可接受的載體、稀釋劑等為基本上化學上無活性以及無害的組 合物，對本發明的醫藥組合物的生物活性完全沒有影響。這些載體和稀釋劑的例子包括鹽 溶液、糖溶液、甘油溶液、乙醇等，但不限定于此。
[0086] 本發明的醫藥組合物含有治療或預防疾病有效量的所述復合物，并且以適于施用 給患者的形式提供。本發明的醫藥組合物的制劑形態可以是，例如注射劑、滴眼劑、吸入劑 等液體制劑，例如軟膏劑、洗劑等外用制劑。
[0087] 對于液體制劑來說，本發明醫藥組合物中有效成分的濃度范圍通常為0.0 01~ 25%(w/v)，優選0.1~10% (w/v)，更優選0.5~5%&八）。本發明醫藥組合物還可含有合適 量的醫藥可接受的任何添加劑，例如乳化輔助劑、穩定劑、等滲劑、pH調節劑等。醫藥可接受 的任何添加劑可在所述復合物分散之前或者分散之后在適當的步驟中加入。
[0088] 所述液體制劑的pH通常被調整到約5.0~約8.5，優選約6.0~約8.0，優選地，使用 膜濾器等過濾除菌等進行滅菌處理。
[0089] 本發明的醫藥組合物還可以制備成冷凍干燥制劑的形式。冷凍干燥制劑可通過在 對核酸和運載體進行分散處理后冷凍干燥處理來制備。冷凍干燥處理可通過常見方法進 行。例如，可以通過將上述分散處理后的復合物溶液在無菌狀態下以給定量分裝到小瓶中， 在約-40~-20°C的條件下預干燥約2小時，在約0~10°C減壓條件下進行第一干燥，然后在 約15~25°C減壓條件下進行第二干燥，來進行冷凍干燥。然后，可通過例如用氮氣替換小瓶 內部氣體，加蓋，從而得到本發明的醫藥組合物的冷凍干燥制劑。
[0090] 冷凍干燥制劑可通過添加任何合適溶液使其再溶解來使用。此類溶液可以是注射 用水、生理鹽水等電解質溶液，葡萄糖溶液，其他常見輸注液等。此類溶液的液體量，根據用 途不同各異，沒有特別的限制，優選為冷凍干燥前液體量的〇. 5至2倍量，不超過500ml。
[0091] 對于包括人在內的動物而言，本發明的醫藥組合物可通過例如靜脈內施用、動脈 內施用、經口施用、組織內施用、經皮施用、經粘膜施用或者經直腸施用來施用，優選根據患 者的癥狀以合適方法施用。特別地，優選使用靜脈施用、經皮施用、經粘膜施用。此外，也可 使用癌癥部位施用等局部施用。對于用于這些施用方法的合適劑型，可舉出各種注射劑、經 口劑、滴注劑、吸收劑、滴眼劑、軟膏劑、洗劑、栓劑等。
[0092 ]優選地，考慮到藥物、劑型、年齡、體重等患者狀態、施用途徑、疾病性質和程度等， 來確定本發明醫藥組合物的用量，其通常為：以核酸的質量計，對成人每天而言，O.lmg~ l〇g/天，優選lmg~500mg/天。根據情況，低于這些用量的劑量可能是足夠的，或者相反，也 可能需要高于這些用量的劑量。可以每天一次至數次施用，也可以間隔一天至數天施用。
[0093] 以下，通過實施例來解釋本發明。但是，本發明并不限于這些實施例。
[0094] 實施例
[0095] 實施例1雙鏈核酸的制備
[0096] 委托Sigma Aldrich公司合成了SEQ ID NO: 1~1180所示的核糖核苷酸構成的有 義鏈，SEQ ID N0:1181~2360所示的核糖核苷酸構成的反義鏈，以及它們退火獲得的雙鏈 核酸（SEQ ID Ν0:η(η = 1~1180)所示的有義鏈和SEQ ID N0:[n+1180]所示的反義鏈配 對)。
[0097] 實施例2I32GPI mRNA敲減活性的測定
[0098]在96孔培養板中以5000個細胞/80微升/孔接種人肝癌來源細胞系HepG2細胞(獲 得自ATCC，ATCC號：HB-8065)。將含有10%胎牛血清（？83)的]\^]\1培養基（由1^。 Technologies公司制造，產品目錄編號No. 11095-098)用作培養基。表1所記載的雙鏈核酸 和RNAiMax轉染試劑（由Life Technologies公司制造，產品目錄編號：1401251)在Opti-MEM 培養基（由Life Technologies公司制造，產品目錄編號：11058-021)中稀釋，將20yL每種 siRNA/RNAiMax混合物添加到96孔培養板至雙鏈核酸終濃度為100pM，混合物在37攝氏度 5%C02條件下培養24小時。之后，用roS(磷酸鹽緩沖溶液)清洗細胞，使用Cells-to-Ct試劑 盒（由Applied Biosystems公司制備，產品目錄編號:AM1728)根據隨產品所附產品說明書 中記載的方法從各個培養板合成cDNA。將5μ1的該cDNA添加到MicroAmp Optical 96孔板 (由Applied Biosystems公司制備，產品目錄編號:4326659)，然后添加10yL的TaqMan Gene Expression Master Mix(由Applied Biosystems公司制備，產品目錄編號：4369016)、3yL 的UltraPure Distilled Water(由Life Technologies 公司制造，產品目錄編號 No·: 10977-015)、lyL的人02GPI探針和lyL的人GAPDH探針。使用ABI7900HT實時PCR系統對人β 2GPI基因和人GAPDH(D-甘油醛-3-磷酸脫氫酶)進行實時PCLGAPDH是組成型表達的基因， 作為內部對照對其進行測定，對I32GPI表達水平進行歸一化。將不添加 siRNA只用轉染試劑 處理HepG2細胞時02GPI mRNA的量作為1.0,計算當引入各個siRNA時的02GPI mRNA相對表 達水平。本實驗進行3次，02GPI mRNA相對表達水平的平均值示于表1-1至1-16。






























[0130]此外，為了選擇敲減活性高的雙鏈核酸，將雙鏈核酸終濃度降低至ΙΟρΜ，計算上述 相同實驗體系中KGPI基因的相對表達量。結果如表2所示。
[0134] 委托Sigma Aldrich或者GeneDesign公司合成了SEQ ID N0:3542~3701 所示的核 糖核苷酸構成的有義鏈，SEQ ID NO:3702~3861所示的核糖核苷酸構成的反義鏈，以及它 們退火得到的雙鏈核酸(AH1181~AH1340;SEQ ID Ν0:η~（n = 3542~3701)所示的有義鏈 與SEQ ID NO: [n+160]所示反義鏈配對）（參見表3-1至3-5,在表中，大寫表示未經修飾的 RNA，小寫表示2'-0_甲基修飾的RNA)。分別地，雙鏈核酸編號AH1181~1204以SEQ ID N0: 2456中所示02GPI部分序列為靶序列，AH1205~1233以SEQ ID N0:2459中所示的02GPI部分 序列為靶序列，AH1234~1243以SEQ ID勵:2485中所示的026?1部分序列為靶序列，六!11244 ~1253以SEQIDN0:2486中所示的β2GPI部分序列為靶序列，AH1254~1263以SEQIDN0 : 3053中所示的02GPI部分序列為靶序列，AH1264~1271以SEQ ID N0:3185中所示的02GPI部 分序列為靶序列，AH1272~1282以SEQ ID觀：3239中所示的026?1部分序列為靶序列， AH1283~1297以SEQ ID N0:3303中所示的02GPI部分序列為靶序列，AH1298~1311以SEQ ID N0:3385中所示的02GPI部分序列為靶序列，AH1312~1316以SEQ ID N0:3398中所示的β 2GPI部分序列為靶序列，ΑΗ1317~1325以SEQ ID勵:3399中所示的擬6?1部分序列為靶序 列，以及AH1326~1340以SEQ ID NO :3499中所示的02GPI部分序列為靶序列。
[0135] 以與實施例2中相同的方法，計算出將這些雙鏈核酸引入HepG2細胞、經過24小時 時的KGPI mRNA相對表達水平。其結果示于表3-1至3-5。








[0145] 本申請以在日本提交的專利申請No. 2014-7305(提交日2014年1月17日）為基礎， 其內容全部并入本文。
[0146]本發明提供了具有抑制02GPI表達活性的核酸、包含該核酸作為活性成分的醫藥 組合物等。本發明的核酸和醫藥組合物抑制I32GPI的表達，可用于治療或預防APS、SLE等自 身免疫病以及血液透析中的血栓。
【主權項】
1. 一種雙鏈核酸，其降低02GPI基因的表達，所述雙鏈核酸由有義鏈和反義鏈組成，所 述雙鏈核酸包含至少11個堿基對的雙鏈區，其中，所述反義鏈中的鏈長為至少17個核苷酸 且至多30個核苷酸的寡核苷酸鏈與選自表1-1至表1-16中所述的組中的靶標I32GPI mRNA序 列互補。2. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其中所述雙鏈區為11~27個堿基對，與選自表1-1 至表1-16中所述的組中的靶標02GPI mRNA序列互補的所述反義鏈中，從5'端起算的第2個 核苷酸與該靶標KGPI mRNA序列的從3 '端起算的第2個脫氧核糖核苷酸互補。3. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈的3'端和所述反義鏈的5'端形成 平末端。4. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈為21個核苷酸長，并且所述反義鏈 為21個核苷酸長。5. 根據權利要求4所述的雙鏈核酸，其降低02GPI基因的表達，其為含有19個堿基對的 雙鏈區的經修飾雙鏈核酸，所述雙鏈區中的核苷酸中的40~65 %包含2 ' -0-甲基修飾核苷 酸。6. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其中所述反義鏈包含選自表1-1至1-16和表3-1至 3-5的"反義鏈"所記載的組。7. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其中所述有義鏈包含選自表1-1至1-16和表3-1至 3-5的"有義鏈"所記載的組。8. 根據權利要求1所述的雙鏈核酸，其包含選自由表1-1至1-16和表3-1至3-5所記載的 有義鏈/反義鏈組成的組的1對有義鏈/反義鏈的序列。9. 根據權利要求1~8中任一項所述的雙鏈核酸，其包含配體。10. -種單鏈核酸，其僅由權利要求1~9中任一項所述的雙鏈核酸中的反義鏈組成。11. 醫藥組合物，其包含權利要求1~10中任一項所述的核酸。12. -種治療抗02GPI抗體所介導疾病的方法，其包括下述步驟：向有此治療需要的人 施用治療有效量的權利要求1~10中任一項所述的核酸或者權利要求11所述的醫藥組合 物。13. 根據權利要求12所述的方法，其中，所述疾病是自身免疫病或者血栓。
【文檔編號】C12N15/09GK105980560SQ201580004877
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2015年1月16日
【發明人】山田陽史, 巖井宏徒, 桝田和宏, 神田美菜子
【申請人】協和發酵麒麟株式會社