一種酶法制備(s)-環氧苯乙烷的方法
【專利摘要】本發明公開了一種酶法制備(S)?環氧苯乙烷的方法，屬于生物催化技術領域。本發明在正己醇/緩沖液的雙相體系中，利用來源于宇佐美曲霉的環氧化物水解酶催化外消旋環氧苯乙烷的水解動力學拆分，制備(S)?環氧苯乙烷的方法；與單相反應體系相比，動力學拆分rac?SO的濃度從24g/L提高至120g/L；時空產率從為3.1g/L/h提高至20.3g/L/h；動力學拆分120g/Lrac?SO制備(S)?SO的ee值從36.8％提高至98.3％，并實現了(S)?SO的克級制備。本發明方法工藝簡單、產物的對映體純度和得率高、催化效率高和環境友好，具有較大工業化應用前景。
【專利說明】
_種酶法制備(S)-環氧苯乙焼的方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種酶法制備(S)-環氧苯乙烷的方法，屬于生物催化技術領域。
【背景技術】
[0002]手性環氧化物和鄰二醇是一類高附加值的多功能合成子或砌塊，可用于藥物、精細化學品、農藥和功能性材料等的合成，如白三烯、昆蟲信息素、留類物質、腎上腺素阻斷劑、神經保護劑和艾滋病毒蛋白酶抑制劑等。傳統的化學法合成具有光學活性的環氧化合物和鄰位二醇時，往往需要重金屬類有毒物質作為催化劑且反應條件較為苛刻，不僅面臨著環境的巨大挑戰，且難以得到高對映體純度的目的產物，生產效率低。環氧化物水解酶(Epoxide hydrolases，EHs)可催化水解酶動力學拆分(Hydrolytic kinetic resolut1n)外消旋環氧化物制備手性環氧化物或鄰二醇，具有產物對映體純度和產率高以及對環境友好等優點而備受關注。微生物來源的EHs不需要輔助因子、立體選擇性強、底物譜寬廣、綠色無污染和反應條件溫和等特點，成為一種非常具有潛力的酶催化劑。利用微生物來源的EHs生物法制備手性環氧化物與二醇的合成路線為人們提供了一種可能取代化學方法的高效專一、環境友好的合成方法。然而，底物和產物為水不溶性有機化合物，且底物在水相中易自發水解，均不利于EHs的催化反應。另外，酶催化反應存在底物或者產物抑制作用、穩定性差等不利因素，也使工藝規模難以放大，極大的限制了它們在工業生產中的應用。
[0003]目前，為解決EHs應用過程中遇到限制因素，酶固定化、非水相催化介質(水不溶性有機溶劑或離子液體)、和膜反應器等技術被引入酶促反應系統。Jia等利用DEAE纖維素對Baci IIus megaterium的EHs進行了固定化，提高酶穩定性，固定化酶可循環使用10次，但酶固定化存在傳質限制導致催化效率低。Archelas等使用A.niger EH拆分三氟甲基取代芳香族環氧化物，采用20 %正辛烷/水兩相反應體系，底物濃度為由10g/L提高到360g/L，但是不同來源的EHs有機溶劑穩定性等存在很大差異，如來源于Sphingomonas sp.的EH在正己燒中穩定，但來源于Rhodotoru I a sp.在正己燒中失去催化活性。Cho i等將Rhodococcusglutinis EHs制成中空纖維膜反應器應用于兩相拆分體系，降低了有機溶劑與底物對酶的失活作用，同時產物的及時移除解決了產物抑制問題，但膜反應器價格昂貴易耗損，不宜應用于實際工業生產應用中。因此，根據不同來源的EHs構建合適的生物催化體系，提高Hls的對映體選擇性、穩定性及生產效率等是促進EHs的大規模生產及應用的關鍵。
[0004]利用來源于宇佐美曲霉(Aspergillus usamii )E001的重組環氧化物水解酶(reAuH12)催化外消旋環氧苯乙烷(rac-SO)具有高對映選擇性、高催化活性和底物耐受性，但存在明顯底物抑制作用，從而導致reAuEH2不能實現高濃度底物的有效拆分，且時空產率低。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是提供一種利用環氧化物水解酶(reAuHK)高效制備(S)-環氧苯乙烷的方法。
[0006]所述方法是構建有機/水雙相體系，所述有機相可以是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、環己烷、正庚烷和正辛烷中的一種或幾種的混合;所述水相可以是水、磷酸鹽緩沖液和Tris-鹽酸緩沖溶液等，其pH為6.0?9.5;有機相與水相的體積比是1:9至9:1;反應體系中底物與環氧化物水解酶的用量的質量比例是30?I (w/w )，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反應溫度O?35°C，攪拌條件下進行。
[0007]在本發明的一種實施方式中，所述環氧化物水解酶的基因來源于宇佐美曲霉，環氧化物水解酶為大腸桿菌表達重組酶。
[0008]在本發明的一種實施方式中，所述有機相為正己醇。
[0009]在本發明的一種實施方式中，所述水相為pH7.0的磷酸鹽緩沖液。
[0010]在本發明的一種實施方式中，有機相為正己醇，水相為pH7.0的磷酸鹽緩沖液，有機相與水相的體積比1:1。
[0011]在本發明的一種實施方式中，底物與酶的用量比例為6:1(w/w)。
[0012]在本發明的一種實施方式中，底物濃度120g/L，底物與酶的用量比例為6:l(w/w)。
[0013]在本發明的一種實施方式中，反應溫度為25°C。
[0014]在本發明的一種實施方式中，所述酶的制備是收集產環氧化物水解酶的重組菌全細胞濕菌體，洗滌懸浮，超聲破碎后離心收集上清液，過濾得到酶液。酶液可進一步凍干得到凍干酶粉。
[0015]在本發明的一種實施方式中，還可以用產環氧化物水解酶的重組菌全細胞替代酶。
[0016]在本發明的一種實施方式中，所述產環氧化物水解酶的重組菌全細胞的制備是收集產環氧化物水解酶的全細胞濕菌體，或全細胞凍菌體。
[0017]在本發明的一種實施方式中，產環氧化物水解酶的全細胞可以是產來源于宇佐美曲霉的環氧化物水解酶的大腸桿菌基因工程菌。
[0018]本發明以rac-SO為底物，E.co I i / (reAuEH2)全細胞或reAuEH2酶作為生物催化劑，在合適的雙相體系中實現rac-SO的克級規模的動力學拆分制備手性純的(S)-SO。本發明顯著提高了水解動力學拆分的rac-SO的濃度、時空產率和產物(S)-SO的對映體純度。與單水相反應體系相比，reAuEH2催化rac-SO的濃度從24g/L提高至120g/L，提高5倍;時空產率從為3.lg/L/h提高至20.3g/L/h，提高6.5倍;催化 120g/L rac-SO制備(S)-SO的ee值從36.8%提高至98.3%。本發明實現了(S)-SO的克級制備，且工藝簡單、產物的對映體純度和得率高、催化效率高和環境友好，具有較大工業化應用前景。
【附圖說明】
[0019]圖1ReAuEH2催化外消旋環氧苯乙烷水解動力學拆分的時間進程曲線
【具體實施方式】
[0020]實施例1
[0021 ] 環氧化水解酶酶活力測定方法:在1.5mL的EP管中加入10yL酶液和850yL磷酸鉀緩沖液(50mM，pH= 7.0),35°C預熱2min；加入50yL 200mM的rac-SO，反應 15min后，加入ImL乙酸乙酯中混勾，10000r/min離心5min后，取上層有機相于新的EP管中，加入適量無水MgSO4干燥過0.22μπι的有機膜，進行手性氣相色譜分析。色譜條件:島津GC-2010GC氣相色譜儀，CYCLOSIL-B手性色譜柱，火焰離子化檢測器;進樣口和檢測口溫度為250°C，從100°C以5°C/min程序升溫至190°C; (R)-SO和(S)-SO保留時間為6.087和6.187。酶活力單位定義:在此測定條件下，以每分鐘消耗Iymol環氧苯乙烷所需的酶量定義為I個環氧化物水解酶活力單位(UhO-Sf^aeezKS-lOAS+RUXlOO^o
[0022]實施例2
[0023]重組環氧化物水解酶(reAuEH2)的制備:AuEH2的核酸序列和氨基酸序列及表達重組酶reAuH12的工程菌E.coli/(reAuH12)的構建參見公開號為CN102994470A的發明專利申請，挑取E.coli/(reAuEH2)單菌落于LB培養基中37°C條件下培養12h，以2%(v/v)的接種量轉接入新鮮的10mL的LB培養基中，37°C條件下培養2h后，加入0.2mM IPTG誘導劑28°C培養8h，誘導reAuEH2的高效表達，重組細胞經8000rpm離心收集，加入磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)懸浮，超聲破碎后離心收集上清液，經1KDa的超濾離心管濃縮，獲得的reAuEH2酶液，測定其蛋白含量為40mg/mL，比酶活力為3.8U/mg。
[0024]實施例3有機溶劑對環氧化物水解酶活力的影響
[0025]在ImL反應體系中，包含20mM rac-SO和10yL適當稀釋的reAuH12酶液和磷酸鹽緩沖液，并分別添加1 %、15 %、25 %和35 % (v/v)的水溶性有機溶劑甲醇、DMSO、DMF和異丙醇，在35°C反應15min，測定水溶性有機溶劑對reAuH12酶活力的影響，以不添加任何有機溶劑的反應體系作為對照。當所測定的水溶性有機溶劑添加量為10%時，reAuEH2保留>95%酶活力，當DMSO添加量為25%時，reAuEH2的酶活力保留50%，甲醇、DMF和異丙醇添加量為25 %時reAuH12的僅保留〈30 %酶活力。
[0026]另外，reAuEH2酶液與乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、甲苯、異丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、正辛醇、正己烷、環己烷、正庚烷、正辛烷和異辛烷等體積比混勻，在25 °(:和220印111條件下孵育8h后，吸取適量預處理的reAuH12酶液，按照測定環氧化水解酶酶活力測定方法測SreAuHK的殘余酶活力，以在等量磷酸鹽緩沖液中處理的reAuEH2酶液作為對照。reAuEH2在水不溶性有機溶劑孵育8h后，殘余酶活力分別為63.5%(乙酸乙酯)、53.9%(乙酸丁酯)、0%(二氯甲烷)、49.4%(三氯甲烷)、13.4%(甲苯)、51.3%(異丁醇)、70.1%(異戊醇)、96.2%(正戊醇)、95.6%(正己醇)、95.6%(正辛醇)、99.8%(正己烷)、98.1%(環己烷)、98.4%(正庚烷)、98.3%(正辛烷)和96.3%(異辛烷)。
[0027]實施例4不同反應體系對轉化反應的影響
[0028]構建4種反應體系:第一種為由磷酸鹽緩沖液(50mM，pH7.0)構建的單水相體系，第二種為DMSO/緩沖液(1:9，v/v)雙相體系，第三種正己烷/緩沖液(2:8，ν/ν)雙相體系，第四種正己醇/緩沖液(2:8，ν/ν)雙相體系。在4種反應體系中分別加入rac-S0(全體積濃度為90g/L，750mM)和實施例2制備的reAuEH2酶液(全體積濃度為7.5g/L)，底物質量與酶的質量比例為12(w/w)，在25°C和220rpm條件下反應，獲得產物(S)-SO的對映體過量率(ee)分別為44.9%,45.2%,56.2%和93.7 %。利用20 %正己醇/緩沖液雙相體系，(S) -SO的ee從單相體系中的44.9%提高至93.7%。
[0029]實施例5雙相體系的相體積比、底物量/酶量比率和反應溫度對轉化反應的影響
[0030]在正己醇/緩沖液(50mM，pH7.0)雙相體系中，正己醇添加量為20%、40%、50%、60%和80% (v/v)，分別加入rac-S0(全體積濃度為90g/L)和實施例2制備的reAuEH2酶液(全體積濃度為6g/L)，即底物質量與酶的質量比例為15(w/w)，在25°C和220rpm條件下反應。正己醇添加量為20%、40%、50%、60%和80% (v/v)的雙相體系中，(S)-SO的ee值分別為75.7%、95.4%、98.0%、98.1%和98.2%，得率分別47.8%、38.6%、36.0%、34.2%、30.1%o當正己醇含量彡50%，(S)-SO的ee值〉98%，但隨著正己醇含量的增加，(S)-SO得率降低，故正己醇/緩沖液(50mM，pH7.0)雙相體系中的最適相體積比為1:1 (v/v)。
[0031]在正己醇/緩沖液(50mM，pH7.0)雙相體系中，固定兩相體積比為l:l(v/v)，分別加入rac-S0(全體積濃度為90g/L)和不同量的實施例2制備的reAuEH2酶液(全體積濃度為15g/L、9g/L、6g/L和3g/L)使得底物質量與酶的質量比例值分別為6、10、15和30(?/?)，在25°(:和220印111條件下反應。當底物質量與酶質量比例值值為6、10和15(w/w)時，(S)-SO的ee值均>98%，反應時間分別為1.5h、3h和8h，時空產率分別為21.6g/L/h、10.8g/LA^P4.1g/L/h。當底物質量與酶質量比例值值為6(w/w)時，時空產率最高，本發明選擇底物質量與酶質量比例值為6(w/w)作為最適的底物量/酶量比率。然而，若考慮生物催化劑reAuH12的成本，可減少reAUEH2酶量的添加，延長反應時間，在實際生產過程，可根據實際生產成本調節底物量/酶量比率。
[0032]在正己醇/緩沖液(50mM，pH7.0)雙相體系中，固定兩相體積比為l:l(v/v)，分別加入rac-SO(終濃度為90g/L)和實施例2制備的reAuH12酶液(終濃度為15g/L)，底物質量與酶質量比例值為6(w/w)，分別在4°C、10°C、25°C和35°C和220rpm條件下反應。當反應溫度為350C，(S)-SO的ee值最高僅為33.2%,當反應溫度4 °C、10°C、25°C時，(S)-SO的ee值均>98%，其得率分別為40%、38%和36%，反應時間分別為1.511、311和711，時空產率分別為21.68/17h、17.1g/L/h、5.1g/L/h。盡管隨著溫度的降低，reAuEH2的對映選擇性提高，(S)-SO的得率從36 %提供至40 %，但反應時間延長，從而降低時空產率。可選擇常溫250C作為最適的反應溫度。
[0033]實施例6利用reAuEH2水解動力學拆分rac-SO制備(S)-SO
[0034]1.2g rac-SO溶解在5mL正己醇中，加入5mL reAuEH2酶液(40mg/mL)，添加酶的質量為0.2g，至終體積為1mL，底物質量與酶質量比例值為6，在25°C^P220rpm條件下反應，用手性氣相色譜監測(S)-SO的ee值反應2h后，獲得產物(S)-SO的得率為34.2%，ee值為98.3%,時空產率高達20.3g/L/h，實現了高濃度rac-S0(120g/L，1M)水解動力學拆分制備手性純(S)-S0。
[0035]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1.一種制備(S)-環氧苯乙烷的方法，其特征在于，構建有機/水雙相體系，所述有機相是正戊醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正己烷、環己烷、正庚烷和正辛烷中的一種或幾種的混合;所述水相是水或緩沖液溶液，其PH為6.0?9.5;有機相與水相的體積比是1:9至9:1;反應體系中底物與環氧化物水解酶的質量比例是30?I，底物的添加量是2.4g/L至120g/L，反應溫度O?35 °C。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述環氧化物水解酶的基因來源于宇佐美曲霉。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，有機相為正己醇，水相為pH7.0的磷酸鹽緩沖液，有機相與水相的體積比1:1。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，底物濃度120g/L，底物與酶的質量比例為6:1。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，反應溫度為25°C。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶的制備是收集產環氧化物水解酶的全細胞濕菌體，洗滌懸浮，超聲破碎后離心收集上清液，過濾得到酶液。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，酶液進一步凍干得到凍干酶粉，或進一步純化獲得的純酶。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，用產環氧化物水解酶的全細胞替代酶，產環氧化物水解酶的全細胞可以是產來源于宇佐美曲霉的環氧化物水解酶的大腸桿菌基因工程菌。
【文檔編號】C12P17/02GK105969837SQ201610535106
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月7日
【發明人】鄔敏辰, 胡蝶, 王瑞, 葉慧華, 唐詩涵, 李劍芳
【申請人】江南大學