Ctnnb1第三外顯子突變檢測引物探針及其試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針包括檢測引物探針組A、檢測引物探針組B和檢測引物探針組C；檢測引物探針組A包括檢測32密碼子GAC>CAC突變、33密碼子TCT>TGT突變、33密碼子TCT>GCT突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；檢測引物探針組B包括檢測34密碼子GGA>GAA突變、34密碼子GGA>GTA突變、35密碼子ATC>AGC突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；檢測引物探針組C包括檢測37密碼子TCT>TAT突變、37密碼子TCT>TTT突變、45密碼子TCT>CCT突變的上游引物和探針，以及通用下游引物；本發明還涉及一種采用上述引物探針的試劑盒。本發明的CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針及其試劑盒使用便捷，靈敏度高，準確率高。
【專利說明】
CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針及其試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種基因突變的檢測產品以及該產品所用到的檢測引物和檢測體系， 屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] β-Catenin是介導細胞黏附和信號傳導雙重活性的細胞質內可溶性蛋白，基因 CTNNB1位于3p22,全長23.2kb，CTNNBl基因（β連環蛋白的編碼基因）在WNT信號傳導通路的 重要的角色。CTNNB1基因編碼序列由三個轉錄本，CTNNB1基因第三外顯子發生突變，與細胞 核內的TCF/LEF蛋白結合形成蛋白復合物，這種蛋白復合物能夠與DNA結合，啟動其他與腫 瘤相關的基因（如c_myc、cyclin D1)的轉錄，導致一系列的連鎖反應，最終導致細胞分裂加 速。CTNNB1基因調控上皮細胞的生成和維持，W在腫瘤的進展中起重要作用，高表達與0S的 降低密切相關。研究發現CTNNB1基因的突變是子宮內膜癌、肝癌、髓母細胞瘤(MDB)、等腫瘤 的原因。
[0003] 美國MD Anderson癌癥中心的研究人員發現，對于患有典型的低級別早期子宮內 膜癌女性患者，CTNNB1基因外顯子3突變的預后較差，（J Natl Cancer Inst.2014,106: dju245)。臨床上早已發現，部分子宮內膜癌患者在初次手術治療后容易復發并因此死亡。 過去臨床上辨識這些患者，現在就可以通過檢測CTNNB1基因突變來篩選這些預后較差的患 者。一旦低級別、早期子宮內膜癌患者被檢測出具有CTNNB1基因突變，婦瘤科醫生可采取除 傳統子宮切除外更激進的治療策略。
[0004] 肝細胞癌(HCC)是男性五分之四最常見的癌癥和癌癥相關死亡世界第二最常見的 原因，一些研究表明β連環蛋白突變的肝癌具有關鍵作用，CTNNB1突變可以與增加谷氨酰胺 合成的水平，與腫瘤的增大存在相關性，并且在肝癌患的不同腫瘤區域發現不同突變狀態 CTNNBUCieply.B發現肝癌患者CTNNB1突變主要發生在該基因的第三外顯子內，第三外顯 子編碼的蛋白一般是磷酸化的氨基酸序列，發生CTNNB1基因的第三外顯子突變患者的β連 環蛋白的表達水平表達較高。（B.Cieply,Hepatology ,49(2009)，ρρ· 821-831)
[0005] 髓母細胞瘤是惡性小兒腦腫瘤的最常見的類型，Wnt信號通路在這個類型的腫瘤 被激活，Si 1 va Rd對髓母細胞瘤病例進行了分析β連環蛋白基因（CTNNB1)的突變分析，結果 發現六分之一的患者CTNNB1基因第三外顯子發生了突變，這些突變改變糖原合酶激酶3β磷 酸化位點，隨后在細胞核積累，促纖維增生和結節神經管細胞瘤的變體（Clinics(Sao Paulo).2013;68(2):167-72)。
[0006] 目前CTNNB1基因突變檢測主要是測序法，對于臨床工作者來說耗時、易污染、程序 繁瑣。
【發明內容】
[0007] 本發明公開了一種檢測快速方便，靈敏度高，準確率高的CTNNB1第三外顯子突變 檢測試劑盒，以及其檢測引物探針。
[0008] 本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是:一種CTNNB1第三外顯子突變 檢測引物探針，包括檢測引物探針組A、檢測引物探針組B和檢測引物探針組C;
[0009] 所述檢測引物探針組A包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突 變的上游引物a和探針a，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引 物b和探針b，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c， 以及通用下游引物；
[0010] 所述檢測引物探針組B包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突 變的上游引物d和探針d，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引 物e和探針e，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f， 以及通用下游引物；
[0011] 所述檢測引物探針組C包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突 變的上游引物g和探針g，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引 物h和探針h，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCT>CCT突變的上游引物i和探針i， 以及通用下游引物；
[0012] 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探針b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0013] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述所述探針d、 探針e和探針f的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述探針g、探針h和探針i的5'端設有 相互區別的報告熒光基團；所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和 探針i的3 '端設有淬滅熒光基團。
[0014] 各上游引物在PCR反應中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應中的終濃度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反應中的終濃度是0.27μΜ/1。
[0015] 上述相互區別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。
[0016] 本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是:一種采用上述的引物探針的 CTNNB1第三外顯子突變檢測產品。
[0017] 本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是:一種CTNNB1第三外顯子突變 檢測試劑盒，包括突變檢測液A、突變檢測液B和突變檢測液C;
[0018] 所述突變檢測液A中包括檢測引物探針組A，所述突變檢測液B中包括檢測引物探 針組B，所述突變檢測液C中包括檢測引物探針組C;
[0019] 所述檢測引物探針組A包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突 變的上游引物a和探針a，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引 物b和探針b，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c， 以及通用下游引物；
[0020] 所述檢測引物探針組B包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突 變的上游引物d和探針d，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引 物e和探針e，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f， 以及通用下游引物；
[0021] 所述檢測引物探針組C包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突 變的上游引物g和探針g，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引 物h和探針h，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCT>CCT突變的上游引物i和探針i， 以及通用下游引物；
[0022]所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示;所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述探針b的核苷酸序列 如SEQ ID No. 16所示;所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷 酸序列如SEQ ID No. 17所示;所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d 的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示;所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所 述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示;所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6 所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No.20所示；所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No.21所示;所述上游引物h的核苷酸序列 如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No.22所示;所述上游引物i的核苷 酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No.23所示;所述通用下游 引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示。
[0023] 所述探針a、探針b和探針c的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述所述探針d、 探針e和探針f的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述探針g、探針h和探針i的5'端設有 相互區別的報告熒光基團；所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和 探針i的3 '端設有淬滅熒光基團。
[0024] 各上游引物在PCR反應中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應中的終濃度是 0.16μΜ/1，所述通用下游引物在PCR反應中的終濃度是0.27μΜ/1。
[0025] 上述相互區別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或 Cy3,第三種是Cy5或R0X;所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。
[0026] 各突變檢測液中還包括內標引物探針混合液、10 XPCR緩沖液、dNTPs混合液和滅 菌超純水;所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2;所述dNTPs試 劑包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP;
[0027]所述內標引物探針混合液包括內標基因上游引物、內標基因下游引物和內標基因 探針；
[0028] 所述內標基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述內標基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述內標基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.24所 不。
[0029] 上述CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒還包括質控檢測試劑、熱啟動taq酶、陽性 對照液和陰性對照液；
[0030] 所述質控檢測試劑包括質控基因上游引物、質控基因下游引物和質控基因探針；
[0031] 所述質控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示，所述質控基因下游引 物的核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述質控基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.25所 不。
[0032]上述CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒反應時，反應體系中包括十倍濃度的PCR 緩沖液1體積，2.5mM的dNTPs混合液1體積，0.5υ/μ1的熱啟動taq酶1體積，檢測引物探針組1 體積，內標引物探針混合液1體積，滅菌超純水4體積，DNA模板1體積;所述DNA模板的使用濃 度為 10~50ng/yl。
[0033]本發明具有積極的效果:本發明的CTNNB1基因第三外顯子突變檢測產品是一個便 利而直接的工具，利用擴增阻礙突變系統(Amplification Refractory Mutation System， ARMS)衍生的系列技術，采用三組三重PCR反應檢測CTNNB1基因9個突變熱點。具有高通量、 低成本的特點，可用于組織、血樣中微量突變檢測，操作簡便快捷，靈敏度高，適合大規模的 臨床應用。CTNNB1基因突變與人腫瘤的發生有重要意義，對于CTNNB1突變的檢測可準確預 測對應靶向藥物治療的有效性，便于臨床用藥的選擇，顯著性提高治療效果，是患者最大程 度收益，同時還可以避免不合理地用藥造成病人醫藥費復旦及社會醫療資源浪費，減少不 必要的實效損失以及經濟損失。
【附圖說明】
[0034]圖1是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的32密碼子GAOCAC的擴增曲線；
[0035]圖2是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的33密碼子TCT>TGT的擴增曲線；
[0036]圖3是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的33密碼子TCT>GCT的擴增曲線；
[0037]圖4是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的34密碼子GGA>GAA的擴增曲線；
[0038] 圖5是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的34密碼子GGA>GTA的擴增曲線；
[0039] 圖6是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的35密碼子ATOAGC的擴增曲線；
[0040] 圖7是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的37密碼子TCT>TTT的擴增曲線；
[00411圖8是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的37密碼子TCT>TAT的擴增曲線；
[0042]圖9是采用實施例1的試劑盒檢測樣本1的45密碼子TCT>CCT的擴增曲線。
【具體實施方式】
[0043]下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可 以根據上述本
【發明內容】
對本發明作出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實 驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或 均等的方法及材料皆可應用于本發明中。
[0044] 實施例1
[0045] -、試劑盒的組成。
[0046] 本實施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒是針對CTNNB1第三外顯子如表1所 示的9種突變類型設計的。
[0047] 表1CTNNB1第三外顯子檢測位點
[0049] 其中，CTNNB1的第33密碼子、第34密碼子、第37密碼子均有兩種突變情況。
[0050]本實施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒包括:檢測引物探針組A、檢測引物 探針組B、檢測引物探針組C、10XPCR緩沖液、dNTPs混合液、質控檢測試劑、內標引物探針混 合液、陽性對照樣品、陰性對照樣品、熱啟動taq酶和滅菌超純水。其中，各檢測引物探針組 分別與內標引物探針混合液、10 X PCR緩沖液、dNTPs混合液和滅菌超純水分裝在一起，成為 對應的突變檢測試劑。
[0051]各試劑的成分如表2所示。
[0052]表2試劑盒的組成
[0054] 各個試劑原料的來源如表3所示。
[0055] 表3試劑原料來源
[0057] 上述表中試劑盒說明如下：
[0058]將引物濃度做倍比連續稀釋，驗證的引物(除通用下游引物)最佳使用濃度是1.9μ Μ/1，在反應體系中的最終濃度是0.19μΜ/1;通用下游引物最佳使用濃度是2.7μΜ/1，在反應 體系中的最終濃度是〇.27μΜ/1;探針倍比連續稀釋，驗證的探針最佳濃度是1.6μΜ/1，在反 應體系中的最終濃度是〇. 16μΜ/1。
[0059] 突變檢測試劑Α中包括檢測32密碼子GAOCAC突變的特異性上游引物a和探針a、檢 測33密碼子TCT>TGT突變的特異性上游引物b和探針b、檢測33密碼子TCT>GCT突變的特異性 上游引物c和探針c、通用下游引物、內標基因引物對、內標基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0060] 突變檢測試劑B中包括檢測34密碼子GGA>GAA突變的特異性上游引物d和探針d、檢 測34密碼子GGA>GTA突變的特異性上游引物e和探針e、檢測35密碼子ATOAGC突變的特異性 上游引物f和探針f、通用下游引物、內標基因引物對、內標基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0061 ]突變檢測試劑C中包括檢測37密碼子TCT>TAT突變的特異性上游引物g和探針g、檢 測37密碼子TCT>TTT突變的特異性上游引物h和探針h、檢測45密碼子TCT>CCT突變的特異性 上游引物i和探針i、通用下游引物、內標基因引物對、內標基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混 合液和滅菌超純水。
[0062] 10XPCR緩沖液包括 100mM的Tris-HCl、500mM的KC1 和 15mM的MgCl2,用于配置PCR 緩沖液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8.3。(1階？8混合液包括(^了？、(^?、(1(^和(11^，在反應 體系中終濃度各為0.25mM。
[0063] 熱啟動taq酶由Takara公司提供的Hot Start taq酶稀釋而成，稀釋后的濃度為 0 · 5UAU。10 X PCR緩沖液、熱啟動taq酶和dNTPs均來自Takara(貨號:R007A)。
[0064]質控檢測試劑包括檢測CTNNB1第三外顯子保守序列的質控基因引物、質控基因探 針、內標基因引物、內標基因探針、10 X緩沖液、dNTPs混合液、滅菌超純水。質控基因引物使 用濃度為〇. 19μΜ/1;質控基因探針使用濃度為0.16μΜ/1，內標基因引物使用濃度為0.19μΜ/ 1，內標基因探針使用濃度為0.16μΜ/1。
[0065] 體積為10μ1的突變檢測反應體系包括ΙμL的10 X緩沖液、ΙμL的熱啟動taq酶 (0.5υ/μ1)、ΙμL的dNTPs混合液(2.5mM)、ΙμL的檢測引物探針混合液、ΙμL的內標引物探針混 合液、4μ1的滅菌超純水、ΙμL的DNA模板。
[0066] 體積為10μ1的質控檢測反應體系包括ΙμL的10 X緩沖液、ΙμL的熱啟動taq酶 (0.5UAU)、ΙμL的dNTPs反應液(2.5mM)、ΙμL的質控引物探針混合液、ΙμL內標引物探針混合 液、4μ1的滅菌超純水、ΙμL的DNA模板。10 X緩沖液、dNTPs混合液、質控引物探針混合液、內 標引物探針混合液和滅菌超純水分裝在一起成為質控檢測試劑。
[0067]陽性對照樣品是分別存在以上CTNNB1基因第三外顯子9種突變類型、內標基因、質 控基因的重組基因組質粒載體，質粒載體的空載體為PMD19-T載體。突變型質粒的獲取常規 構建步驟:用上述的特異性引物與通用下游引物配對，擴增含相應突變點樣本的目的片段 產物，構建入pMD 19-T載體;質控和內標基因質粒用上述的質控和內標引物擴增出所需目的 片段，將目的片段克隆到PMD19-T載體中。克隆的載體寄給上海邁浦生物科技有限公司，由 該公司提供重組質粒載體。
[0068] 陰性對照相應含有CTNNB1基因9個突變位點野生型目的片段序列的重組質粒載體 稀釋而成，稀釋液是滅菌超純水。
[0069] 各探針和引物序列均由上海百力格生物技術有限公司合成，引物和探針均用滅菌 超純水溶解，并稀釋成工作液。各探針和引物的特征如表4所示。
[0070] 表4探針引物特征表
[0073]針對各突變檢測位點的特異性上游引物序列如SEQ NO. 1~SEQ N0.9所示。特異性 ARMS上游引物分別在3'末端堿基與待檢測突變型的突變堿基匹配，同時在其3'末端倒數第 2~3位增加一個或者兩個堿基錯配，增加突變檢測的特異性。
[0074] 通用下游引物序列如SEQ N0.10所示，通用下游引物可用于所有突變檢測的下游 引物。
[0075] 特異性探針TaqMan探針序列如SEQN0.15~SEQN0.23所示，為避免假陽性，特異 性探針3'末端堿基與待檢測突變型的突變堿基互補，而且特異性探針與特異性引物相互重 疊，且重疊堿基長度為3~5bp，且為了減少反應管數，節約樣本。同一管檢測試劑中的三個 探針的5 '端分別標記了 FAM、HEX、R0X不同的熒光報告基團，3 '端則都標記了 BHQ1熒光淬滅 基團；
[0076]內標基因上游引物序列如SEQ N0.11所示，內標基因下游引物序列如SEQ N0.12所 不，內標基因探針序列如SEQ N0.24所不。內標基因探針的5端標記了VIC9?光報告基團，內 標基因探針的3 '端標記了 BHQ1熒光淬滅基團。內標基因是區別于CTNNB1的看家基因 ACTB， 通過檢測內標基因的擴增(VIC通道），可分析待測DNA是否被正常擴增，從而排除漏加試劑 或者樣本含有PCR抑制劑等原因造成的PCR檢測失敗。
[0077]質控基因是CTNNB1基因，質控基因上游引物序列如SEQ N0.13所示，質控基因下游 引物序列如SEQ N0.14所示，質控基因探針序列如SEQ N0.25所示。質控基因探針的5'端標 記了FAM熒光報告基團，質控基因探針的3'端則標記了BHQ1熒光淬滅基團。質控基因的引物 設計是排除CTNNB1基因第三外顯子的序列的CTNNB1基因其他位置保守區域，質控引物探針 不享受突變檢測位點引物和引物結合位點，在保守區域不同區段設計三條探針，分別標記 不同的熒光信號，質控序列擴增可校正諸如DNA含量、標本內PCR聚合酶抑制物，不同反應管 間擴增效率的差異，通過比較突變檢測試劑和質控檢測試劑的擴增情況確定樣本是否發生 突變。
[0078]二、試劑盒的使用方法。
[0079]本實施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒的具體檢測步驟如下：
[0080] 1、樣本DNA提取：
[0081 ]米用試劑盒(Axygen Multisource Genomic DNA Miniprep Kit)提取腫瘤樣本的 DNA作為樣本DNA，具體的操作參見試劑盒產品說明書。
[0082] 2、樣本DNA質量檢測：
[0083] 獲得樣本DNA后，通過Thermo-Fisher核酸蛋白定量儀(NanoDrop 2000)測定濃度 和純度，控制樣本質量，最終加入反應體系中的樣本。0D260/0D280的比值在1.8~2.0之間 的可獲得最優反應結果，濃度稀釋為10~50ngAU。
[0084] 3、PCR 反應：
[0085] 采用本實施例的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒進行檢測，以樣本反應體系的 體積為1〇μ1，試劑盒各組分的使用濃度及在反應體系中的終濃度詳見表3(反應體系的體積 還可以是20μ1，在配制時將10μ1反應體系中的組分翻倍即可）。
[0086] 1)配制10μ 1的質控PCR反應體系和10μ 1的檢測PCR反應體系：
[0087] 取8μ1的質控檢測試劑和ΙμL熱啟動taq酶稀釋液于PCR管中，加入DNA模板lyl(DNA 模板的使用濃度為1 〇~50ng/y 1)。
[0088] 分別取8μ1的突變檢測試劑A或B或C和ΙμL的熱啟動taq酶稀釋液于PCR管中，加入 DNA模板1 μ 1 (DNA模板的使用濃度為10~50ngAi 1)。
[0089]反應體系中的DNA模板分別指對應的樣本DNA，陽性對照，陰性對照。
[0090] 2)PCR反應程序。
[0091]各反應體系在安捷倫實時熒光定量PCR擴增儀(MxPro)上進行實時熒光PCR反應， 最優反應程序如表5所示。
[0092] 表5 PCR反應程序
[0094] 4、PCR結果判定。
[0095] 1)試劑盒有效性的判定。
[0096]陽性對照有效：陽性對照FAM、HEX、R0X信號通道所有的擴增曲線有明顯的指數增 長期，且Ct陽性<30。
[0097]陰性對照有效：陰性對照FAM、HEX、R0X信號通道所有的擴增曲線無明顯的指數增 長期，或Ct陰性多38。
[0098]內標基因有效:除陰性對照外，所有的反應孔VIC信號通道均有擴增曲線，且擴增 曲線有明顯的指數增長期，CT值<22。
[0099] 2)檢測樣本有效性的判定。
[0100] 根據質控FAM通道的CT值進行判定：
[0101] 若Ct質控<20,則樣本基因組加入過量，建議稀釋后重新檢測；
[0102]若20<Ct質控<26,樣本加入量適中，適合進行結果判定；
[0103]若Ct質控>26,則樣本基因組加入量低，不能穩定的進行突變結果判定。
[0104] 3)突變結果的判定。
[0105] 通過以上步驟，確定檢測樣本、陽性對照、陰性對照和內標基因檢測均有效的前提 下，再對樣本的結果進行判定。樣本判斷結果如表6所示
[0106] 表6突變情況判斷表
[0108]根據公式Act值=ct(樣板(姐)-(^(廚飯)姐)，計算有效檢測樣本的Act值。按照以下 步驟對樣本檢測結果進行判讀，確定樣本是否存在突變。
[0109] A·陰性情況
[0110] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本32密碼子GAOCAC位點為陰性(野生型）；若CtCAC> CAC(FAM通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且彡32，但是ACt > 8.6，則該樣本32密碼子GAOCAC位點也為 陰性(野生型）。
[0111] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本33密碼子TCT>TGT位點為陰性(野生型）；若CtTCT> TGT(HEX通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本33密碼子TCT>TGT位點也為 陰性(野生型）。
[0112] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本33密碼子TCT>GCT位點為陰性(野生型）；若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且彡32，但是ACt > 10，則該樣本33密碼子TCT>GCT位點也為 陰性(野生型）。
[0113] 4)若CtGGA>GM(FAM通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本34密碼子GGA>GAA位點為陰性(野生型）；若CtCCA>CAA(FAM通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且<32,但是ACt>9,則該樣本34密碼子GGA>GAA位點也為陰 性(野生型）。
[0114] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本34密碼子GGA>GTA位點為陰性(野生型）；若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是ACt>9,則該樣本34密碼子GGA>GTA位點也為陰 性(野生型）。
[0115] 6)若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32，則判定該樣本35密碼子ATOAGC位點為陰性(野生型）；若CtATC>AGC(ROX通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且彡32，但是ACt > 8.6，則該樣本35密碼子ATOAGC位點也為 陰性(野生型）。
[0116] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本37密碼子TCT>TTT位點為陰性(野生型）；若CtTCT>TTT(FAM通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本37密碼子TCT>TTT位點也為 陰性(野生型）。
[0117] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本37密碼子TCT>TAT位點為陰性(野生型）；若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且<32，但是ACt > 10，則該樣本37密碼子TCT>TAT位點也為 陰性(野生型）。
[0118] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴增曲線無明顯的指數增長期(無 Ct值)或者Ct> 32,則判定該樣本45密碼子TCT>CCT位點為陰性(野生型）；若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴 增曲線有明顯的指數增長期，且<32，但是ACt >9，則該樣本45密碼子TCTXXT位點也為陰 性(野生型）。
[0119] B.陽性情況
[0120] 1)若CtGAC>CAC(FAM通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，則該樣本32密碼子GAOCAC位點為陽性(突變型）。
[0121] 2)若CtTCT>TGT(HEX通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct彡10,則該樣本33密碼子TCT>TGT位點為陽性(突變型）。
[0122] 3)若CtTCT>GCT(R0X通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct< 10，則該樣本33密碼子TCT>GCT位點為陽性(突變型）。
[0123] 4)若CtGGA>GAA(FAM通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct<9，則該樣本34密碼子GGA>GAA位點為陽性(突變型）。
[0124] 5)若CtGGA>GTA(HEX通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct彡9，則該樣本34密碼子GGA>GTA位點為陽性(突變型）。
[0125] 6);若CtATC>AGC(R0X通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct彡8.6，則該樣本35密碼子ATOAGC位點為陽性(突變型）。
[0126] 7)若CtTCT>m(FAM通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct< 10，則該樣本37密碼子TCT>TTT位點為陽性(突變型）。
[0127] 8)若CtTCT>TAT(HEX通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct彡10,則該樣本37密碼子TCT>TAT位點為陽性(突變型）。
[0128] 9)若CtTCT>CCT(R0X通道)所指向的擴增曲線有明顯的指數增長期，且彡32,但是Λ Ct<9,則該樣本45密碼子TCT>CCT位點為陽性(突變型）。
[0129] 三、試劑盒的特性。
[0130] 特異性和靈敏度:檢測分別含10%、5%、1%的CTNNB1基因9個突變位點的突變基 因組DNA(突變百分比=突變型/野生型X 100%)，敏感度達到1 %，與臨床檢測突變"金標 準"Sanger測序法的結果符合率彡96.2%，批內CV和批間CV均小于3%。
[0131] 四、應用示例
[0132] 構建含有CTNNB1第三外顯子32密碼子GAC>CAC突變、33密碼子TCT>TGT突變、34密 碼子GGA>GAA突變、35密碼子ATOAGC突變、37密碼子TCT>TAT突變、45密碼子TCTXXT突變6 種突變類型的重組基因組質粒載體作為樣本1。采用本實施例的CTNNB1第三外顯子突變檢 測試劑盒對樣本1進行檢測，擴增結果如圖1至9所示。可見，32密碼子GAOCAC突變、33密碼 子TCT>TGT突變、34密碼子GGA>GAA突變、35密碼子ATOAGC突變、37密碼子TCT>TAT突變、45 密碼子TCTXXT突變的檢測結果為陽性，33密碼子TCT>GCT、34密碼子34密碼子、37密碼子 TCT>TTT檢測結果為陰性。證明了試劑盒的有效性。
[0133] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的 實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其 它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而這些屬于本發 明的精神所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之中。
【主權項】
1. 一種CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針，其特征在于：包括檢測引物探針組A、檢 測引物探針組B和檢測引物探針組C; 所述檢測引物探針組A包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突變的 上游引物a和探針a，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引物b和 探針b，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c，以及 通用下游引物； 所述檢測引物探針組B包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突變的 上游引物d和探針d，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引物e和 探針e，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f，以及 通用下游引物； 所述檢測引物探針組C包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突變的 上游引物g和探針g，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引物h和 探針h，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCTXXT突變的上游引物i和探針i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探針a、探針b和探針c的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述所述探針d、探針 e和探針f的5'端設有相互區別的報告熒光基團;所述探針g、探針h和探針i的5'端設有相互 區別的報告焚光基團;所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和探針i 的3'端設有淬滅熒光基團。2. 根據權利要求1所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針，其特征在于:各上游引 物在PCR反應中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應中的終濃度是0.16μΜ/1，所述通用 下游引物在PCR反應中的終濃度是0.27μΜ/1。3. 根據權利要求1所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測引物探針，其特征在于:所述相互 區別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或 ROX;所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。4. 一種采用如權利要求1所述的引物探針的CTNNB1第三外顯子突變檢測產品。5. -種CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在于：包括突變檢測液A、突變檢測 液B和突變檢測液C; 所述突變檢測液A中包括檢測引物探針組A，所述突變檢測液B中包括檢測引物探針組 B，所述突變檢測液C中包括檢測引物探針組C; 所述檢測引物探針組A包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子32密碼子GAOCAC突變的 上游引物a和探針a，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>TGT突變的上游引物b和 探針b，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子33密碼子TCT>GCT突變的上游引物c和探針c，以及 通用下游引物； 所述檢測引物探針組B包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GAA突變的 上游引物d和探針d，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子34密碼子GGA>GTA突變的上游引物e和 探針e，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子35密碼子ATOAGC突變的上游引物f和探針f，以及 通用下游引物； 所述檢測引物探針組C包括用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TAT突變的 上游引物g和探針g，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子37密碼子TCT>TTT突變的上游引物h和 探針h，用于檢測CTNNB1基因第三外顯子45密碼子TCTXXT突變的上游引物i和探針i，以及 通用下游引物； 所述上游引物a的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，所述探針a的核苷酸序列如SEQ ID No. 15所示； 所述上游引物b的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述探針b的核苷酸序列如SEQ ID No. 16所示； 所述上游引物c的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述探針c的核苷酸序列如SEQ ID No. 17所示； 所述上游引物d的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述探針d的核苷酸序列如SEQ ID No. 18所示； 所述上游引物e的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述探針e的核苷酸序列如SEQ ID No. 19所示； 所述上游引物f的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述探針f的核苷酸序列如SEQ ID No. 20所示； 所述上游引物g的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述探針g的核苷酸序列如SEQ ID No. 21所示； 所述上游引物h的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述探針h的核苷酸序列如SEQ ID No. 22所示； 所述上游引物i的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述探針i的核苷酸序列如SEQ ID No. 23所示； 所述通用下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 10所示； 所述探針a、探針b和探針c的5'端設有相互區別的報告熒光基團；所述所述探針d、探針 e和探針f的5'端設有相互區別的報告熒光基團;所述探針g、探針h和探針i的5'端設有相互 區別的報告焚光基團;所述探針a、探針b、探針c、探針d、探針e、探針f、探針g、探針h和探針i 的3'端設有淬滅熒光基團。6. 根據權利要求5所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在于:各上游引物 在PCR反應中的終濃度是0.19μΜ/1，各探針在PCR反應中的終濃度是0.16 μΜ/l，所述通用下 游引物在PCR反應中的終濃度是0.27μΜ/1。7. 根據權利要求5所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在于:所述相互區 別的報告熒光基團有三種，第一種是FAM，第二種是HEX、VIC、TET或Cy3,第三種是Cy5或 R0X;所述淬滅熒光基團是BHQ1或MGB。8. 根據權利要求4至7中任一項所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在 于:各突變檢測液中還包括內標引物探針混合液、10 X PCR緩沖液、dNTPs混合液和滅菌超純 水;所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl 2;所述dNTPs試劑包括 dATP、dGTP、dCTP和dTTP; 所述內標引物探針混合液包括內標基因上游引物、內標基因下游引物和內標基因探 針； 所述內標基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 11所示，所述內標基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 12所示，所述內標基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.24所示。9. 根據權利要求4至7中任一項所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在 于:還包括質控檢測試劑、熱啟動taq酶、陽性對照液和陰性對照液； 所述質控檢測試劑包括質控基因上游引物、質控基因下游引物和質控基因探針； 所述質控基因上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 13所示，所述質控基因下游引物的 核苷酸序列如SEQ ID No. 14所示，所述質控基因探針的核苷酸序列如SEQ ID No.25所示。10. 根據權利要求9所述的CTNNB1第三外顯子突變檢測試劑盒，其特征在于:反應時，反 應體系中包括十倍濃度的PCR緩沖液1體積，2.5mM的dNTPs混合液1體積，0.5UAU的熱啟動 taq酶1體積，檢測引物探針組1體積，內標引物探針混合液1體積，滅菌超純水4體積，DNA模 板1體積;所述DNA模板的使用濃度為10~50ng/y 1。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969908SQ201610608948
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月29日
【發明人】趙新泰, 王明
【申請人】上海賽安生物醫藥科技有限公司