基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒及其分型方法
【專利摘要】基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒及其分型方法，涉及單核苷酸多態性。試劑盒包括實時熒光定量PCR試劑、陽性對照及陰性對照；CYP2C19*3為NCBI所提供人10號染色體CYP2C19基因中的SNP位點。檢測分型方法：采用常規方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA；采用所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒提供的實時熒光定量PCR試劑將DNA進行實時熒光定量PCR擴增；根據檢測到的熒光信號對人CYP2C19基因單核苷酸多態性位點CYP2C19*3進行分型。AllGlo探針在保持高特異性和敏感性的前提下，檢測價格比直接測序法更低廉，并且過程更簡易耗時更短。
【專利說明】
基于AI IGI 〇探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒及其分型方法
技術領域
[00011本發明涉及單核苷酸多態性(SNP)，尤其是涉及一種基于AllGlo探針的CYP2C19*3 檢測分型試劑盒及其分型方法。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP)，主要是指在基因組水 平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。它是人類可遺傳的變異中最常見的一 種。SNPs在人類基因組中廣泛存在，平均每500~1000個堿基對中就有1個，估計其總數可達 300萬個甚至更多。作為第三代遺傳標志，SNP與人體許多表型差異、藥物易感性與疾病易感 性密切相關。SNP在基因組中的大量存在，使其成為一個強有力的工具，在疾病定位與克隆、 藥物的設計和測試以及生物學的基礎研究中起了非常重要的作用。
[0003] 個體化診斷治療是未來醫學發展的大方向。將個體化的靶點定位于某個基因，甚 至是單個核苷酸，發現疾病的遺傳標志物，將有助于根據每個患者的不同遺傳背景來開展 疾病預防、診斷和治療。基因的SNP是形成個體間差異的重要遺傳學基礎，通過SNP與疾病和 藥物治療的關聯性分析，使得醫生不僅可以通過所檢測出的SNP預測、確定與疾病有關的基 因，同時也將能夠事先把握患者個體對于某種藥物的反應特點，并根據這一特點選擇治療 效果最好，不良反應等危險性最小的藥物對患者進行精準治療。
[0004] SNP在疾病的預防、診斷、治療及個體化醫學發展中扮演著重要的角色，因此準確 快速的進行SNP檢測分型具有重大的意義。
[0005] 目前，SNP分型的方法主要有直接測序技術法、限制性片段長度多態性技術 (RFLP)、Tagman熒光探針法、擴增阻滯突變系統(ARMS)、高分辨熔解曲線分析法(HRM)等。其 中，直接測序法是目前最直觀，準確性相對而言最高的SNP分型方法，但其步驟多而分散，成 本較高，工作量大，周期長，價格昂貴，不適合大樣本多位點檢測;限制性片段長度多態性技 術(RFLP)作為一種最早的DNA標記技術，對儀器要求低，只需要一臺PCR儀以及電泳儀器即 可進行實驗，但其實驗操作繁瑣，檢測周期長，不適合大樣本檢測;Tagman熒光探針法準確 度較好，但其設計合成程序復雜，并且不適合多位點少量樣本的分型，尤其是頻率偏低的位 點；擴增阻滯突變系統(ARMS法)快速、簡便，但是不能閉管操作，對基因多態性分析難以實 現高通量、自動化;高分辨熔解曲線分析法(HRM)具有簡單、快速等優點，但該方法特異性不 足，儀器選擇少。
[0006] AllGlo探針作為新一代的熒光探針，在具備TaqMan-MGB探針優點的基礎上，大大 提高信噪比，減少背景熒光信號。目前，AllGlo探針已經成功應用于檢測皰疹病毒、乙型肝 炎病毒基因突變（Feng，Z.L.Yu，X.Y.Lu，Z.M.Geng，D.Y.Zhang，L.Chen，S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo? probes[J].Clin Chim Acta，2011，412( 11-12) :1018-1021 )、侵襲性曲霉菌病（Wu，D.S.Shen，J. Z. Zhou, X.Q.Shen,S.F.ffu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145)〇
[0007] 氯吡格雷(波立維)是目前世界范圍內使用最廣泛的噻吩吡啶類抗血小板藥，用于 急性冠脈綜合征、冠脈支架術和冠心病的一級二級預防，可以減少心血管疾病患者心臟病 發作、卒中以及死亡的風險。近年來的研究發現，氯吡格雷體內生物學功能的實現與細胞色 素酶P4502C19(CYP2C19)有重要的聯系（Kazui M，Nishiya Y，Ishizuka T，Hagihara K, Farid ΝΑ,et al·(2010)Identification of the human cytochrome P450 enzymes involved in the two oxidative steps in the bioactivation of clopidogrel to its pharmacologically active metabolite.Drug Metab Dispos 38:92-99)〇CYP2C19*3 是CYP2C19基因的一個SNP位點，在外顯子4第636位發生G/A突變，產生了提前的終止密碼， 蛋白合成終止，使CYP2C19酶活性喪失，進而降低氯吡格雷的藥用效能(Hulot JS，Bura A， Villard Ε,Αζ?ζ? M,Remones V,et al.(2006)Cytochrome P4502C191oss-〇f-function polymorphism is a major determinant of clopidogrel responsiveness in healthy sub jects. Blood 108 :2244-2247)。2010年美國食品藥品監督管理局（FDA)曾發出警示， CYP2C19*3基因攜帶者不能有效將氯吡格雷轉化為活性產物，故不能像CYP2C19*1基因攜帶 者一樣從氯吡格雷抗血小板的作用中獲益。因此服用氯吡格雷的患者需先進行CYP2C19*3 檢測分型（Administration.FaD.FDA Drug Safety Communication:Reduced effectiveness of Plavix(clopidogrel)in patients who are poor metabolizers of the drug.:U.S.Food and Drug Administration；2010[cited 2011Nov17]；[4screen] .Available from:http://www · fda · gov/Drugs/DrugSafety /) 〇 用藥前對患者進行 CYP2C19*3的檢測分型，能夠為患者選擇最佳的治療用藥，提供合適的治療劑量，為臨床用 藥提供重要的參考依據。在個體化診斷與治療快速發展的背景下，CYP2C19*3與藥物代謝的 緊密聯系使其成為了一個極具醫學潛力的SNP位點，因此急需一種更快速高效的SNP分型方 法來滿足精準醫學的發展。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的之一在于針對現有檢測SNP方法中使用的試劑盒和檢測方法存在的 上述缺陷，提供基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒。
[0009] 本發明的目的之二在于提供基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型方法。
[0010] 所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，包括實時熒光定量PCR試劑、 陽性對照及陰性對照；
[0011] 所述CYP2C19*3為美國國家生物技術信息中心（NCBI)所提供人10號染色體 CYP2C19基因中的SNP位點。
[0012] 所述實時熒光定量PCR試劑包括以下組份：10 X Taq緩沖液、10m mol的MgCl2、5ιι/μ L的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10μ mol/L CYP2C19*3的特異正向引物、lOymol/L CYP2C19*3的特異反向引物和AllGlo探針；10 XTaq緩沖液包括 100m mol Tris-HCl和500m mol KC1。
[0013]所述CYP2C19*3的特異正向引物的核苷酸序列為：
[0014] SEQ ID N0·1:5，-GATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3，；
[0015] 所述CYP2C19*3的特異反向引物的核苷酸序列為：
[0016] SEQ ID NO^^^AAAATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-S^
[0017] 所述AllGlo探針為CYP2C19*3的特異探針，其核苷酸序列為：
[0018] SEQ ID N0.3：CYP2C19*3-G:MAR-CCCCCTGGATCCAG-MAR；
[0019] SEQ ID N0.4:CYP2C19*3-A:JUP-CCCCCTGAATCCAG-JUP。
[0020] 所述陽性對照包括：陽性純合對照品1、陽性純合對照品2、陽性雜合對照品；所述 陽性純合對照品1為CYP2C19*3分型為GG的DNA樣品，所述陽性純合對照品2為CYP2C19*3分 型為AA的DNA樣品，所述陽性雜合對照品為CYP2C19*3分型為GA的DNA樣品。
[0021 ]所述陰性對照為lmL的無核酶水。
[0022] 所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型方法，包括以下步驟：
[0023] 1)采用常規方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA;
[0024] 2)采用所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒提供的實時熒光定量 PCR試劑將DNA進行實時熒光定量PCR擴增；
[0025] 3)根據檢測到的熒光信號對人CYP2C19基因單核苷酸多態性位點CYP2C19*3進行 分型。
[0026] 所述AllGlo探針可米用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定 量探針，它擁有普通Taqman，Taqman_MGB及分子信標(molecular beacon)探針所有優點，克 服了目前這幾種探針的最大弊端，它打破了傳統Taqman-端報告基團一端淬滅基團的限 制，利用了美國AlleLogic Biosciences Corporation公司研制的幾種常見波長的特制焚 光染料，標記在寡核苷酸上面互為報告基團和粹滅基團，而且上面含有特殊的可以提高Tm 值(退火溫度)的化學基團，提高探針特異性，雜交特異性大大提高，在雜交水解之后兩端標 記的染料又全部變為報告基團，提高熒光增量。
[0027] 所述AllGlo探針具有以下優勢：
[0028] ①提高Tm值(可達10°C以上），探針更短可以達到15~16個堿基，可以適用A，T含量 比較高的序列設計探針；
[0029] ②加大了多重熒光定量的選擇，因為每種染料即是報告基團又是淬滅基團，打破 傳統Taqman探針因波長原因標記選擇困難，不受淬滅基團波長限制；
[0030] ③大大提高信噪比，無背景信號，空間距離近，更好的淬滅效果；
[0031 ]④成本較低，價格僅相當于Taqman-MGB探針的一半，具有MGB探針所有優勢。
[0032]本發明采用了 AllGlo探針技術，設計了特異性引物和相應的AllGlo探針，探針分 別標記2種特殊熒光基團(MAR、JUP)，并對該技術反應條件進行優化，建立了一種AllGlo探 針SNP檢測分型方法，應用前景廣闊。
[0033]本發明的有益效果如下：
[0034]本發明提供了一種基于AllGlo探針的SNP檢測分型試劑盒和檢測方法，其特異性 和敏感性高，可快速準確進行SNP分型，與現有的常見技術相比具有以下優勢：
[0035] 1.與直接測序法相比，AllGlo探針在保持高特異性和敏感性的前提下，檢測價格 比直接測序法更低廉，并且過程更簡易耗時更短。
[0036] 2.與taqman-MGB探針相比，AllGlo探針采用相同的熒光基團，互為報告基團和淬 滅基團，一方面釋放的熒光信號更強，另一方面本底信號更低;而且合成程序簡單，價格僅 相當于Taqman-MGB的一半。
[0037] 3.與限制性片段長度多態性技術(RFLP)相比，基于AllGlo探針的SNP分型方法將 反應時間大大縮短，通量更大，并且敏感性與特異性要明顯高于基于限制性酶切位點的SNP 分型方法。
[0038] 4.與擴增阻滯突變系統(ARMS)相比，基于AllGlo探針SNP分型方法檢測靈敏度更 強，可以實現"閉管操作"，有效防止外界污染，具有良好的特異性和準確性。
[0039] 5 .與高分辨熔解曲線分析法(HRM)相比，基于A11G1 〇探針SNP分型方法特異性更 高，并且多種儀器可應用AllGlo探針進行SNP檢測分型，可用儀器選擇多，不需要特定技術 人員操作，應用范圍更廣闊。
[0040] 6.本發明建立了基于AllGlo探針進行CYP2C19*3的檢測分型方法，適合人群進行 個體化的SNP檢測分型，推動了 SNP在臨床藥物研究及個體化用藥的發展。
【具體實施方式】 [0041 ] 實施例1
[0042] 本發明基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒包括以下組份：
[0043] 實時熒光定量PCR試劑、陽性對照及陰性對照。
[0044] ①實時熒光定量PCR試劑包括以下組份:10 X Taq緩沖液(10 X Taq緩沖液包括100m mol Tris-HCl和500m mol KCl)、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、10ymol/L CYP2C19*3的特異正向引物、10 μ mol/L CYP2C19*3的特異反向引物和AllGlo探針。
[0045] ②陽性對照包括：陽性純合對照品1、陽性純合對照品2、陽性雜合對照品。所述陽 性純合對照品1為CYP2C19*3分型為GG的DNA樣品，所述陽性純合對照品2為CYP2C19*3分型 為AA的DNA樣品，所述陽性雜合對照品為CYP2C19*3分型為GA的DNA樣品。
[0046] ③陰性對照為lmL的無核酶水。
[0047] 實施例2
[0048] 外周血CYP2C19*3檢測分型，包括以下步驟：
[0049] 1.收集EDTA抗凝外周血：
[0050] 抽取新鮮血液標本2mL裝于EDTA抗凝管并分裝多管，每管分裝400~500yL，取200μ L用于DNA提取，其余全血標本置于-80 °C凍存。
[0051 ] 2.提取 DNA:
[0052]采用天根生物科技有限公司的生產的血液基因組DNA提取試劑盒(DP348)，按照操 作說明書進行樣本(全血)DNA提取，200yLEDTA抗凝全血按照說明書操作進行，最后用50yL 的洗脫緩沖液TB溶解DNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測定濃度和純度，取 純度A260/A280比值在1.7~1.9之間，取濃度10~50ng/yL的已提取的DNA用于SNP分型檢 測，其余的DNA均于-80 °C凍存。
[0053] 3.實時熒光定量PCR擴增：
[0054] 3.1將熒光定量PCR的各組分置于室溫溶解，混勻后置于冰上。
[0055] 3.2配制卩0?反應混合液如表1。
[0056] 表1
[0058] 3.3于8聯管中分裝配制好PCR反應混合液，每管加入lyL的DNA，充分混勻，整個過 程在冰上進行，避免氣泡的產生。每次實驗設置一個陰性對照，設置一個陽性純合對照品1， 一個陽性純合對照品2和一個陽性雜合對照品。
[0059] 3.4檢測在實時熒光定量PCR儀器上進行，可使用ABI7300,7500(美國Applied Biosystems公司）等多種儀器。
[0060] 3.5設置熒光定量PCR反應條件如表2。
[0061] 表 2
[0063] 4.結果分析與處理:應用ABI儀器自帶軟件進行結果分析。根據對照擴增結果，分 型產生三種基因型：
[0064] 第一種基因型:GG，與陽性純合對照品1在同一軸上；
[0065] 第二種基因型:GA，與陽性雜合對照品在同一軸上；
[0066]第三種基因型:AA，與陽性純合對照品2在同一軸上。
[0067] 實施例3.組織樣本SNP檢測分型
[0068] 1 ·組織樣本處理：
[0069] 組織(脾組織用量應少10mg)應打碎處理為細胞懸液，然后lOOOOrpm(~11200Xg) 離心lmin，倒盡上清，加200yL緩沖液GA(天根DNA提取試劑盒DP304)，震蕩至徹底懸浮；
[0070] 2.組織樣本DNA提取和富集：
[0071]采用天根生物科技有限公司的生產的DNA提取試劑盒(DP304)，按照操作說明書進 行組織樣本的DNA提取，最后用50yL的洗脫緩沖液TE溶解DNA，于核酸分光光度儀器Nano Drop2000上分別測定濃度和純度；
[0072] 3.組織樣本的SNP檢測分型。
[0073]后續步驟參照實施例2的步驟3~4。
[0074] 可應用范圍：
[0075]基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒及其檢測方法可應用于人類組織樣 本和血細胞CYP2C19*3的檢測分型，以上顯示和描述了本發明的基本原理、主要特征和本發 明的優點。
【主權項】
1. 基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于包括實時熒光定量PCR試 劑、陽性對照及陰性對照； 所述CYP2C19*3為美國國家生物技術信息中心所提供人10號染色體CYP2C19基因中的 SNP位點。2. 如權利要求1所述基于A1 lGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述實 時熒光定量PCR試劑包括以下組份：lOXTaq緩沖液、10m mol的MgCl2、5u/yL的Taq Hotstart DNA聚合酶、10m mol dNTPs混合液、50XLow R0X、100mL無核酶水、ΙΟμ mol/L CYP2C19*3的特異正向引物、lOymol/L CYP2C19*3的特異反向引物和AllGlo探針；10 X Taq 緩沖液包括l〇〇m mol Tris-HCl和500m mol KC1。3. 如權利要求1所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述 CYP2C19*3的特異正向引物的核苷酸序列為： SEQ ID NO.1：5;-GATCAGCAATTTCTTAACTTGATGGA-3;； 所述CYP2C19*3的特異反向引物的核苷酸序列為： SEQ ID NO^^^AAAATGTACTTCAGGGCTTGGTCA-S^4. 如權利要求1所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述 AllGlo探針為CYP2C19*3的特異探針，其核苷酸序列為： SEQ ID N0.3：CYP2C19*3-G:MAR-CCCCCTGGATCCAG-MAR； SEQ ID N0.4:CYP2C19*3-A:JUP-CCCCCTGAATCCAG-JUP。5. 如權利要求1所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述陽 性對照包括：陽性純合對照品1、陽性純合對照品2、陽性雜合對照品；所述陽性純合對照品1 為CYP2C19*3分型為GG的DNA樣品，所述陽性純合對照品2為CYP2C19*3分型為AA的DNA樣品， 所述陽性雜合對照品為CYP2C19*3分型為GA的DNA樣品。6. 如權利要求1所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述陰 性對照為1 mL的無核酶水。7. 基于A1 lGlo探針的CYP2C19*3檢測分型方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 采用常規方法提取EDTA抗凝全血樣本中的DNA; 2) 采用如權利要求1~6中任一所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒提供 的實時熒光定量PCR試劑將DNA進行實時熒光定量PCR擴增； 3) 根據檢測到的熒光信號對人CYP2C19基因單核苷酸多態性位點CYP2C19*3進行分型。8. 如權利要求1所述基于AllGlo探針的CYP2C19*3檢測分型試劑盒，其特征在于所述 AllGlo探針采用美國AlleLogic Biosciences Corporation公司的焚光定量探針。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969841SQ201610083688
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年2月6日
【發明人】張忠英, 方宜臻
【申請人】廈門大學附屬中山醫院, 張忠英