Ms4a6a作為多發性骨髓瘤診治標志物的用圖
【專利摘要】本發明公開了一種基因標記物，該基因標記物是MS4A6A。MS4A6A可用于判斷受試者是否具有患多發性骨髓瘤的風險或者判斷受試者是否患有多發性骨髓瘤。另外，MS4A6A還可以用于制備治療多發性骨髓瘤的藥物。本發明為臨床在分子水平上診斷多發性骨髓瘤提供了新的診斷方法，同時為多發性骨髓瘤的基因治療提供了新的藥物靶點。
【專利說明】
MS4A6A作為多發性骨髓瘤診治標志物的用途
技術領域
[0001] 本發明涉及腫瘤診斷、治療、預測預后領域，更具體地，本發明涉及以檢測MS4A6A 異常為手段的腫瘤診斷、預測預后方法;及激活MS4A6A基因或蛋白質的腫瘤治療劑。
【背景技術】
[0002] 多發性骨髓瘤(multiple myeloma)是血液系統的一種較常見的惡性腫瘤，它是由 于機體的漿細胞異常克隆性增生的疾病，起源于B淋巴細胞，患者的骨髓內有漿細胞(或稱 為骨髓瘤細胞）的異常性的克隆增殖。由于異常漿細胞浸潤骨骼，骨髓和全身多個器官組 織，引起病理性的骨骼破壞，患者的血清中出現異常的單克隆免疫球蛋白，從而抑制了機體 的正常的多克隆免疫球蛋白，患者的尿內出現Μ蛋白，患者最后表現出導致貧血、腎功能損 害及病理性骨折等。在我國，ΜΜ的年發病率為1/10萬，而在西方國家年發病率為4/10萬，其 平均生存期為3年，占造血系統腫瘤死亡率的20%左右。現代細胞遺傳學和分子生物學的研 究發現多發性骨髓瘤患者的體內的信號傳導通路發生了異常，當機體細胞的遺傳基因發生 改變，以及細胞因子的異常分泌，同時患者骨髓微環境發生改變及和細胞之間的相互作用 發生了異常，都參與了該病的發生及其發展，但我們對多發性骨髓瘤的確切發病機制仍未 完全明了。近年來，雖然有沙利度胺以及蛋白酶抑制劑的臨床應用，以及異基因的骨髓移植 技術，但ΜΜ的治療并沒有得到明顯的改進，患者的預后亦沒有明顯的改善。Wolffe認為從遺 傳學和表達遺傳學（6口186]161：；[08)的研究中發現，由于有些癌基因，包括原癌基因、抑癌基 因的分子發生了變化，它對腫瘤的發生起著重要的作用。他認為:表達遺傳學的定義就是： 由于非基因序列的改變，導致了基因表達水平的變化。這種變化不影響DNA序列的變化，但 最后卻導致了基因的異常，隨著遺傳學、分子生物學以及基因學的發展，發現一些與腫瘤增 殖與凋亡相關的基因對于我們了解多發性骨髓瘤的發病機制，分子特點以及診斷和治療發 揮了極大的作用。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的之一在于提供一種通過檢測MS4A6A基因或蛋白表達差異來診斷多 發性骨髓瘤的方法。
[0004] 本發明的目的之二在于提供一種通過檢測MS4A6A基因或蛋白表達差異來預測多 發性骨髓瘤預后的方法。
[0005] 本發明的目的之三在于提供一種通過激活MS4A6A基因或MS4A6A蛋白來治療多發 性骨髓瘤的方法。
[0006] 本發明的目的之四在于提供一種用于篩選治療多發性骨髓瘤的藥物的方法。
[0007] 本發明的目的之五在于提供一種用于治療多發性骨髓瘤的藥物。
[0008] 為了實現上述目的，本發明采用了如下技術方案：
[0009] 本發明提供了檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品在制備多發性骨髓瘤診斷工 具中的用途。
[0010]本發明還提供了檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品在制備預測多發性骨髓瘤 預后工具中的用途。
[0011] 進一步，所述檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品包括檢測MS4A6A基因或MS4A6A 蛋白的表達水平的產品。所述產品包括能夠結合MS4A6A基因的核酸或者能夠結合MS4A6A蛋 白的物質（例如抗體）。所述核酸能夠檢測M S 4 A 6 A基因的表達水平；所述物質能夠檢測 MS4A6A蛋白的表達水平。
[0012] 本發明的檢測MS4A6A基因的產品可基于使用核酸分子的已知方法來發揮其功能： 如PCR、如Southern雜交、Northern雜交、點雜交、焚光原位雜交(FISH)、DNA微陣列、AS0法、 高通量測序平臺等。使用該產品可以定性地、定量地、或半定量地實施分析。
[0013] 包含在上述產品中的核酸可以通過化學合成來獲得，或通過從生物材料制備含有 期望核酸的基因，然后使用設計用于擴增期望核酸的引物擴增它來獲得。
[0014] 進一步，所述PCR方法為已知方法，例如，ARMS (Ampl if i cat ion Refractory Mutation System，擴增不應突變系統)法、RT-PCR(逆轉錄酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。擴增 的核酸可以通過使用點印跡雜交法、表面等離子共振法(SPR法）、PCR-RFLP法、原位RT-PCR 法、PCR-SS0 (序列特異性寡核苷酸）法、PCR-SSP法、AMPFLP (可擴增片段長度多態性）法、 MVR-PCR法、和PCR-SSCP (單鏈構象多態性)法來檢測。
[0015]上面所述的核酸包括擴增MS4A6A基因的引物，產品中包括的引物可以通過通過化 學合成來制備，通過使用本領域技術人員知道的方法參考已知信息來適當地設計，并通過 化學合成來制備。
[0016] 在本發明的具體實施方案中，所述核酸為QPCR實驗中使用的擴增引物，所述引物 的序列如SEQ ID N0.1 (正向序列）和SEQ ID N0.2(反向序列）所示。
[0017] 上面所述的核酸還可包括探針，所述探針可以通過化學合成來制備，通過使用本 領域技術人員知道的方法參考已知信息來恰當設計，并通過化學合成來制備，或者可以通 過從生物材料制備含有期望核酸序列的基因，并使用設計用于擴增期望核酸序列的引物擴 增它來制備。
[0018] 本發明的檢測MS4A6A蛋白的產品可基于使用抗體的已知方法來發揮其功能：例 如，可以包括ELI SA、放射免疫測定法、免疫組織化學法、Wes tern印跡等。
[0019] 本發明的檢測MS4A6A蛋白的產品包括特異性結合MS4A6A蛋白的抗體或其片段。可 以使用任何結構、尺寸、免疫球蛋白類別、起源等的抗體或其片段，只要它結合靶蛋白質即 可。本發明的檢測產品中包括的抗體或其片段可以是單克隆的或多克隆的。抗體片段指保 留抗體對抗原的結合活性的抗體一部分(部分片段)或含有抗體一部分的肽。抗體片段可以 包括F(at/ )2、Fat/、Fab、單鏈Fv(scFv)、二硫化物鍵合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V區 (雙抗體）、或含有CDR的肽。本發明的檢測MS4A6A蛋白的產品可以包括編碼抗體或編碼抗體 片段的氨基酸序列的分離的核酸，包含該核酸的載體，和攜帶該載體的細胞。
[0020] 抗體可以通過本領域技術人員公知的方法來獲得。例如，制備保留整個或部分靶 蛋白質的多肽或整合編碼它們的多核苷酸的哺乳動物細胞表達載體作為抗原。使用抗原免 疫動物后，從經過免疫的動物獲得免疫細胞并融合骨髓瘤細胞以獲得雜交瘤。然后從雜交 瘤培養物收集抗體。最后可以通過使用被用作抗原的MS4A6A蛋白或其部分對獲得的抗體實 施抗原特異性純化來獲得針對MS4A6A蛋白的單克隆抗體。可以如下制備多克隆抗體：用與 上文相同的抗原免疫動物，從經過免疫的動物收集血液樣品，從血液中分離出血清，然后使 用上述抗原對血清實施抗原特異性純化。可以通過用酶處理獲得的抗體或通過使用獲得的 抗體的序列信息來獲得抗體片段。
[0021] 標記物與抗體或其片段的結合可以通過本領域普遍知道的方法來實施。例如，可 以如下熒光標記蛋白質或肽：用磷酸鹽緩沖液清洗蛋白質或肽，添加用DMS0、緩沖劑、等準 備的染料，然后混合溶液，再于室溫放置10分鐘。另外，標記可使用商品化的標記試劑盒，諸 如生物素標記試劑盒，如生物素標記試劑盒-NH2、生物素標記試劑盒-SH (DojindoLaboratories);堿性磷酸酶標記試劑盒諸如堿性磷酸酶標記試劑盒-NH2、堿性磷 酸酶標記試劑盒-SH(Dojindo Laboratories);過氧化物酶標記試劑盒諸如過氧化物酶標 記試劑盒-NH2、過氧化物酶標記試劑盒-NH2(Dojindo Laboratories);藻膽蛋白標記試劑 盒諸如藻膽蛋白標記試劑盒-NH2、藻膽蛋白標記試劑盒-SH、B-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2， B-藻紅蛋白標記試劑盒-SH、R-藻紅蛋白標記試劑盒-NH2、R-藻紅蛋白標記試劑盒SH (DojindoLaboratories);焚光標記試劑盒諸如焚光素標記試劑盒-NH2、HiLyte Fluor(TM) 555標記試劑盒_NH2、HiLyte Fluor(TM)647標記試劑盒_NH2(Dojindo Laboratories);及 DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗體 標記試劑盒、Qdot(TM)抗體標記試劑盒（Invitrogen Corporation)和EZ-標記物蛋白質標 記試劑盒(Funakoshi Corporation)。為了正確標記，可以使用適宜的儀器來檢測經過標記 的抗體或其片段。
[0022] 作為依照本發明的檢測產品的樣品，可以使用例如自活檢受試者獲得的組織樣品 或流體。樣品不受特別限制，只要它適于本發明的測定;例如，它可以包括組織、血液、血漿、 血清、淋巴液、尿液、漿膜腔液、脊髓液、滑液、房水、淚液、唾液、或其級分或經過處理的材 料。
[0023] 在本發明的具體實施方案中，所述樣品來自受試者的組織。
[0024]在本發明中，"預后"是指腫瘤患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的過 程或結果。在本說明書中，預后可以是通過手術處理抑制或緩解腫瘤生長后1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、15、20年或更久時的生機狀態。預后可以通過檢查生物標志物即MS4A6A蛋白或編 碼MS4A6A蛋白的基因來預測。預后預測可以這樣進行:根據生物標志物的有或無，或者升高 或降低，確定患者的預后是良好還是不良，或者確定良好預后或不良預后的概率。
[0025] 在本發明中，"預后良好"是指在通過手術處理等為患者抑制或緩解腫瘤生長之 后，患者長時期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更長)沒有危急狀況。或者，預后好可以意 指在這樣長時間內存活、無轉移、無復發、或無再發。例如，預后良好可以意指至少3年或尤 其是至少5年存活，優選沒有轉移或復發。預后良好最優選的狀態是長期無疾病的存活。如 本文中所使用的，"預后良好"還可以包括任何這樣的狀態，其中可以發現疾病如轉移，但是 惡性低且不嚴重地影響生存能力。
[0026] 在本發明中，"預后不良"是指患者在通過手術處理等抑制或緩解腫瘤生長后的短 時期（例如1、2、3、4、5年或更短）內發生致命狀況。或者，預后差是指在這樣的短時期里死 亡、轉移、復發、或再發。例如，預后差可以意指至少3年或尤其至少5年內復發、轉移、或死 亡。
[0027] 預測預后是指預測患者狀況的過程或結果，并不意味著能以100%的準確度預測 患者狀況的過程或結果。預測預后是指確定某些過程或結果的可能性是否增加，而并不意 味著通過與某些過程或結果不發生的情況比較來確定發生某些過程或結果的可能性。如本 發明而言，本發明中MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的水平降低的患者中，與不顯示該特征的患 者相比，更有可能觀察到特定過程或結果。
[0028] 進一步，所述檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品可以是檢測MS4A6A基因或 MS4A6A蛋白的試劑、也可以是包含所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試 劑的高通量測序平臺。
[0029]本發明還提供了一種診斷多發性骨髓瘤的工具，所述工具能夠檢測MS4A6A基因或 MS4A6A蛋白的表達水平。所述工具包括能夠結合MS4A6A基因的核酸或者能夠結合MS4A6A蛋 白的物質（例如抗體）。所述核酸能夠檢測M S 4 A 6 A基因的表達水平；所述物質能夠檢測 MS4A6A蛋白的表達水平。
[0030] 進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
[0031] 進一步，所述診斷多發性骨髓瘤的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通 量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷多發性骨髓瘤的工具，隨著高通量測序技 術的發展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正 常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知 MS4A6A基因的異常與多發性骨髓瘤相關也屬于MS4A6A基因的用途，同樣在本發明的保護范 圍之內。
[0032] 本發明還提供了一種預測多發性骨髓瘤預后的工具，所述預測多發性骨髓瘤預后 工具包括能夠結合MS4A6A基因的核酸或者能夠結合MS4A6A蛋白的物質(例如抗體）。所述核 酸能夠檢測MS4A6A基因的mRNA水平;所述物質能夠檢測MS4A6A蛋白的表達水平。
[0033]進一步，所述核酸和所述物質的性質同前面所述。
[0034]進一步，所述預測多發性骨髓瘤預后的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或 高通量測序平臺；高通量測序平臺是一種特殊的診斷多發性骨髓瘤的工具，隨著高通量測 序技術的發展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者 和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中 獲知MS4A6A基因的異常與多發性骨髓瘤相關也屬于MS4A6A基因的用途，同樣在本發明的保 護范圍之內。
[0035]本發明的檢測產品、診斷工具中使用的抗MS4A6A抗體或其片段所識別的氨基酸的 數目沒有特別限制，只要抗體能夠結合MS4A6A即可。
[0036]本發明還提供了一種診斷多發性骨髓瘤或預測多發性骨髓瘤預后的方法，所述方 法包括如下步驟：
[0037] (1)獲取受試者的樣品；
[0038] (2)檢測受試者樣品中MS4A6A基因或蛋白的表達水平；
[0039] (3)將測得的MS4A6A基因或蛋白的表達水平與受試者的患病與否關聯起來。
[0040] (4)與對照相比，MS4A6A基因或蛋白的表達水平降低，則該受試者被診斷為多發性 骨髓瘤，或該受試者被確定為預后不良。
[0041] 本發明還提供了一種多發性骨髓瘤的治療方法，所述方法包括激活MS4A6A基因或 MS4A6A蛋白。
[0042] 進一步，所述方法包括促進MS4A6A基因的表達，或促進MS4A6A蛋白的表達或增強 MS4A6A蛋白的活性。
[0043] 本發明還提供了一種腫瘤藥物的篩選方法，可以通過在對癌細胞添加測試藥物后 或在對腫瘤模型動物施用測試藥物后的某個時期測量MS4A6A基因或者MS4A6A蛋白的表達 水平來測定腫瘤藥物改善腫瘤預后的效果。更具體地說，當MS4A6A基因或者MS4A6A蛋白的 表達水平在添加或施用測試藥物后升高時或者恢復正常水平時，可選擇該藥物作為改善腫 瘤預后的治療藥物。
[0044]本發明還提供了一種含有MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的激活劑的藥物。
[0045]本發明還提供了上述激活劑在制備治療多發性骨髓瘤的藥物中的應用。
[0046]本發明的MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的激活劑不受限制，只要是可以促進或者增強 MS4A6A或涉及MS4A6A上游或下游途徑的物質的表達或活性，且對于治療腫瘤有效的藥物即 可。
[0047] 進一步，所述激活劑包括MS4A6A基因、MS4A6A蛋白、促進型miRNA、促進型轉錄調控 因子、或促進型靶向小分子化合物。
[0048] 所述激活劑還包括包含攜帶MS4A6A基因的載體或者宿主細胞。
[0049]本發明的激活劑一方面可以用于補充內源性的MS4A6A蛋白的缺失或不足，通過提 尚MS4A6A蛋白的表達，從而治療因 MS4A6A蛋白缺之導致的多發性骨髓瘤。另一方面可以用 于增強MS4A6A蛋白的活性，從而治療多發性骨髓瘤。
[0050] 本發明的藥物可以作為醫藥單獨施用或與其它藥物一起施用。可以與本發明的藥 物一起施用的其它藥物不受限制，只要它不損害本發明的治療性或預防性藥物的效果即 可，優選的是，用于治療或預防腫瘤的藥物可以包括例如烷化劑，諸如異環磷酰胺、環磷酰 胺、達卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法侖、和雷莫司汀;抗代謝物，諸如 依諾他濱、卡培他濱、卡莫氟、克拉屈濱、吉西他濱、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸鹽 (cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿啼啶、替加氟吉美啼啶奧替拉西鉀、去氧氟尿 苷、羥基脲、氟尿嘧啶、氟達拉濱、培美曲塞、噴司他丁、巰嘌呤、和甲氨蝶呤;植物生物堿，諸 如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他賽、nogitecan、帕利他賽、長春瑞濱、長春地辛、和 長春堿;抗癌抗生素，諸如放線菌素 D、阿柔比星、氨柔比星、伊達比星、表柔比星、凈司他丁 stimalamer、柔紅霉素、多柔比星、啦柔比星、博來霉素、培洛霉素、絲裂霉素 C、和米托蒽醌； 基于鉑的藥物，諸如奧沙利鉑、卡鉑、順鉑、和奈達鉑;激素藥物，諸如阿那曲唑、依西美坦、 雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡魯胺、氟他胺、 潑尼松龍、磷雌酚、米托坦、甲睪酮、甲羥孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和來曲唑；生物反應修飾 劑，諸如干擾素 α、干擾素 β、干擾素 γ、白介素、烏苯美司、干BCG、和香菇多糖;和分子靶向藥 物，諸如伊馬替尼（imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆單抗、奧佐米星、他米巴羅汀、曲 妥單抗、維A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔單抗等。
[0051] 本發明的藥物可根據需要制備成各種劑型。包括但不限于，經皮、粘膜、鼻、口頰、 舌下或經口使用的片劑、溶液劑、顆粒劑、貼劑、膏劑、膠囊劑、氣霧劑或栓劑。
[0052] 本發明的藥物的施用途徑不受限制，只要它能發揮期望的治療效果或預防效果即 可，包括但不限于靜脈內，腹膜內，眼內，動脈內，肺內，口服，小泡內，肌肉內，氣管內，皮下 的，通過皮膚，通過胸膜，局部的，吸入，通過粘膜，皮膚，腸胃，關節內，心室內，直腸，陰道， 顱骨內，尿道內，肝內，瘤內。在某些情況下，可以系統地給藥。在某些情況下是局部地給藥。
[0053]本發明的藥物的劑量不受限制，只要獲得期望的治療效果或者預防效果即可，可 以依據癥狀、性別、年齡等來恰當的確定。本發明的治療藥物或預防藥物的劑量可以使用例 如對疾病的治療效果或者預防效果作為指標來確定。
[0054]在本發明的上下文中，"診斷多發性骨髓瘤"既包括判斷受試者是否已經患有多發 性骨髓瘤、也包括判斷受試者是否存在患有多發性骨髓瘤的風險。
[0055] 本文所用的"治療"涵蓋患有相關疾病或病癥的哺乳動物例如人類中治療相關的 疾病或疾病狀態，并且包括：
[0056] (1)預防疾病或疾病狀態在哺乳動物中發生，尤其是當該哺乳動物易感于所述疾 病狀態，但尚未被診斷出患有這種疾病狀態時；
[0057] (2)抑制疾病或疾病狀態，即阻止其發生;或者
[0058] (3)緩解疾病或疾病狀態，即使疾病或疾病狀態消退。
[0059] 術語"治療"通常涉及治療人類或動物(例如，被獸醫所應用），其中可達到某些預 期的治療效果，例如，抑制病癥的發展(包括降低發展速度、使發展停止）、改善病癥和治愈 病癥。還包括作為預防措施(例如預防）的治療。對還沒有發展為病癥但有發展為該病癥危 險的患者的用途，也包括在術語"治療"中。
[0060] 本發明的優點和有益效果：
[0061] 本發明的發現了一種診斷多發性骨髓瘤的分子標志物，使用該分子標志物可以在 多發性骨髓瘤發生的早期即可作為判斷，提供了患者的生存率。
[0062] 另外，通過預測患者的預后，本發明能夠提供有意義的信息來為患者決定治療方 案策略。
[0063] 本發明的包括MS4A6A基因或蛋白的激活劑的治療藥物可用作新的多發性骨髓瘤 的治療藥物。
【附圖說明】
[0064]圖1顯示MS4A6A基因過表達對多發性骨髓瘤細胞增殖的影響；
[0065]圖2顯示MS4A6A基因過表達對多發性骨髓瘤細胞侵襲的影響；
[0066]圖3顯示MS4A6A基因過表達對多發性骨髓瘤細胞迀移的影響。
[0067]具體的實施方式
[0068] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0069] 實施例1基因芯片篩選差異表達基因
[0070] 1、取材：
[0071] 多發性骨髓瘤組織:收集確診的MM患者骨髓活檢標本共10例，MM診斷標準參閱《中 國多發性骨髓瘤診治指南2011修訂版》。患者中男5例，女5例，中位年齡59歲。
[0072]正常骨髓組織:收集同時期營養不良性貧血患者骨髓活檢組織標本10例作為對照 組，其中男5例，女5例，中位年齡53歲。
[0073] 2、組織RNA的獲取
[0074] 使用Tr i zo 1-步法提取組織總RNA。
[0075] 3、RNA純度及濃度的測定
[0076] 取RNA溶液ΙμL，儀器測定0D260、0D280，RNA濃度為0D260值X稀釋倍數X40/ 1000,計算0D260/0D280,比值在1.7-2.0代表1?祖溶液純度高，含蛋白質等雜質少，-20°(：保 存。
[0077] 4、RNA完整性檢測
[0078] (1)取2μ1 RNA樣品行1.5%瓊脂糖凝膠電泳(80v，15min);
[0079] (2)分出區帶后，genefinder染色，藍光下觀察電泳區帶；
[0080] (3)當28s/18s約2:1時，說明RNA穩定無降解。
[0081] 5、基因芯片雜交及掃描
[0082] 總RNA經線性化擴增后，cy3-UTP標記，熒光標記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對標記好的cRNAs進行片段化處理。采用美 國Agilent公司的人全基因表達譜芯片(4x 44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后 洗脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0083] 6、芯片數據處理與分析
[0084]雜交后的芯片經芯片掃描儀讀取數據點后，將數據導入分析軟件，對于兩組比值 的自然對數絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。
[0085] 7、統計學處理
[0086]采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0087] 8、結果
[0088] 芯片結果顯示，多發性骨髓瘤組織與正常骨髓組織之間共篩選出489個差異表達 基因，其中表達水平上調的基因215個，表達水平下調的基因274個。
[0089]實施例2大樣本驗證篩選出的差異表達基因
[0090] 考慮現有技術中還未見關于該基因與多發性骨髓瘤相關性進行研究的基因作為 候選基因，同時考慮基因測序的結果，選擇MS4A6A基因（其表達在多發性骨髓瘤組織中下 調)進行驗證。
[0091] 1、樣本收集
[0092] 按照實施例1的方法收集多發性骨髓瘤組織50例，正常骨髓組織60例。
[0093] 2、在mRNA水平上進行驗證
[0094] 2.1提取組織RNA [0095] 步驟同實施例1。
[0096] 2.2逆轉錄
[0097] 逆轉錄體系共2(^1^，包括細胞總1?祖2以8/2以1^，501]/^1^1?1^8丨111以1^，5\逆轉錄反 應緩沖液 4yL，10m M d NTP 2yl，50yg/mL隨機引物 2yL(promega)，200UAiLM-MLV逆轉錄 酶 lyL，DEPC 8yL。
[0098] 37°C反應60分鐘，95°C5分鐘終止反應。cDNA在-80°C保存或進行PCR擴增。
[0099] 2.3PCR
[0100] 反應體系按照Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒（購自天根生化科技（北京） 有限公司）配置，SYBR反應體系共 25yL，2.5XReal Master Mix 10yL，20XSYBR solution 1.25yL，上游引物0.5yL，下游引物0.5yL，去離子水10.75yL，cDNA 2yL。反應條件為94°C 5min，94°C 45s，60 °C lmin，30 個循環，設空白對照。
[0101] PCR反應前10個循環的熒光信號作為熒光本底信號，調芐基線至適宜處，各熒光曲 線與基線交叉點的循環數即為ct值。根據Δ c(t) = C(t)ge_-C(t)fs-ac；tin，Δ Δ c(t) = 2 ^(t)，計算目的基因與β-actin相對表達量。
[0102] PCR引物序列如下：
[0103] MS4A6A基因引物序列如下所示：
[0104] 上游引物：5'-ACTGTTGAACTCTGCTTACC-3'（SEQ ID N0.1);
[0105] 下游引物：5'-TTCTCTGTGGCGATTGATAG-3'（SEQ ID N0.2)。
[0106] β-actin基因引物序列如下所示：
[0107] 上游引物：5'-CTGGCACCACACCTTCTACAAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0108] 下游引物：5'-AATGTCACGCACGATTTCCCGC_3'（SEQ ID N0.4)
[0109] 2.4結果
[0110] 結果顯示，與正常骨髓組織相比，多發性骨髓瘤組織中MS4A6A基因的mRNA水平明 顯下調，相對表達量為〇. 24±0.05，差異具有統計學意義(P〈0.05)。
[0111] 3、在蛋白水平上進行驗證
[0112] 3.1提取組織總蛋白
[0113]按照EpiQuik組織/細胞總蛋白提取試劑盒的說明書進行蛋白提取的操作。
[0114] 3.2Western blot檢測
[0115] 將提取的蛋白定量進行SDS-PAGE電泳，之后進行轉膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、 顯色。
[0116] 3.3統計學處理
[0117]將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進行分析，以β-actin為內參，將MS4A6A蛋 白條帶的灰度值進行歸一化處理。結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用 SPSS13.0統計軟件來進行統計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P〈0.05時具有統 計學意義。
[0118] 3.4 結果
[0119] 結果顯示，與正常骨髓組織相比，多發性骨髓瘤組織中MS4A6A蛋白水平顯著降低， 相對表達量為0.39 ± 0.08，差異具有統計學意義(P〈0.05)。
[0120] 實施例3 MS4A6A基因過表達
[0121] 1、質粒構建
[0122] 根據MS4A6A基因的編碼序列設計擴增引物，引物的設計為本領域技術人員所熟 知。從成人胎腦的cDNA文庫(clontech公司，貨號:638831)中擴增全長的MS4A6A基因的編碼 序列，上述cDNA序列插入到真核細胞表達載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-MS4A6A用于后續實驗。
[0123] 2、多發性骨髓瘤細胞的培養與轉染
[0124] 2.1細胞培養
[0125] 1^118226細胞采用含有15%胎牛血清$83)、青霉素1001]/1111、鏈霉素10(^8/1111 的RPMI 1640培養基置于37°C，5%C02,飽和濕度環境下培養。
[0126] 2.2細胞轉染
[0127] (1)轉染前一天將0.5_2*105個腫瘤細胞懸浮于500μ1不含抗生素的培養基，接種 至24孔培養板。
[0128] (2)轉染當天細胞密度應達80%-90%，準備以下復合物Α:將lyg質粒DNA稀釋于無 血清培養基中，輕輕混勾；復合物B:取4μ1 Lipofectamine2000稀釋于無血清培養基中，混 勻。
[0129] (3)將復合物A和B混合，輕輕混勻，室溫孵育。
[0130] (4)將100μΙ脂質體復合體加入腫瘤細胞中，上下左右輕輕混勻，將細胞放入37°C 含5 % C02培養箱孵育5-7小時。
[0131] (5)加 lml含有2倍正常血清和抗生素濃度的生長培養基，繼續培養細胞18-24小 時。
[0132] 3、利用QPCR實驗檢測pcDNA3.1-MS4A6A的過表達情況
[0133] 3.1提取細胞總RNA利用常規方法進行操作。
[0134] 3.2逆轉錄
[0135] 步驟同實施例2。
[0136] 3.3QPCR
[0137] 步驟同實施例2。
[0138] 3.4 結果
[0139] 結果顯示，pcDNA3.1-MS4A6A能夠成功過表達，相對表達量為6.25 ± 0.78，差異具 有統計學意義(P〈〇.〇5)。
[0140] 3、Western blot實驗檢測pcDNA3 · 1-MS4A6A過表達情況
[0141] 步驟同實施例2。
[0142] 結果顯示，與轉染pcDNA3.1組相比，轉染pcDNA3.1-MS4A6A的細胞中MS4A6A蛋白的 含量明顯增加，相對表達量為2.97 ±0.43，差異具有統計學意義(P〈0.05)。
[0143] 實施例4 MS4A6A基因的表達對多發性骨髓瘤細胞增殖能力的測定
[0144] 1、步驟：
[0145] (1)將細胞接種于96孔板中，每個濃度做3復孔；
[0146] (2)加入MTT工作濃度的溶液，與細胞37°C共同孵育4h;
[0147] (3)除去培養基，加入200μ1二甲基亞砜來溶解甲瓚晶體；
[0148] (4)連續5d測0D570,所有實驗均重復三次以上，求取平均值；
[0149] 2、結果：
[0150] 結果如圖1所示，與轉染pcDNA3.1組相比，轉染pcDNA3.1-MS4A6A組細胞增殖速度 明顯減慢，差異具有統計學意義(P〈〇. 05)。上述實驗結果表明，MS4A6A基因表達抑制了多發 性骨髓瘤細胞的增殖。
[0151] 實施例7檢測MS4A6A基因表達對細胞迀移、侵襲的影響
[0152] 1、侵襲實驗
[0153] 1.1實驗步驟：
[0154] (1)上室用Matrigel(人工基底膜)預涂；
[0155] (2)在上室中種入轉染后的細胞，接種濃度為5*104/100μ1細胞，在無血清培養基 中培養18h;
[0156] (3)將細胞加入到0.1%的FBS的RPMI-1640培養基中培養18h;
[0157] (4)在冰上吸取 50μ1 Matrigel;
[0158] (5)加入預冷的150μ1無血清RPMI-1640培養基中充分混勻；
[0159] (6)分別取（5)中混合的Matrigel 50μ1，加入到transwell上室，覆蓋整個膜；
[0160] (7)37°C至過夜，使Matrigel聚合成膠；
[0161] (8)細胞用無血清RPMI-1640培養基洗2遍，再加入無血清的RPMI-1640培養基中， 至總體積?〇〇μ1;
[0162] (9)將(8)均勻加入Transwe 11上室中，下層培養液和小室間，避免氣泡；
[0163] (10)向下室加入500-600μ1 含 5%FBS 的 RPMI-1640培養，37°C，5%C〇2;
[0164] (11)48h后吸盡液體，擦去未穿透的細胞，迀移到膜的下表面的細胞用100 %甲醇 固定30min，PBS洗2遍；
[0165] (12)0.2%結晶紫染色上室3〇11^11，？85洗去多余結晶紫；
[0166] (13)倒置顯微鏡下計數。
[0167] 1.2 結果：
[0168] 實驗結果如圖2顯示，與轉染pcDNA3.1組相比，轉染pcDNA3.1-MS4A6A組細胞侵襲 數明顯減少，差異具有統計學意義(P〈〇. 05)。
[0169] 2、迀移實驗
[0170] 2.1實驗步驟
[0171] (1)上室中不需要預涂Matrigel人工基底膜。在上室中種入轉染后的細胞，接種濃 度為（?*?〇 5)Λ〇〇μ1個細胞，在無血清培養基中培養I8h;
[0172] (2)將細胞加入到0.1%的FBS的無血清RPMI-1640培養基中培養18h;
[0173] (3)在冰上用預冷的槍頭吸取50μ1 Matrigel;
[0174] (4)加入預冷的150μ1無血清RPMI-1640培養基中充分混勻；
[0175] (5)分別取(4)中混合的Matrigel 50μ1加入到Transwell上室，覆蓋整個膜；
[0176] (6)37°C至過夜，使Matrigel聚合成膠；
[0177] (7)細胞用無血清RPMI-1640培養基洗2次，再加入無血清的RPMI-1640培養基中， 至總體積?〇〇μ1;
[0178] (8)將(7)均勻加入Transwell上室中，下層培養液和小室間，避免氣泡，向下室加 入500-600μ1 含 10%FBS的RPMI-1640培養，37°C，5%C〇2;
[0179] (9)48h后吸盡液體，擦去未穿透的細胞，迀移到膜的下表面的細胞用100%甲醇固 定 30min，PBS洗2遍；
[0180] (10)0.2%結晶紫染色上室3〇11^11，？85洗去多余結晶紫；
[0181] (11)倒置顯微鏡下計數。
[0182] 2.2 結果
[0183] 實驗結果如圖3顯示，與轉染pcDNA3.1組相比，轉染pcDNA3.1-MS4A6A組細胞迀移 數明顯減少，差異具有統計學意義(P〈〇. 05)。
[0184] 上述結果表明，MS4A6A基因表達抑制了骨髓瘤細胞的迀移和侵襲。
[0185] 上述實施例的說明只是用于理解本發明的方法及其核心思想。應當指出，對于本 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發明進行若干改進 和修飾，這些改進和修飾也將落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品在制備診斷多發性骨髓瘤或預測多發性骨髓 瘤預后的工具中的應用。2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的產品 包括檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的表達水平的產品。3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于，所述產品包括能夠結合MS4A6A基因的 核酸或者能夠結合MS4A6A蛋白的物質;所述核酸能夠檢測MS4A6A基因的表達水平;所述物 質能夠檢測MS4A6A蛋白的表達水平。4. 根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增MS4A6A基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。5. -種診斷多發性骨髓瘤或預測多發性骨髓瘤預后的工具，其特征在于，所述工具包 括能夠檢測MS4A6A基因或MS4A6A蛋白的表達水平的工具。6. 根據權利要求5所述的工具，其特征在于，所述工具包括能夠結合MS4A6A基因的核酸 或者能夠結合MS4A6A蛋白的物質；所述核酸能夠檢測MS4A6A基因的表達水平;所述物質能 夠檢測MS4A6A蛋白的表達水平。7. 根據權利要求6所述的工具，其特征在于，所述核酸是實時定量PCR中使用的特異擴 增MS4A6A基因的引物如SEQIDN0.1和SEQIDN0.2所示。8. -種治療多發性骨髓瘤的藥物，其特征在于，所述藥物包含MS4A6A基因或MS4A6A蛋 白的激活劑。9. 根據權利要求8所述的藥物，其特征在于，所述激活劑能夠促進或增強MS4A6A或涉及 MS4A6A上游或下游途徑的物質的表達或活性。10. 權利要求8或9所述的激活劑在制備治療多發性骨髓瘤的藥物中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969901SQ201610599598
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月27日
【發明人】楊承剛, 肖楓, 任靜
【申請人】北京泱深生物信息技術有限公司