一種快速檢測水產病原菌的組合物及其制備方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測水產病原菌的組合物，尤其是對殺鮭氣單胞菌具有特異性。該組合物能對殺鮭氣單胞菌進行快速檢測。根據殺鮭氣單胞菌特異保守基因vapA、spsM、spsE設計引物，可在40分鐘左右完成殺鮭氣單胞菌的檢測，靈敏度達到20cfu/反應。本發明組合物進行檢測，能使反應結果檢測方便、快捷。可直接觀察反應體系的顏色變化來判定，反應體系由淺褐色變為熒光綠即為陽性結果。同時設備要求簡單，易操作，反應速度更快。
【專利說明】
一種快速檢測水產病原菌的組合物及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種快速檢測水產病原菌的組合物及其制備方法，更具體地說，本發 明涉及一種對殺鮭氣單胞菌有特異性的組合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 水產養殖是我國大農業中發展最快的產業之一，但隨著養殖規模擴大，病害問題 已經成為制約產業健康發展的主要因素。其中細菌性致病是危害養殖業的一類主要疾病， 每年給水產養殖業造成巨大的經濟損失。病原菌的快速檢測可以為魚類養殖日常生產提供 病原變化信息，為病害預警提供依據，避免病害發生可能造成的巨大損失。
[0003] 殺鮭氣單胞菌(Aeromonas salmonicida)為革蘭氏陰性菌，分布廣泛，能夠引發多 種水產動物的疾病，是一種致病力較強的水產病原菌。它不僅可以引起多種魚類皮膚潰瘍 病還可以侵染棘皮動物海膽和刺參，并引發疾病，造成巨大的經濟損失。
[0004] 目前，國內對魚類細菌性疾病快速診斷技術的研究還處于初級階段，常用的鑒定 方法費時費力，有的還不準確，甚至需要專業技術人員或專業技術設備，難以在養殖生產上 應用，遠遠不能滿足生產上的需要，且難以對病原生物早期監控、定期檢測、現場快速診斷， 因此往往是爆發了大規模流行性疾病后才引起關注和重視。國內外尚無針對殺鮭氣單胞菌 的快速有效的易于現場操作的檢測方法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種靶序列擴增特異性高、反應結果檢測方便和快捷的檢測 水產病原菌的組合物。
[0006] 本發明的另一個目的是提供一種設備要求簡單和易操作、反應速度快、快速有效 且易于現場操作的檢測殺鮭氣單胞菌的檢測方法。
[0007] 本發明的目的在于:殺鮭氣單胞菌特異基因的選擇及引物的設計和優化后的等溫 擴增反應體系的配比及反應條件的設定。
[0008] 本發明是基于環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,簡 稱為LAMP)技術建立一種快速檢測殺鮭氣單胞菌的方法，該方法的核心內容是殺鮭氣單胞 菌特異基因的選擇及引物的設計和優化后的等溫擴增反應體系的配比及反應條件的設定。
[0009] 環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification,簡稱為LAMP)技術 依賴于能夠識別靶DNA上6個特定區域的4條引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒 溫條件下高效擴增核酸，1小時即可完成，產物是由多重復靶序列的莖-環狀DNA和花椰菜狀 DNA所組成的混合物，具有高特異性、快速靈敏、操作簡便等特點。本發明建立的環介導等溫 擴增體系通過染料鈣黃綠素的顏色變化來指示反應結果，肉眼即可觀察。
[0010] LAMP對引物設計的要求非常高，LAMP的2對引物分別稱為FIP和BIP、F3和B3,可識 別靶基因的6個不同的區域。F3:正向外引物，F3區與靶基因的F3c區域互補；B3:反向外引 物，B3區域與靶基因的B3c區域互補;FIP:正向內引物，由F2區和Flc區域組成，F2區與靶基 因3'端的F2c區域互補，Flc區與靶基因5'端的Flc區域序列相同;BIP:反向內引物，由Blc和 B2區域組成，B2區與靶基因3'端的B2c區域互補，Blc區域與靶基因5'端Blc區域序列相同。 在LAMP反應中加入環引物(正向環引物LF、反向環引物LB)能夠明顯加快等溫擴增的速度， 大大提尚了檢測效率。
[0011]
[0012] LAMP引物設計
[0013] 遵循"種內保守，種間特異"的原則，通過查閱文獻和與NCBI數據庫中殺鮭氣單胞 菌基因組以及本實驗室已測序殺鮭氣單胞菌基因組的比對分析，篩選到vapA、 SpSM、SpSE 三個殺鮭氣單胞菌特異毒力基因的保守區（300bp左右)作為靶基因來設計等溫擴增的引 物。使用在線等溫擴增引物設計軟件?1'；[1116也1口10代1'￥40；^￥3^來設計引物。引物序列如 下：（備注：由于設計的引物F1和F2在靶基因上距離較近，不需要再添加正向環引物LF，只需 添加反向環引物LB即可）
[0014]
[0022] LAMP反應體系特異性評價：以水產養殖環境中常見細菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、馬胃葡萄球菌、嗜冷桿菌、堅強芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和3株殺鮭氣單胞菌 的DNA為模板，評價反應體系特異性。3株殺鮭氣單胞菌核酸檢測均在1小時內出現了陽性擴 增，7株非殺鮭氣單胞菌核酸檢測均未出現陽性擴增，表明該LAMP反應體系特異性較好。陽 性結果為由淺褐色變為熒光綠，陰性結果和陰性對照均為淺褐色。
[0023] LAMP反應體系的優化:25yL的LAMP反應體系包括2個內引物FIP和BIP、2個外引物 卩3和133、1個環引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜堿(136丨3；[116)、脫氧核糖核苷酸（(1階？）、 硫酸鎂、氯化錳、鈣黃綠素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補足體系。選擇對LAMP體系中 的關鍵因素進行優化，包括外引物與內引物濃度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、鎂離子濃度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、鈣黃綠素與氯化錳的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 應溫度(61、62、63、64、65°0。最終得到最優的擴增體系如下：25以1^的1^^反應體系，63度恒 溫擴增。
[0025] LAMP反應體系靈敏度評價:將殺鮭氣單胞菌培養液10倍系列梯度稀釋后，選取連 續7個稀釋度用血球計數板計數，每個稀釋度分別取3個樣品計數，求出每個稀釋度的平均 值。以上述10倍梯度稀釋的細菌DNA為模板，使用優化后的LAMP反應體系進行擴增試驗。最 終得到優化后的LAMP反應體系靈敏度為20cfu/反應，反應條件為63度恒溫擴增45分鐘。
[0026] 本發明取得了如下效果：1)LAMP對靶序列擴增的特異性高。由于LAMP通過4條引物 與靶序列上的6個特異部位準確結合來產生擴增反應，因此可以獲得比PCR更高的特異性。 2)反應結果檢測方便、快捷。可直接觀察反應體系的顏色變化來判定，反應體系由淺褐色變 為熒光綠即為陽性結果。3)設備要求簡單，易操作。LAMP只需要一個普通的水浴鍋或者恒溫 裝置，操作簡單、攜帶方便，技術門檻低。4)反應速度更快。LAMP是恒溫擴增反應，沒有PCR反 應中溫度變化的耗時，一般在30min-60min內即可完成，比熒光定量PCR反應速度更快，能更 好的滿足生產現場的快速檢測的要求。5)-般情況下，以分子水平為基礎的檢測方法例如 PCR和熒光定量PCR都會受臨床標本中抑制物的影響，一些研究者報道LAMP使用的Bst DNA 聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比熒光定量PCR中的Taq酶要強。因此LAMP比熒光定量 PCR具有更廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0027]圖1引物spsM特異性實驗對照 [0028]圖2引物spsE特異性實驗對照 [0029]圖3引物vapA特異性實驗對照 圖4 LAMP引物設計
[0030] 1--錯樣芽胞桿菌;2--溶藻弧菌;3--馬胃葡萄球菌；
[0031] 4一一西瓦氏菌;5-一大西洋弧菌;6-一堅硬芽孢桿菌；
[0032] 7--嗜冷桿菌;8--殺鮭氣單胞菌S7; 9--殺鮭氣單胞菌S53;
[0033] 1〇--殺鮭氣單胞菌S121;ll--陰性對照。
【具體實施方式】
[0034] 實施例1
[0035]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol builcr 10f/〇 5M:甜菜堿： 12%、
[0036] 100 mM 硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0,625 mM鈣黃緑素 4%^
[0037] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為65分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0038] 實施例2
[0039]按體積比該組合物包括： 10v Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜堿 16%、
[0040] 100 mM 硫酸鎂 3%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%
[00411檢測殺鮭氣單胞菌的時間為58分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0042] 實施例3
[0043]按體積比該組合物包括： 1 〇\ Thermpol buH'er 101?、 5M甜菜堿 16%、
[0044] 100 mM 硫酸鎂 6%、 12.5 mM 氯化錳： 1%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%,
[0045] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0046] 實施例4
[0047]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpo! bulTcr 10% 5M:甜菜堿 16%、
[0048] 100 mM 硫酸鎂 6% 12.5 mM氯化錳 4%、 0,625'mM鈣黃綠素 1%P
[0049] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0050] 實施例5
[00511按體積比該組合物包括： 10、Thcrnipol bulTbr 8%、 5M甜菜堿 16%、
[0052] l.O.O.mM 疏酸鎂 6%, 12.5 mM氯化錳 蛛％、 0.625 mM鈣黃綠素 4%P
[0053] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為55分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0054] 實施例6
[0055]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 12〇/0> 5M 甜菜堿 16%、
[0056] ]00mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化猛 4%、
[0057] 0.625 mM 鈣黃綠素 4%。：
[0058]檢測殺鮭氣單胞菌的時間為50分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0059] 實施例7
[0060]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol buffer 10:%、 5M甜菜堿 20%、
[0061 ] 100 mM 硫酸鎂 .6%、 12.5 mM 氯化錳 4%:、 0.625 mM鈣黃綠素 4%。
[0062] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為45分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0063] 實施例8
[0064]按體積比該組合物包括： 10x Thcrmpol bulTcr 10%、 5M甜菜堿 16%、
[0065] 100 mM 硫酸鎂 9%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.:625 imM鈣黃綠素 4%。
[0066] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為45分鐘(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ng/yL)。
[0067] 實施例9
[0068]按體積比該組合物包括： l〇x Thcrmpol bulTcr 10%、
[0069] 5 Μ 甜菜堿 16%、 100 mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、
[0070] 0.625 mM鈣黃綠素 8%。
[0071] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0072] 實施例10
[0073]按體積比該組合物包括： l〇x Thermpo! bulTcr 10% 5M甜菜堿 16%、
[0074] lOOraM 硫酸鎂 6%、 氯化錳 8%、. 0.:6_2:5.mM 1? 黃綠素 4%。
[0075] 檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區分度較低(反應 溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0076] 實施例11
[0077]按體積比該組合物包括： IQx Thcrmpol buil'cr 1.0%、.. 5M甜菜堿 16%、 ]()0mM硫酸鎂 6%、 12.5 mM氯化錳 4%、 0.625 mM鈣黃綠素 4%。
[0078] 2:S mM dNTP 5.6%·. 100 μΜ F3 0.2%, 100μΜ B3 0.2%、 100μΜ FIP 1，6%、 100μΜ BIP 1.6%, 100μΜ LB 0.8%, BstDNA聚介酶 4%、
[0079] DNA 模板 8%、 無菌水 補足體系。
[0080] 該反應體系檢測殺鮭氣單胞菌的時間為40分鐘，陽性結果和陰性結果顏色區分度 較高(反應溫度為63度，DNA模板濃度為50ngAiL)。
[0081 ] 實施例12
[0082] LAMP引物設計
[0083]遵循"種內保守，種間特異"的原則，通過查閱文獻和與NCBI數據庫中殺鮭氣單胞 菌基因組以及本實驗室已測序殺鮭氣單胞菌基因組的比對分析，篩選到vapA、SpSM、 SpSE三 個殺鮭氣單胞菌特異毒力基因的保守區（300bp左右)作為靶基因來設計等溫擴增的引物。 使用在線等溫擴增引物設計軟件PrimerExplorer V4software來設計引物。引物序列如下： (備注：由于設計的引物F1和F2在靶基因上距離較近，不需要再添加正向環引物LF，只需添 加反向環引物LB即可）
[0084]
[0085] vapA
[0086]
[0092] LAMP反應體系特異性評價：以水產養殖環境中常見細菌包括溶藻弧菌、大西洋弧 菌、西瓦氏菌、馬胃葡萄球菌、嗜冷桿菌、堅強芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌和3株殺鮭氣單胞菌 的DNA為模板，評價反應體系特異性。3株殺鮭氣單胞菌核酸檢測均在1小時內出現了陽性擴 增，7株非殺鮭氣單胞菌核酸檢測均未出現陽性擴增，表明該LAMP反應體系特異性較好。陽 性結果為由淺褐色變為熒光綠，陰性結果和陰性對照均為淺褐色。
[0093] LAMP反應體系的優化:25yL的LAMP反應體系包括2個內引物FIP和BIP、2個外引物 卩3和133、1個環引物1^、10\11161'11^1〇1131^€61'、甜菜堿(136丨3；[116)、脫氧核糖核苷酸（(1階？）、 硫酸鎂、氯化錳、鈣黃綠素 、Bst DNA聚合酶、DNA模板、滅菌水補足體系。選擇對LAMP體系中 的關鍵因素進行優化，包括外引物與內引物濃度比（1:4、1:6、1:8、1:10、1:12)、鎂離子濃度 (3、4、5、6、7、8、9mmol/L)、鈣黃綠素與氯化錳的比例（1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)、反 應溫度(61、62、63、64、65°0。最終得到最優的擴增體系如下：25以1^的1^^反應體系，63度 恒溫擴增
[0095] LAMP反應體系靈敏度評價:將殺鮭氣單胞菌培養液10倍系列梯度稀釋后，選取連 續7個稀釋度用血球計數板計數，每個稀釋度分別取3個樣品計數，求出每個稀釋度的平均 值。以上述10倍梯度稀釋的細菌DNA為模板，使用優化后的LAMP反應體系進行擴增試驗。最 終得到優化后的LAMP反應體系靈敏度為20cfu/反應，反應條件為63度恒溫擴增45分鐘。
【主權項】
1. 一種快速檢測水產病原菌的組合物，按體積比該組合物包括： i〇x Thcmipol b山Ter 8%-! 2%、 5M 甜菜堿 12%-20%、 100 mM 硫酸簇 3〇/〇-9〇/〇、 12.5 ητΜ 氯化猛 1%-8%. 0.625 mM 巧巧綠某 1%-8%。2. 根據權利要求1所述的組合物，其中10 X化ermpol buffer的體積比含量為10 %。3. 根據權利要求1所述的組合物，其中5M甜菜堿的體積比含量為16%。4. 根據權利要求1所述的組合物，其中lOOmM硫酸儀的體積比含量為6 %。5. 根據權利要求1所述的組合物，其中12.5mM氯化儘的體積比含量為4%。6. 根據權利要求1所述的組合物，其中0.625mM巧黃綠素的體積比含量為4%。7. 根據權利要求1所述的組合物，按體積比該組合物還包括： 25 mM clNTP 5.6%、 100μΜ引物混合物： 4.4%、 Bst DNA 聚合酶 4:%、 DNA模板 8%、 無菌水 補足體系。8. 根據權利要求7所述的組合物，其中所述的100μΜ引物混合物按其體積比包括： 100μΜ F3 0.2%、 100μΜ 總 3 0,2% V 100μΜ F!P !'(-,%、 Ι.ΟΟμΜ BIP 1,6%. 100μΜ； LB 0.8% 〇9. 一種快速檢測水產病原菌的組合物的應用，其特征在于對殺娃氣單胞菌有特異性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969853SQ201610317558
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月12日
【發明人】馮婕, 杜曉辰
【申請人】中國科學院微生物研究所