抗草甘膦基因篩選方法、epsps突變基因和缺陷型菌株及應用

抗草甘膦基因篩選方法、epsps突變基因和缺陷型菌株及應用
【專利摘要】本發明公開了一種抗草甘膦基因篩選方法、EPSPS突變基因和缺陷型菌株及應用，該篩選方法可對與草甘膦感受相關的基因，包括植物基因進行克隆，多方位加速誘變，高通量抗草甘膦性能篩選，從而快速進化出能高度抗草甘膦的基因。該篩選方法利用細菌生長繁殖快、易培養的特點，能夠快速使植物和其他來源的基因進化成為具有草甘膦抗性的突變基因。
【專利說明】
抗草甘麟基因篩選方法、EPSPS突變基因和缺陷型菌株及應用
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物技術領域，具體而言，涉及抗草甘膦基因篩選方法、EPSPS突變基 因和缺陷型菌株及應用。
【背景技術】
[0002] Glyphosate是由美國孟山都公司研發，是一種葉面噴施，廣效，非選擇性的系統性 草甘膦。其主要成分草甘膦發揮作用的途徑是抑制植物體內莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽 草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)活性，使受害植株不能持續合成必需氨基酸進而影響植物正常 生長乃至死亡。
[0003] Glyphosate是一種廣譜的草甘膦除草劑，對幾乎所有植物都有殺傷性，現市場上 最常用的抗草甘膦基因為CP4基因，是孟山都公司從農桿菌中分離出的對草甘膦強抗性的 基因。植物可以通過轉基因的方式獲得這種抗性。因為能抗草甘膦的農作物為農業和環境 帶來明顯效益，含CP4基因的玉米、大豆品種在過去20年得到了大面積推廣。但生產應用中 仍然不斷需要新的抗草甘膦基因和以此為基礎的抗草甘膦作物品種。
[0004] 用基因編輯技術創造非轉基因抗草甘膦植物最好要有能抗草甘膦的植物EPSPS基 因。以CP4為代表的的微生物EPSPS基因雖能提供草甘膦抗性，即使將這類基因用基因修飾 的方法轉入植物，但因為來自不同物種，仍有轉基因之嫌，難以得到社會普通大眾的認同， 公眾對這里轉基因作物的認識有偏見，某種程度阻礙轉基因技術的發展和普及。因此，打造 能高抗草甘膦的植物EPSPS基因是非轉基因抗草甘膦農作物的一個關鍵。
[0005] 從理論上講，植物本身的EPSPS基因可以用化學、輻射或其他方法進行誘變，在一 定的草甘膦壓力下篩選具有抗性的植株。事實上，在多年大量使用草甘膦的情況下，一些雜 草已經進化了對草甘膦的抗性;其中多數為EPSPS基因的改變。但這些改變多為基因拷貝數 的增加，而且抗性不是很高，難于用在農作物上。農作物本身EPSPS基因也有突變產生草甘 膦抗性的例子，但抗性不如CP4。為創造能高抗草甘膦的非轉基因農作物，繼續誘變、篩選農 作物或其他植物EPSPS基因抗性基因勢在必行。
[0006] 但是，現有的從農作物或其他植物中篩選具有草甘膦抗性的突變基因的方法需要 先對植株進行誘變處理得到大量的突變體植物，再對這些突變體植株進行抗性篩選，得到 具有草甘膦抗性的突變植株，通過對抗性植株的基因組檢測分析，最后得到具有草甘膦抗 性的突變基因。由于植物生長的周期長，種植大量的突變體植株不僅耗費的時間長且需要 的土地面積也非常龐大。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于提供一種具有草甘膦抗性的突變基因的篩選方法，此篩選方法 能夠快速地篩選得到來自植物的外源基因的突變基因，該篩選方法篩選得到的突變基因具 有草甘膦抗性。
[0008] 本發明的再一目在于提供一種突變基因，該突變基因由上述篩選方法篩選得到， 其具有草甘膦抗性。
[0009] 本發明的又一目在于提供上述突變基因的應用，以使得轉化該突變基因的植物具 有草甘膦抗性。
[0010] 本發明的又一目在于提供一種用于篩選具有草甘膦抗性的突變基因的模型菌，此 模型菌不能表達EPSPS，也不具有裂解草甘膦的功能。
[0011] 本發明的又一目在于提供上述模型菌在測試植物來源的EPSPS基因的功能中的應 用。
[0012] 本發明的又一目在于提供上述模型菌在測試植物來源的EPSPS基因對草甘膦的抗 性中的應用。
[0013] 本發明的又一目在于提供上述模型菌在測試植物來源的突變體EPSPS基因對草甘 膦抗性中的應用。
[0014] 本發明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現的。
[0015] -種抗草甘膦基因篩選方法，其包括：
[0016] 采用基因敲除技術敲除源菌株的干擾基因，得到缺陷型菌株，源菌株來自大腸桿 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一種，干擾基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，缺陷型菌株 為EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株；
[0017] 先將外源EPSPS基因導入缺陷型菌株中，再經誘變處理后，得到含有外源EPSPS突 變基因的第一突變菌，外源EPSPS基因來自目的植物；
[0018] 或者先將外源EPSPS基因經突變處理，得到外源EPSPS突變基因，再將外源EPSPS突 變基因導入缺陷型菌株，得到第二突變菌；
[0019] 將第一突變菌或第二突變菌置于含有草甘膦的篩選培養基上進行篩選培養，得到 具有草甘膦抗性的單克隆抗性菌；
[0020] 對單克隆抗性菌進行測序驗證，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突變基因。
[0021 ]本發明提供的抗草甘膦基因篩選方法、EPSPS突變基因和缺陷型菌株及應用的有 益效果是：相對于現有的從植物中篩選具有草甘膦抗性的突變基因的篩選方法，本發明的 篩選方法通過構建EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株，再以該EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株為 宿主菌，將來自目的植物的外源EPSPS基因導入到該缺陷型菌株中，得到含有外源EPSPS突 變基因的突變菌即外源EPSPS基因突變體庫，再從該外源EPSPS基因突變體庫中篩選出具有 草甘膦抗性的EPSPS突變基因。由于細菌的繁殖速度快，體積小，因此，本發明的篩選方法克 服了現有篩選方法中存在的周期長、占地面積大的問題，使得本發明的篩選方法在定向篩 選出具有草甘膦抗性的EPSPS基因的周期短，占地面積非常小，周期短操作簡單等特點。且 本發明的篩選方法以EPSPS和C-P Lyase缺陷型的菌株作為宿主菌，有效地排出了宿主菌本 身的EPSPS基因和C-P Lyase基因的突變而產生草甘膦抗性的情況，使得篩選出的結果更可 具科學性，更可靠。
【附圖說明】
[0022]為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附 圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發明的某些實施例，因此不應被看作是對 范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這 些附圖獲得其他相關的附圖。
[0023]圖1為本發明實施例的pADV5載體結構圖；
[0024]圖2為本發明實施例的pKD46載體結構圖；
[0025]圖3為本發明實施例1的水稻EPSPS突變基因與野生型水稻EPSPS基因的序列比較 分析結果；
[0026]圖4為本發明實施例2的大豆EPSPS突變基因與野生型大豆EPSPS基因的序列比較 分析結果。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發明實施例的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明實施例中 的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建 議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產 品。
[0028] 下面對本發明的抗草甘膦基因篩選方法、EPSPS突變基因和缺陷型菌株及應用進 行具體說明。
[0029] -種抗草甘膦基因篩選方法，其包括：
[0030] 步驟S1:構建缺陷型菌株
[0031] 采用基因敲除技術敲除源菌株的干擾基因，得到缺陷型菌株，源菌株來自大腸桿 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一種，干擾基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，缺陷型菌株 為EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株。
[0032] 也就是說，EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株為大腸桿菌DH5a、T0P10以及BL21中的一 種經敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后得到的缺陷型菌株。該EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌 株的特點是:無法在不含氨基酸或蛋白的基礎培養基也可稱之為限制性培養基中生長，但 在導入外源EPSPS基因后能在只含糖的基礎培養基上生長。
[0033]敲除源菌株也就是敲除野生型大腸桿菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因的作用如 以下說明。
[0034]由于大腸桿菌的內源的EPSPS基因能夠表達EPSPS5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成 酶(EPSPS)，且C-P Lyase基因也能夠表達裂解C-P鍵的C-P裂解酶，該C-P裂解酶能夠裂解草 甘膦。因此，如果以野生型的大腸桿菌作為宿主菌，在后續的誘變處理步驟中，宿主菌內源 的EPSPS基因和C-P Lyase基因也可能發生突變，產生具有抗草甘膦內源的EPSPS突變基因 和裂解能力加強的C-P Lyase突變基因，賦予宿主菌草甘膦抗性，導致無法明確篩選得到單 克隆抗性菌具有的草甘膦抗性是外源EPSP突變基因賦予的還是其內源的EPSPS突變基因的 和C-P Lyase突變基因賦予的。因此，在以大腸桿菌作為宿主菌時，需要敲除其內源的EPSPS 基因和C-P Lyase基因，確保其最終得到的單克隆抗性菌的草甘膦抗性是由外源EPSPS突變 基因賦予的，使得篩選的結果更科學、更合理、更可靠。
[0035]當然，敲除大腸桿菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因的基因敲除技術很多，如例如 FRT法、pCas系統、利用pKD46系統或利用同源PCR片段直接敲除法等。在大腸桿菌基因組序 列信息清楚的情況下，采用上述方法均能夠較容易地敲除其基因組上的EPSPS基因和C-P Lyase基因。
[0036] 步驟S2:構建外源EPSPS基因突變體庫
[0037] 一種構建策略是，以缺陷型菌株作為宿主菌，先將外源EPSPS基因導入缺陷型菌株 中，再經誘變處理后，得到含有外源EPSPS突變基因的第一突變菌。其中，較佳地，誘變處理 為化學誘變處理或輻射誘變處理。化學誘變處理例如采用EMS或DES等化學誘變劑對第一突 變菌進行誘變處理，以使外源EPSPS基因隨著宿主菌的增殖發生突變。
[0038]另一種構建策略是，先將外源EPSPS基因經突變處理，得到外源EPSPS突變基因，再 將外源EPSPS突變基因導入缺陷型菌株，得到第二突變菌。其中，突變處理是以外源EPSPS基 因為模板采用錯配PCR法或DNA Shuff 1 ing法進行PCR得到的PCR產物即為外源EPSPS突變基 因。
[0039]需要說明的是，其中第一突變菌或第二突變菌均含有外源EPSPS突變基因，第一突 變菌或第二突變菌均為外源EPSPS基因突變體庫。
[0040] 其中，術語"第一"、"第二"僅用于區分描述的目的，而不能理解為指示或暗示相對 重要性。
[0041] 上述步驟所用的外源EPSPS基因來自目的植物，目的植物為水稻、大豆、小麥、玉 米、大麥、高粱、煙草、棉花、甘薯、楊樹、馬鈴薯、白菜、甘藍或青椒。在實際的篩選過程中，可 根據實際需求選擇。
[0042] 步驟S3:抗性篩選
[0043]將在步驟S2中得到外源EPSPS基因突變體庫第一突變菌或第二突變菌置于含有草 甘膦的篩選培養基上進行篩選培養，得到具有草甘膦抗性的單克隆抗性菌。需要說明的是， 該單克隆抗性菌也就是在篩選培養基上長出的菌落，也可以稱之為陽性轉化子。當然，陽性 轉化子的數量的情況有多種，例如有一個陽性轉化子或多個陽性轉化子。
[0044]其中，篩選培養基為含有不同草甘膦濃度的M9基礎培養基。
[0045] 步驟S4:測序驗證
[0046]取在步驟S3中得到的單克隆抗性菌進行測序驗證，得到具有草甘膦抗性的EPSPS 突變基因。
[0047] 以下結合實施例對本發明的特征和性能作進一步的詳細描述。
[0048] 實施例1
[0049] 本實施例以目的植物為水稻(Oryza sativa)、外源EPSPS基因為水稻EPSPS基因 (其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）、以采用同源PCR片段直接敲除法敲除野生型的大腸桿 菌DH5a中的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株為宿主菌為 例，來對本發明的篩選方法進行更詳細的說明，本實施例所用引物名稱及其核苷酸序列見 表1。
[0050] 第一步，采用同源PCR片段直接敲除大腸桿菌DH5a中的EPSPS基因和和C-P Lyase 基因。
[0051 ] 1.敲除大腸桿菌DH5a的c-p Lyase基因
[0052] (1)同源PCR片段擴增
[0053]用正向引物CPF2、反向引物CP5HA3(見表1)，以野生型的大腸桿菌DH5a為模板進行 PCR，膠回收，獲得PCR產物，命名為CP5HA片段，長度為525bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.13 所示。
[0054]表1.本實施例所用引物及其核苷酸序列
[0057]用正向引物以CP3HA5為、反向引物CPR2，以大腸桿菌DH5a為模板進行PCR，膠回收， 獲得PCR產物，命名CP3HA片段，長度為503bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.14所示。
[0058]用正向引物SPEC5，反向引物SPEC3，以含有如SEQIDN0.2所示的核苷酸序列的載 體(該載體命名為PCPSG7)為模板進行PCR，膠回收，獲得PCR片段，命名為SPEC片段，長度為 900bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.15所示。
[0059] 用CPF2和CPR2為引物，以CP5HA片段，SPEC片段和CP3HA片段為模板進行PCR(在同 一反應體系中進行），膠回收，獲得PCR產物，命名為CP5HA-SPEC-CP3HA片段，長度為1849bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 16所示。其中，第1位~第525位為大腸桿菌PhnA基因 5末端及其 上游序列，第526位~第1346位的核苷酸序列為Spectinomycin抗性基因及其啟動子，第 1347位~第1849位為大腸桿菌PhnH基因 3末端及其下游序列。
[0060] (2)熱擊轉化
[0061 ]按常規方法制備得到大腸桿菌DH5a感受態細胞。將lOOyL大腸桿菌DH5a感受態細 胞與5yL CP5HA-SPEC-CP3HA片段輕柔混合，置于冰上10min，42°C熱擊90s，立即轉入冰上 2min〇
[0062] 迅速加入lmL LB液體培養基(含50yg/mL的Spec(spectinomycin、奇放線菌素））， 在37°C培養lhr后涂布于LB固體培養基(含50yg/mL的Spec)上，在37°C過夜培養。
[0063]培養后的大腸桿菌DH5a利用正向引物SPE35和反向引物CPR0檢測后，該菌株命名 為EDC，EDC為敲除C-P Lyase基因的大腸桿菌DH5a。
[0064] 2.敲除EDC(敲除C-P Lyase基因的大腸桿菌DH5a)的EPSPS基因
[0065] (1)同源PCR片段擴增
[0066]以野生型的大腸桿菌DH5a為模板，用正向引物EE5-1K和反向引物ES5HA3，進行 PCR，膠回收，獲得PCR產物，命名為ES5HA片段，長度為1194bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 17所示。
[0067]以大腸桿菌DH5a為模板，用正向引物ES3HA5和反向引物EE3-1K進行PCR，膠回收， 獲得PCR產物，命名為ES3HA片段，長度為1168bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.18所示。
[0068]用正向引物GM5L和反向GM3L，以含有如SEQIDN0.3所示的核苷酸序列的載體(該 載體命名為PCPSG5)為模板進行PCR，膠回收，獲得PCR產物，命名為GM片段，長度為1050bp， 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 19所示。
[0069] 以EE5-1K和EE3-1K為引物，ES5HA片段，GM片段和ES3HA片段為模板進行PCR，膠回 收，獲得PCR產物，命名為ES5HA-GM-ES3HA片段，長度為3322bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 20所示。其中，第1位~第1194位為大腸桿菌EPSPS基因上游序列，第1195位~第2154位 的核苷酸序列為慶大霉素抗性基因及其啟動子，第2155位~第3322位為大腸桿菌EPSPS基 因下游序列。
[0070] (2)熱擊轉化
[0071] 按常規方法制備得到EDC感受態細胞。將lOOyLEDC感受態細胞與5yL ES5HA-GM-ES3HA片段輕柔混合，置于冰上10min，42°C熱擊90s，立即轉入冰上2min;迅速加入lmL LB液 體培養基，在37 °C培養lhr后涂布于含有Spec (50μg/ml)和Gm( 50μg/ml)的LB固體培養基(含 50μg/ml Spec和50μg/ml的Gm)上，在37°C過夜培養。
[0072] 以正向引物EE5-1K和GM3L、反向引物EE3-1K和ECES35U檢測培養后的菌株，并將該 菌株命名為EDCE。EDCE為敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后的大腸桿菌DH5a，也就是EPSPS 和C-P Lyase缺陷型菌株。
[0073]當然，也可其他常規的敲擊敲除方法例如采用pCas系統敲除大腸桿菌DH5a中的 EPSPS基因和C-P Lyase基因，或采用pKD46系統敲除大腸桿菌DH5a中的EPSPS基因和和C-P Lyase基因。
[0074]第二步，以在第一步步驟中得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作為宿主菌，將 來自水稻的EPSPS基因導入該宿主菌中，得到突變菌即水稻EPSPS基因突變體庫。具體操作 如下。
[0075] 1.利用錯配PCR法構建EPSP基因突變體庫
[0076]采用常規方法將水稻EPSPS基因的mRNA反轉錄成cDNA并克隆到pADV5載體(其結構 如圖1所示）。
[0077]用正向引物PV325和反向引物PV323,以連接有水稻EPSPS基因的pADV5載體模板進 行第一輪錯配PCR，該PCR反應體系包括：25.3yL的H20、4yL的易錯PCR MIX、4yL的易錯PCR dNTP、4yL的MnCl2、0 · 8yL的PV325、0 · 8yL的PV323、0 · lyL的Taq酶、2yL的模板。該PCR反應程 序：95°C，30秒；60°C，30秒；72°C，2分鐘；40個循環PCR產物經1 %瓊脂糖電泳，然后切膠回 收，得到第一輪PCR產物。
[0078]以上述第一輪PCR產物為模板，用正向引物2M1H、反向引物2M1T，進行第二輪PCR。 PCR體系為：31 ·9yL的H20、2·5yL的DMS0、5yL的lOxPCR buffer、5yL的dNTP、4yL的MgCl2、0·5μ L的2M1H、0 · 5yL的2M1T、0 · lyL的Taq酶、0 · 5yL的模板。該PCR反應程序：95 °C，30秒；60°C，30 秒;72 °C，2分鐘;60個循環
[0079] 對獲得的PCR產物進行1%瓊脂糖電泳，與目的條帶大小（1.5kb)-致的條帶進行 膠回收純化，對純化后產物進行Pacl和Sbfl雙酶切，然后連接到經同樣雙酶切后的新的 PADV5載體上，獲得連接產物。此步驟得到連接產物為攜帶有水稻EPSPS突變基因的pADV5載 體。
[0080] 當然，也可以采用DNA Shuffling法獲得攜帶有水稻EPSPS突變基因的PADV5載體， 其具體操作如下。
[0081 ] DNA Shuffling法獲得攜帶有水稻EPSPS基因的基因突變體的PADV5載體:①以水 稻EPSPS基因序列進行PCR擴增，擴增產物用1 %瓊脂糖電泳，然后膠回收純化;②對回收產 物用DNase酶進行消化，消化完后跑1.2%瓊脂糖電泳，切下100bp、200bp或300bp大小的片 段做膠回收純化;③以第②步中的膠回收產物3yL做模板，進行gene shuffling第一輪PCR， 此輪PCR中不加任何引物，擴增60個循環;④取10yL第3步PCR產物跑電泳，觀察是否有連續 范圍的大片段，如符合預期，余下PCR產物則作為模板進行下一輪PCR;⑤取第③步的PCR產 物0.5yL做模板，進行下一輪PCR，此輪PCR引物為設計好帶有酶切位點的引物，擴增60個循 環;⑥取第⑤步PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，切下大于500bp的單一條帶做膠回收純化； ⑦用限制性內切酶雙酶切第⑥步的膠回收產物，雙酶切后用1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的 片段，用液氮冷凍后擠膠水，然后與同樣雙酶切后的PADV5載體連接。得到多個攜帶有水稻 EPSPS基因的基因突變體的pADV5載體。
[0082] (2)轉化EDCE(敲除EPSPS基因和C-P Lyase基因后的大腸桿菌DH5c〇
[0083] 按常規方法制備EDCE感受態細胞。將上述連接產物（攜帶水稻EPSPS突變基因的 PADV5載體)加入到50yL EDCE感受態細胞中，充分混勻置于冰上30min;42°C熱激90s，冰浴 2min后加入LB液體培養基500yL; 37 °C低速（150r/min)振蕩培養90min。
[0084] 攜帶有水稻EPSPS突變基因的pADV5載體轉化到EDCE中，即得到突變菌，也就是水 稻EPSPS基因突變體庫。該水稻EPSPS基因突變體庫含有水稻EPSPS突變基因的數量也非常 多。其中，每一個突變菌就相當于一個水稻EPSPS基因突變體植株。因此，若篩選相同數量級 的水稻EPSPS突變基因，相對于現有的篩選方法，本發明的篩選方法不用經過水稻的培養周 期和所占用的土地面積，其所用時間和效率以及操作過程都非常快捷、簡單，尤其是占地面 積非常小，僅在培養基上就可完成篩選工作。
[0085]第三步，將上述突變菌接種至篩選培養基上進行抗性篩選。
[0086]將上述得到的多個突變菌分別接種于多個含有不同草甘膦濃度的篩選培養基上 (篩選培養基相互之間含有的草甘膦濃度有所差別，其含草甘膦的濃度分別是10mM、20mM、 50mM等具有濃度梯度差別的草甘膦，當然草甘膦的濃度可以根據實際情況設定），于3rc、 過夜培養。其中，篩選培養基是以M9為基礎培養基，再添加一定濃度的抗生素 Spec (5卩6〇1:;[1101115^;[11、奇放線菌素）、6611(6611丨31115^;[11、慶大霉素）、41]^)(41]^)；[0;[11;[11、氨節青霉 素）以及不同濃度的草甘膦得到的培養基。M9培養基的成分如下：Na 2HP04 13~14g/L、 KH2PO45 · 7~6 · 3g/L、NaCl 0 · 9~1 · lg/L、NH4Cl 1 · 8~2 · 2g/L、葡萄糖37~43g/L、MgS04 · 7H2O 48~52g/L、CaCh 21 ~23g/L。
[0087] 第四步，測序驗證。
[0088]挑選、分離在篩選培養基上長出的單克隆抗性菌，檢測其草甘膦抗性，并測序驗 證，得到具有草甘膦抗性的水稻EPSPS突變基因的序列。以其中一個水稻EPSPS突變基因進 行說明，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，由1365個堿基組成。將該水稻EPSPS突變基因 (命名為OsEM基因），與野生型的水稻EPSPS基因（命名為OsE基因）的核苷酸序列（如SEQ ID NO. 1所示)及其編碼的氨基酸序列進行比較，結果如圖3所示。該水稻EPSPS突變基因自5'端 至3'端的第209位堿基由"C"突變為"G"，第240位堿基由"T"突變為"C"，第346位和第347位 連續兩個堿基"CT"突變為"TC"，第396位堿基"T"突變為"C"，第453為堿基"A"突變為"G"，第 606位堿基"C"突變為"T"，第831位堿基"A"突變為"G" ；其中，只有第209位堿基由"C"突變為 "G"，導致其編碼的氨基酸殘基序列自氨基端至羧基端第70位由丙氨酸殘基突變為甘氨酸 殘基，以及第346位和第347位連續兩個堿基"CT"突變為"TC"，導致其編碼的氨基酸殘基序 列第116位由亮氨酸殘基突變為絲氨酸殘基，其余的堿基突變未導致其編碼的氨基酸殘基 發生改變。
[0089]水稻EPSPS突變基因的草甘膦抗性檢測，分別以轉化有OsEM基因（實驗組)和OsE基 因（對照組）的大腸桿菌(EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株)接種與含有OmM、lmM、5mM、10mM、 2〇11^、5〇11^、1〇11^濃度草甘膦的培養基中，觀察大腸桿菌的生長狀況（用生長飽和指數來表 示，飽和指數=0，沒有生長;飽和指數=1，少量生長;飽和指數=2，生長至半飽和;飽和指 數=3,旺盛生長，但還有生長余地;飽和指數=4,快速生長，細菌在培養基中已達最高（飽 和)濃度或者說生長已經達到極限）。結果如表2所示。
[0090] 表2.轉化OsEM基因和OsE基因的大腸桿菌在含不同濃度草甘膦培養基中的生長飽 和指數
[0091]
[0092]由表2可知，在含OmM草甘膦的培養基上實驗組（含OsEM基因）和對照組（含OsE基 因）均能正常生長(飽和指數均為4);在含11^、51111、1〇111]\1、2〇111]\1、5〇111]\1草甘膦的培養基上，對 照組不能生長(飽和指數為0)，而實驗組能正常生長(飽和指數為4);在含500mM草甘膦的培 養基上，實驗組和對照組均不能正常生長(飽和指數為0)。由此表明，本實施例篩選得到水 稻EPSPS突變基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示）能夠賦予EPSPS和C-P Lyase缺陷型 的大腸桿菌草甘膦抗性，使大腸桿菌在高達50mM草甘膦的培養基中生長。
[0093]采用本發明本實施例提供的抗草甘膦基因篩選方法所篩選得到的具有草甘膦抗 性的突變基因例如水稻EPSPS突變基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 4所示，其具有抗50mM 草甘膦的抗性。
[0094]直接采用本發明本實施例提供的抗草甘膦基因篩選方法所篩選得到的具有草甘 膦抗性的突變基因例如水稻EPSPS突變基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 4所示)轉化水稻 或大豆或其他植物，以使轉化的植物具有了草甘膦抗性。當然，可采用基因工程領域常用的 轉化方法例如農桿菌介導法、基因槍法、原生質體介導法、電擊法或整體水平的轉化方法等 轉化水稻或大豆或其他植物，以使轉化的植物具有草甘膦抗性。
[0095] 實施例2
[0096]本實施例以目的植物為大豆(Glycine max)，外源基因為大豆EPSPS基因（其核苷 酸序列如SEQ ID如.5所示）、以采用同源?1?1'方法直接敲除法敲除野生型的大腸桿菌0耶(1 中的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株為宿主菌為例，來對 本發明的篩選方法進行說明，本實施例所用引物名稱及其核苷酸序列見表3。
[0097] 第一步，敲除大腸桿菌DH5a的C-P Lyase基因。
[0098] 利用FRT的方法敲除大腸桿菌DH5a菌株中的EPSPS基因和C-P Lyase基因，分兩步 敲除，先敲除C-P Lyase基因，后敲除EPSPS基因。
[0099] 1.含pKD46質粒的大腸桿菌DH5a感受態細胞的制備
[0100]取〇.5yL的pKD46質粒(其結構如圖2所示），轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，在LB培 養基平板(含Amp 100)上篩選出陽性菌落；
[0101 ]挑陽性單克隆菌落，接種于小量M9-sucrose液體培養基(含鹿糖），于轉速180rpm、 30 °C下、培養過夜；
[0102]培養結束后，按1:10的比例接種于大量M9-Sucr〇se液體培養基(含蔗糖+100yg/mL Amp+10mM L-阿拉伯糖）中，于30°C培養至菌液的0D600至0.7左右；
[0103] 將上述菌液于冰上冷卻20min，于4°C、4000rpm下離心收集菌體；用40mL預冷的 10%&八)甘油重懸，重復洗滌3次后棄上清，用40(^1^預冷的10%的甘油重懸并分裝成10(^ L/管，得到具有Amp抗性的DH5a。
[0104] 2.敲除大腸桿菌DH5a的C-P Lyase基因
[0105] 用正向引物C-P Lyase_P15、反向引物C-P Lyase_P13(見表3)，以大腸桿菌DH5a基 因組為模板進行PCR擴增，得到P1片段，P1片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示；
[0106] 用正向引物C-P Lyase_P25、反向引物C-P Lyase_P23,大腸桿菌DH5a基因組為模 板進行PCR擴增，得到P2片段，P2片段的核苷酸序列如SEQIDN0.7所示；
[0107] 用1 %的瓊脂糖電泳純化P1和P2，得到純化的PCR產物，按比例加入含有Gen抗性片 段的質粒做成混合池，以此為模板，用正向引物C-P Lyase_P15和反向引物C-P Lyase_P23 為進行PCR擴增，得到PRC片段，長度為1586bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。
[0108] 將50yL大腸桿菌DH5a感受態細胞（具有Amp抗性的DH5a)與30yL純化后的PRC片段 輕柔混合，置于0.1 cm預冷的電擊杯中，用BiO-Rad電轉儀在1.8kV進行電擊；
[0109] 迅速加入lmL含10mM阿拉伯糖的M9_sucrose液體培養基，在30°C培養lh后涂布于 LB固體培養基(含100yg/mL的Amp和30yg/mL的Gen)上篩選出同時抗Amp和Gen的重組菌株， 在30 °C過夜培養；
[0110] 培養結束后，用正向引物c-p Lyase_5UTR和反向引物c-p Lyase_Gen3篩選含Gen 基因的陽性克隆，驗證Gen基因的存在；
[0111] 將陽性克隆接種于LB+Amp液體培養基，30°C過夜培養（12hr)，然后轉接至新鮮的 LB液體培養基，繼續30 °C培養12hr;
[0112] 將培養液稀釋至適當濃度，涂布LB平板，用正向引物C-P Lyase_5UTR和反向引物 Lyase_3DSR引物篩選無 Gen基因的克隆；
[0113] 挑單克隆測序，保存菌種，命名為DH46AC-P Lyase JMeAC-P Lyase為敲除C-P Lyase基因的大腸桿菌DH5。
[0114]表3.本實施例所用引物名稱及其核苷酸序列
[0116] 3.敲除DH46AC-P Lyase的（敲除C-P Lyase基因的大腸桿菌DH5c〇EPSPS基因
[0117] (1)DH46AC_P Lyase感受態細胞的制備
[0118] 取保存的DH46AC-P Lyase，在LB+Amp平板上劃線，30°C過夜培養;挑陽性單克隆 菌落，接種于小量M9-sucrose液體培養基，于轉速180rpm、30°C、培養過夜；
[0119] 培養結束后按1:10的比例接種于大量M9液體培養基(含蔗糖+100yg/mL Amp+10mM L_阿拉伯糖）中，于30°C培養至菌液的0D600為0.7;
[0120] 將上述菌液（含DH46AC-P Lyase)冰上冷卻20min，于4°C、4000rpm下離心收集菌 體；用40mL預冷的10 % (v/v)甘油重懸，重復洗滌3次后棄上清，用400yL預冷的10 %的甘油 重懸并分裝成1〇〇此/管。
[0121] (2)同源PCR片段擴增
[0122] 用正向引物EcEPSPS_P35、反向引物EcEPSPS_P33以DH46AC-P Lyase菌株基因組 DNA為模板擴增，得到產物P3片段，P3片段的核苷酸序列如SEQIDN0.8所示；
[0123] 用正向引物EcEPSPS_P45、反向引物EcEPSPS_P43,以DH46AC-P Lyase基因組DNA 為模板擴增，得到產物P4片段，P4片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；
[0124] 用1%的瓊脂糖電泳純化P3片段和P4片段，按比例加入含有Gen抗性片段的質粒做 成混合池，以此為模板，用EcEPSPS_P35和EcEPSPS_P43為引物進行擴增，得到產物PRE片段， 長度為1607bp，其核苷酸序列如SEQIDN0.22所示。
[0125] (3)熱擊轉化
[0126] 將50yL DH46AC-P Lyase感受態細胞與35yL純化后的PRE片段輕柔混合，置于 0. lcm預冷的電擊杯中，用Bio-Rad電轉儀在1.8kV進行電擊；
[0127] 迅速加入lmL含10mM阿拉伯糖的M9_sucrose液體培養基，在37°C培養lhr后涂布于 LB固體培養基上篩選重組菌株，在30°C過夜培養;次日，用EcEPSPS_P35和EcEPSPS_P43引物 篩選含Gen基因的陽性克隆驗證Gen基因的存在。
[0128] 將陽性克隆接種于LB液體培養基，37°C過夜培養（12hr)，然后轉接至新鮮的LB液 體培養基，繼續37 °C培養12hr;
[0129] 將培養液稀釋至適當濃度，涂布LB平板，用正向引物EcES25和反向引物正向引物 EcES23篩選無 GM基因的克隆；
[0130] 挑單克隆測序，保存菌種，命名為 DH5aAPhnFGHAEPSPS，DH5aAPhnFGHAEPSPS 為 敲除c-p Lyase基因和EPSPS基因的大腸桿菌DH5a，也就是EPSPS和c-p Lyase缺陷型菌株。
[0131] 需要說明的是，DH5aAPhnFGHAEPSPS是不帶抗生素基因的缺陷型菌株。大腸桿菌 DH5a的大部分PhnF、全部PhnG和部分PhnH與降解草甘膦為代表的膦酸酯類物質有關的基因 被敲除。FRT DNA片段的5末端連接的上游序列以及其3末端連接的下游序列的核酸片段的 核酸序列片段如SEQ ID 11所示。其中，第1位~第318位為大腸桿菌PhnF基因5末端及其上 游序列，第319位~第347位的核苷酸序列為FRT片段，第348位~第1021位為大腸桿菌PhnH 基因3末端及其下游序列。此外，DH5aAPhnFGHAEPSPS中的EPSPS基因的大部分被FRT片段 替換，如SEQ ID12所示，其中，第1位~第357位為大腸桿菌EPSPS基因5末端序列，第358位~ 第386位為FRT片段，第387位~第818位為大腸桿菌EPSPS基因3末端序列。
[0132] 第二步，以在該實施例第一步步驟中得到EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作為宿主 菌，將來自大豆的大豆EPSPS基因導入該宿主菌中，得到突變菌即大豆EPSPS基因突變體庫。
[0133] 采用常規方法，將大豆EPSPS基因克隆到pADV5載體，再將pADV5載體轉化DH5aA PhnFGHAEPSPS 宿主菌。
[0134] 轉化后的DH5aAPhnFGHAEPSPS接種至MA液體培養基（M9基礎培養基+100yg/mL Amp)中，在37 °C、300r/min條件下培養過夜；
[0135] 將生長至渾濁的菌液，采用輻射誘變處理例如紫外下照射2-5min，以使大豆EPSPS 基因突變得到相應的大豆EPSPS突變基因，即得到突變菌即大豆EPSPS基因突變體庫。當然， 此步驟也可采用化學誘變處理即往MA培養基中加入化學誘變劑例如EMS或DES等，以使大豆 EPSPS基因發生突變。
[0136] 第三步，篩選培養。
[0137] 取5yL上述含有突變菌的菌液加入到篩選培養基中，繼續在300r/min、37°C下培養 過夜。
[0138] 第四步，測序驗證。
[0139] 挑選、分離在篩選培養基上長出的單克隆抗性菌，檢測其草甘膦抗性，并測序驗 證，得到具有草甘膦抗性的大豆EPSPS突變基因的序列。
[0140] 以其中一個大豆EPSPS突變基因進行說明，其核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示，由 1368個堿基組成。將該大豆EPSPS突變基因（命名為GmEM基因），與野生型的大豆EPSPS基因 (命名為GmE基因）的核苷酸序列（如SEQ ID N0.5所示)及其編碼的氨基酸序列進行比較，結 果如圖4所示。該大豆EPSPS突變基因自5'端至3'端的第6位至第8位之間插入了堿基"G"以 及第45位與第46位之間缺失了堿基"A"，導致第7位至第44位的堿基發生了移碼突變，相應 的該區段所編碼的氨基酸殘基序列自氨基酸至羧基端第3位至第15位也發生了突變(如圖4 所示）；此外，第629位堿基由"A"突變為"T"，導致氨基酸殘基序列的第210位氨基酸殘基由 谷氨酸殘基突變為纈氨酸殘基;第1110位堿基由"A"突變為"G"，第1125位堿基由"T"突變為 Τ'，該兩個位點的堿基突變均未導致其相應編碼的氨基酸殘基發生突變。
[0141] 大豆EPSPS突變基因的草甘膦抗性檢測，分別以轉化有GmEM基因（實驗組)和GmE基 因（對照組）的大腸桿菌(EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株)接種與含有OmM、lmM、5mM、10mM、 20mM、50mM、10mM濃度草甘膦的培養基中，觀察大腸桿菌的生長狀況。結果如表4所示。
[0142 ]表4.轉化GmEM基因和GmE基因的大腸桿菌在含不同濃度草甘膦培養基中的生長飽 和指數
[0143]
[0144] 由表4可知，在含OmM草甘膦的培養基中，實驗組(含GmEM基因）和對照組(含GmE基 因）均能正常生長(飽和指數為4);但在含111^、511^、1〇11^、2〇11^、草甘膦濃度的培養基上，對 照組不能正常生長，而實驗組能正常生長(飽和指數為4);在含50mM草甘膦的培養基上，對 照組不能正常生長，而實驗組能旺盛地生長(飽和指數為3);在含100mM草甘膦的培養基上， 實驗組和對照組均不能正常生長（飽和指數都為0)。由此表明，本實施例篩選得到大豆 EPSPS突變基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0.10所示)能夠賦予EPSPS和C-P Lyase缺陷型的 大腸桿菌草甘膦抗性，使大腸桿菌在高達50mM草甘膦的培養基中生長。
[0145] 采用本發明本實施例提供的具有草甘膦抗性的突變基因的篩選方法所篩選得到 的具有草甘膦抗性的大豆EPSPS突變基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 10所示，其具有抗 50mM草甘膦的抗性。
[0146] 直接采用本發明本實施例提供的具有草甘膦抗性的突變基因的篩選方法所篩選 得到的具有草甘膦抗性大豆EPSPS突變基因（其核苷酸序列如SEQ ID N0 10所示），轉化大 豆或水稻或其他植物，以使轉化的植物具有了草甘膦抗性。
[0147] 實施例3
[0148] 本實施例提供了一種缺陷型菌株，具體地，該缺陷型菌株為EPSPS和C-P Lyase缺 陷型菌株。該EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株由采用基因敲除技術敲除大腸桿菌DH5a、T0P10 以及BL21中的任意一種大腸桿菌的EPSPS基因和C-P Lyase基因得到。具體地，本實施例所 用的基因敲除方法如實施例1或實施例2中所用基因敲除方法相同。
[0149] 本實施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株可在測試來自目的植物的EPSPS基 因的功能中進行應用。具體地，以本實施例的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作為宿主菌，將 目的植物的EPSPS基因導入到該宿主菌中，然后將宿主菌置于不含氨基酸或蛋白的基礎培 養基也就是限制性培養基中培養，如果觀察到限制性培養基上有正常的菌落生產則表明該 來自目的植物的EPSPS基因具有能夠表達EPSPS(5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶）的功 能，且EPSPS具有正常的生物活性。
[0150] 本實施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株還可在測試來自目的植物的EPSPS 基因對草甘膦的抗性中進行應用。具體地，以本實施例的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株作 為宿主菌，將目的植物的EPSPS基因導入到該宿主菌中，然后將宿主菌置于含有不同草甘膦 濃度的M9培養基上進行培養，例如在含有10mM、20mM、50mM草甘膦的M9培養基上進行培生 長，以測試該來自目的植物的EPSPS基因的草甘膦抗性。
[0151]本實施例提供的EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株可在篩選具有草甘膦抗性的來自 目的植物的EPSPS突變基因中進行應用。具體的使用方法可參見實施例1或實施例2提供的 篩選具有草甘膦抗性的EPSPS突變基因的方法。
[0152] 綜上，本發明實施例提供的的篩選方法通過構建EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株， 再以該EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株為宿主菌，將來自目的植物的外源EPSPS基因導入到 該缺陷型菌株中，得到含有外源EPSPS突變基因的突變菌即外源EPSPS基因突變體庫，再從 該外源EPSPS基因突變體庫中篩選出具有草甘膦抗性的EPSPS突變基因。由于大腸桿菌的繁 殖速度快，體積小，因此，本發明的篩選方法克服了現有篩選方法中存在的周期長、占地面 積大的問題，使得本發明的篩選方法在定向篩選出具有草甘膦抗性的EPSPS突變基因的操 作上具有周期短，占地面積非常小，周期短操作簡單等特點。且本發明的篩選方法以EPSPS 和C-P Lyase缺陷型的大腸桿菌作為宿主菌，有效地排出了宿主菌本身的EPSPS基因和C-P Lyase基因的突變而產生草甘膦抗性的情況，使得篩選出的結果更可具科學性，更可靠。篩 選出來自植物的EPSPS基因的基因突變體，能夠大大地提高篩選速度和時間，通常只需1~2 周時間即可完成篩選工作，得到具有草甘膦抗性的突變基因，減少篩選工作的成本。此外， 本發明提供的篩選方法所得到具有草甘膦抗性的突變基因能夠再用于轉化相應的植物品 種，克服目前的大部分只能轉來自微生物的抗性基因到農作物中的瓶頸現象，有助于消除 公眾對轉基因植物認識上的偏見，進而促進轉基因技術的發展和推廣。此外，本發明提供的 EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株能夠可在測試植物的EPSPS基因的功能中進行應用，也可以 在測試植物的EPSPS基因對草甘膦的抗性中進行應用，其應用方便，結果更科學更可靠。
[0153] 以上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技 術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種抗草甘膦基因篩選方法，其特征在于，其包括： 采用基因敲除技術敲除源菌株的干擾基因，得到缺陷型菌株，所述源菌株來自大腸桿 菌DH5a、TOP 10以及BL21中的一種，所述干擾基因包括EPSPS基因和c-p Lyase基因，所述缺 陷型菌株為EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株;先將外源EPSPS基因導入所述缺陷型菌株中，再 經誘變處理后，得到含有外源EPSPS突變基因的第一突變菌，所述外源EPSPS基因來自目的 植物； 或者先將所述外源EPSPS基因經突變處理，得到外源EPSPS突變基因，再將所述外源 EPSPS突變基因導入所述缺陷型菌株，得到第二突變菌； 將所述第一突變菌或所述第二突變菌置于含有草甘膦的篩選培養基上進行篩選培養， 得到具有草甘膦抗性的單克隆抗性菌； 對所述單克隆抗性菌進行測序驗證，得到具有草甘膦抗性的EPSPS突變基因。2. 根據權利要求1所述的抗草甘膦基因篩選方法，其特征在于，所述誘變處理為化學誘 變處理或輻射誘變處理。3. 根據權利要求1所述的抗草甘膦基因篩選方法，其特征在于，所述突變處理是以所述 外源EPSPS基因為模板，采用錯配PCR法或DNA Shuffling法進行PCR得到所述外源EPSPS突 變基因。4. 根據權利要求1所述的抗草甘膦基因篩選方法，其特征在于，所述目的植物為水稻、 大豆、小麥、玉米、大麥、高粱、煙草、棉花、甘薯、楊樹、馬鈴薯、白菜、甘藍或青椒。5. -種根據權利要求1~4任一項所述的抗草甘膦基因篩選方法所篩選得到的具有草 甘膦抗性的EPSPS突變基因。6. 根據權利要求5所述的EPSPS突變基因在轉化植物以使植物具有所述草甘膦抗性的 應用。7. -種缺陷型菌株，其特征在于，所述缺陷型菌株由源菌株經采用基因敲除技術敲除 干擾基因后得到，所述干擾基因包括EPSPS基因和C-P Lyase基因，所述源菌株選自大腸桿 菌DH5a、T0P10以及BL21中的一種，所述缺陷型菌株為EPSPS和C-P Lyase缺陷型菌株。8. 根據權利要求7所述的缺陷型菌株在測試來自目的植物的EPSPS基因的功能中的應 用。9. 根據權利要求7所述的缺陷型菌株在測試來自目的植物的EPSPS基因對草甘膦的抗 性中的應用。10. 根據權利要求7所述的缺陷型菌株在篩選具有草甘膦抗性的來自目的植物的EPSPS 突變基因中的應用。
【文檔編號】C12R1/19GK105969782SQ201610325692
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】王博雅, 盧遠根, 胥南飛
【申請人】四川天豫興禾生物科技有限公司