一種酪氨酸脫羧酶突變體及其基因和應用
【專利摘要】本發明公開了一種酪氨酸脫羧酶突變體及其基因和應用。該突變體是將短乳桿菌(Lactobacillus brevis)來源的具有如序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的酪氨酸脫羧酶在586位的絲氨酸被丙氨酸取代后得到。本發明所述酪氨酸脫羧酶突變體對底物酪氨酸的比活力是野生型酪氨酸脫羧酶的2.23倍，對底物的Km值為野生型酶的72.4％。所述酪氨酸脫羧酶突變體比野生型適于酪胺產品的制備，具有良好的工業開發前景。
【專利說明】
一種酪氨酸脫羧酶突變體及其基因和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種酪氨酸脫羧酶的突變體及其基因和 應用。
【背景技術】
[0002] 酪胺是一種自然存在的痕量單胺，是一種具有非常重要的化合物。在哺乳動物體 內，酪胺可通過促進腎上腺素的釋放進而增加由毛喉素介導的cAMP的生成和β腎上腺素介 導的脂解作用來發揮作用，因此酪胺在減肥產品中具有巨大的應用潛力。酪胺具有升高血 壓和興奮子宮等藥理作用，應用于生化試劑、有機化工及醫藥中間體，可用于治療偏頭痛和 診斷嗜鉻細胞瘤藥物的合成。此外酪胺還可用于制備降血脂藥物苯扎貝特，通過降低膽固 醇和甘油三酯含量達到降血脂的目的。研究發現酪胺具有類似胰島素的功能，它可以刺激 葡萄糖的轉運并可有效地治療II型糖尿病。酪胺及其衍生物還可有效降低黑色素的產生， 目前已被應用于化妝品行業。
[0003] 由于酪胺在醫藥、保健和化妝品行業的突出表現，酪胺的合成方法也備受關注。目 前，我國的酪胺還主要依靠進口，價格較高。已報道的酪胺制備方法中包括化學合成法、生 物發酵法和生物催化法。生物催化法集化學合成法、生物發酵法兩種酪胺生產方法的優點 于一體，具有反應條件溫和、周期短、操作簡單、副產物少、產物純化簡便、能耗低、環境污染 小等優點，因此更加符合"可持續發展"、"綠色化學"的理念，生物催化法生產酪胺具有廣闊 的發展前景。酪氨酸脫羧酶是一種依賴磷酸吡哆醛的氨基酸脫羧酶，它可以催化酪氨酸脫 羧生成酪胺并釋放出C0 2。目前市場上已有從糞腸球菌中分離純化的酪氨酸脫羧酶作為商 品化酶制劑在銷售(Sigma)。然而其價格較高，無法利用酪氨酸脫羧酶進行工業化的生物催 化反應。
[0004] 從短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.2028克隆得到的酪氨酸脫羧酶已 在大腸桿菌（Escherichia coli)中重組過量表達（Protein Expression and Purification，2014，94，33-39;CN103421734A)。然而關于該酪氨酸脫羧酶催化反應的關鍵 位點不明確，尚未有關于酪氨酸脫羧酶分子改造的研究報道。本發明通過解析獲得的短乳 桿菌酪氨酸脫羧酶的晶體結構，對酶底物結合口袋的氨基酸進行定點突變得到了對底物酪 氨酸的催化活性顯著提高的突變株，該突變株具有較可觀的工業應用價值。
【發明內容】
[0005] 因此，本發明提供了一種酶活力提高的酪氨酸脫羧酶突變體蛋白質及其基因，含 有該基因的重組表達載體和重組表達轉化體，含有該酪氨酸脫羧酶突變體蛋白質的細胞的 制備方法，以及該酪氨酸脫羧酶突變體蛋白質作為催化劑在催化酪氨酸脫羧反應，制備酪 胺中的應用。與野生型酪氨酸脫羧酶相比，本發明提供的酪氨酸脫羧酶突變體蛋白質對底 物酪氨酸具有更高的催化效率。
[0006] 本發明采取的技術方案之一是:一種分離的蛋白質，所述蛋白質是在具有如序列 表中SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的蛋白質中底物結合關鍵氨基酸為點經過取代一個氨基 酸且具有酪氨酸脫羧酶活性的衍生蛋白質。
[0007]其中所述的取代的位點較佳地為:序列表中SEQ ID No. 1所示氨基酸序列的第98 位、99 位、100 位、101 位、102 位、103 位、294位、297位、298位、299位、331 位、391 位、395位、396 位、397位、398位、505位、586位和第588位氨基酸中的一位。
[0008]其中所述蛋白質車父佳地為:將序列表中SEQ ID No . 1所不氣基酸序列的蛋白質的 第98~103位的氨基酸分別突變為丙氨酸(!1984、]\1994、附0(^、310認41024、1'1034);所述氨 基酸序列中第294位、297位、298位、299位、331位、391位、395位、396位、397位、398位、505位 和 588 位氨基酸分別突變為丙氨酸（V294A、S297A、T298A、E299A、Y331A、H391A、V396A、 P397A、Y398A、M505A、M588A);所述氨基酸序列中第295位的丙氨酸突變為苯丙氨酸 (A295F);所述氨基酸序列中第296位的甘氨酸突變為苯丙氨酸(G296F);所述氨基酸序列中 第586位的絲氨酸分別突變為其它19種標準氨基酸，其中更佳地為突變為丙氨酸(S586A)。
[0009] 本發明所述蛋白質的制備方法為本領域常規制備方法。所述制備方法較佳地為： 將編碼所述蛋白質并且帶有點突變的核酸分子克隆到重組載體中，將所得重組載體轉化到 轉化體中，得到重組表達轉化體，通過培養所得重組表達轉化體，經鎳柱親和層析分離純化 獲得所述蛋白質。
[0010] 本發明所采用的技術方案之二是:一種分離的核酸，所述的核酸是編碼上述蛋白 質的核酸分子。
[0011]其中所述核酸的制備方法為本領域常規制備方法，所述制備方法較佳地包括:從 自然界中提取天然存在的編碼酪氨酸脫羧酶的核酸分子，通過基因克隆技術獲得編碼酪氨 酸脫羧酶突變體的基因核酸分子，或者通過人工全序列合成的方法得到編碼酪氨酸脫羧酶 突變體的核酸分子。
[0012] 如本領域技術人員所知，編碼SEQ ID No. 1的氨基酸序列的堿基序列可以適當引 入替換、缺失、改變、插入或增加來提供一個多聚核苷酸的同系物。本發明中多聚核苷酸的 同系物可以通過對編碼該蛋白序列基因的一個或多個堿基在保持酶活性范圍內進行替換、 缺失或增加來制得。
[0013] 本發明所述具有點突變的核酸分子的制備方法為本領域常規制備方法。所述制備 方法較佳地為：以連接有來源于短乳桿菌(Lactobacillus brevis)CGMCCl.2028中的酪氨 酸脫羧酶基因的pET24a載體為模板（該基因名稱：lbtdc，請參考CN103421734A，登錄號 EU195891.1)，利用含有突變點的突變引物(選取需要進行突變的氨基酸位點上下游各15~ 20bp的一段堿基序列，將突變位點的堿基替換為突變后氨基酸的密碼子，作為PCR正向引 物，其反向互補序列即為PCR反向引物），通過PCR方法擴增，即得到帶有點突變的核酸分子。 其中所述含有突變點的突變引物的序列如序列表中SEQ ID No.2~SEQ ID No.81所示。
[0014] 其中所述含有突變點的引物的制備方法為本領域常規制備方法，較佳地為人工合 成。利用所得PCR引物進行PCR擴增程序，即得編碼所述酪氨酸脫羧酶突變體的核酸分子。 [00 15]其中所述PCR擴增為本領域常規技術，其中所述PCR反應的體系（20yL)較佳地為： 10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.0yL，25mmol · L^MgSOa 1.2yL，2mmol · L-MNTPs 2.0yL，上游引物（20ymol)0.3yL，下游引物（20μmol)0·3μL，pET24a-lbtdc質粒l~10ng， KOD-Plus-Neo 0 · 4yL，補加滅菌蒸饋水至20 · OyL。
[0016] 所述PCR擴增的程序較佳地為：（1)94°C變性2min; (2)94°C變性1 Osec，（ 3)55°C退 火30sec;(4)68°C延伸3.5min;步驟(2)~(4)共進行30個循環，最后68°C延伸7min，4°C保藏 產物。
[0017] 本發明采用的技術方案之三是:一種包含上述核酸的重組表達載體。
[0018] 其中所述重組表達載體可通過本領域常規方法獲得，即：將本發明所述的酪氨酸 脫羧酶突變體基因的核酸分子連接于各種表達載體上構建而成。所述的表達載體為本領域 常規的各種載體。所述載體較佳地包括:各種質粒、粘粒、噬菌體或病毒載體，本發明所述載 體優選地為pET24a( + )。
[0019] 本發明采取的技術方案之四是:一種包含上述重組表達載體的重組表達轉化體。
[0020] 其中所述重組表達轉化體的制備方法較佳地為:將上述重組表達載體轉化至宿主 微生物中制得。所述的宿主微生物較佳地為本領域常規的各種宿主微生物，只要能滿足上 述重組表達載體穩定地自行復制，且所攜帶的酪氨酸脫羧酶基因可被有效表達即可。其中 所述宿主微生物較佳地為:大腸桿菌(Escherichia coli)，更加的為大腸桿菌BL21 (DE3)將 前述重組表達質粒轉化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本發明優選的基因工程菌株。其中 所述轉化方法為本領域常規轉化方法，較佳地為化學轉化法，熱激法或電轉法。
[0021 ]本發明所采取的技術方案之五是:一種重組酪氨酸脫羧酶的制備方法，其中包括 如下步驟:培養上述的重組表達轉化體，從培養物種獲得重組酪氨酸脫羧酶。
[0022] 其中所述制備方法較佳地為:將上述重組大腸桿菌接種至含有氨芐青霉素的（100 yg/mL)LB培養基中，30~40°C，150~200rpm培養，培養液的吸光密度0D6Q()達到0.5~1.0(優 選0 · 8)，加入0 · 05~1 · Ommol/L(優選地為0 · 2mmol/L)的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)進行誘導，誘導溫度為16~30°C (優選25°C)，誘導12~16小時即可得到高效表達的 重組酪氨酸脫羧酶。
[0023] 本發明所采取的技術方法之六是:上述蛋白質或上述重組表達轉化體作為催化劑 在酪氨酸脫羧中的應用。
[0024] 本發明所用試劑盒原料均市售可得。
[0025] 本發明的積極進步效果在于:在天然酪氨酸脫羧酶晶體結構的基礎上，通過對活 性位點氨基酸進行定點突變得到了S586A突變體。S586A突變體酶的純酶比活力為野生型的 2.23倍，底物親和力K m值為野生型的72.4%。本發明表明586為氨基酸殘基對酶的催化活性 有較大影響，為酶的催化機理的研究提供了一定的基礎，并提高了酪氨酸脫羧酶生物催化 法生產酪胺在工業上的應用潛力。
【附圖說明】
[0026]圖1為酪氨酸脫羧酶突變體表達及純化結果的SDS-PAGE電泳圖。其中：圖1(A)泳道 1為不同分子量的蛋白質標準品，泳道2為野生型酪氨酸脫羧酶蛋白，泳道3-9分別為突變體 蛋白 H98A、M99A、N100A、S101A、E102A、T103A、V294A。圖 1(B)泳道 1-7分別為突變體蛋白 △295?、6296?、52974、了298六42994、￥33^和!13914，泳道8為不同分子量的蛋白質標準品，泳 道9為野生型酪氨酸脫羧酶蛋白。圖1(C)泳道1-6分別為突變體蛋白V396A、P397A、Y398A、 M505A、S586A和M588A，泳道7為野生型酪氨酸脫羧酶蛋白，泳道8為不同分子量的蛋白質標 準品。
[0027] 圖2為酶促酪氨酸脫羧反應的進程曲線圖。圖中所示兩條曲線為反應過程中底物 酪氨酸和產物酪胺在反應體系中的濃度變化。其中▲:酪氨酸;·:酪胺。
【具體實施方式】
[0028] 下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但不因此將本發明限制在所述的實施 例范圍之中。下述實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照 商品說明書選擇。
[0029] 實施例1短乳桿菌酪氨酸脫羧酶突變體的制備
[0030] 定點突變米用QuickChange》丨 I Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene， Catalog#200522)所述方案進行操作。首先設計含有突變點的突變引物，如表1所示，包括對 序列表中SEQ ID NO: 1所示序列中第98位、99位、100位、101位、102位、103位、294位、295位、 296位、297位、298位、299位、331位、391位、395位、396位、397位、398位、505位、586位和 588 位引入突變的引物，以及對586位進行飽和突變(將586位的絲氨酸突變為其余19種氨基酸 中的任意一種）的引物。上述引物的序列如序列表SEQ ID No.2~81所示：
[0031] 表1酪氨酸脫羧酶的突變引物
[0035] 利用上述引物，以含有LbTDC基因的pET-24a質粒為模板，進行全質粒PCR反應。反 應體系如下（20yL):10XPCR Buffer for KOD-Plus-Neo 2.0yL，25mmol ?L-MgSCk 1.2yL， 2mmol · L-MNTPs 2.0yL，上游引物（20ymol)0.3yL，下游引物（20ymol)0.3yL，pET24a-lbtdc 質粒1~101^，1(00-?1118-如〇0.4以1^，補加滅菌蒸饋水至20.(^匕
[0036] PCR擴增程序：94°C預變性2min; 98°C變性 10s; 55 °C退火30s; 72°C延伸3 · 5min;擴 增15個循環后，再68°C后延伸7min，最后冷卻至4°C保存。
[0037] 擴增得到的PCR產物經內切酶Dpn I于37°C消化2h后，分別轉化E.coli BL21(DE3) 感受態細胞，轉化產物均勻涂布在含有50yg/mL卡那霉素的LB瓊脂平板上，經37°C過夜培 養，挑取單克隆，即得到含突變體表達質粒的E.coli BL21(DE3)菌株，部分送至賽音生物技 術(上海)有限公司測序，部分用于保存甘油管。測序結果用DNAMAN軟件與野生型酪氨酸脫 羧酶基因序列進行比對，確認突變前后基因序列及相應的氨基酸序列的差異。
[0038]實施例2短乳桿菌酪氨酸脫羧酶突變體的表達與純化 [0039] 1.酪氨酸脫羧酶突變體的表達
[0040]將實施例1中測序成功的突變體的表達菌株接種于100mL含有50yg/mL卡那霉素的 LBG液體培養基（10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl和20g/L葡萄糖）中，37 °C、 180rpm培養至0D_為0.8后降溫至25°C，并加入終濃度為0.2mmol/L的IPTG，誘導6h后8000 Xg離心7min收集菌體。菌體用A液(25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4,300mmol/L NaCl,20mmol/ L咪唑，5mmo 1/L0-疏基乙醇)懸浮后超聲破碎(功率45 %，超聲1 s，間歇3s，總時間15min)，然 后再4°C，8000Xg離心30min，上清液即為酪氨酸脫羧酶突變體的粗酶液。將所得粗酶液進 行冷凍干燥，即得酪氨酸脫羧酶突變體的粗酶粉。
[0041 ] 2.酪氨酸脫羧酶突變體的純化
[0042]鎳柱親和純化酪氨酸脫羧么突變體蛋白，步驟如下：
[0043] (l)Ni柱使用前首先用A液（25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4,300mmol/L NaCl， 20mmo 1 /L咪唑，5mmo 1 /1β-巰基乙醇)平衡5~10個柱體積。
[0044] (2)粗酶液以lmL/min的流速上樣，將目的蛋白吸附到Ni柱上。
[0045] (3)上樣完成后，再用A液(25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4,300mmol/L NaCl，20mmol/ L咪唑，5mm〇l/Li3-巰基乙醇)平衡5個柱體積以洗脫與Ni柱非特異性結合的雜蛋白。
[0046] (4)用含不同咪唑濃度的B液（25mmol/L Tris-HCl，pH 7.4,300mmol/L NaCl，75、 300mmo 1/L咪唑，5mmo 1/L0-疏基乙醇)對目的蛋白進行分步洗脫。洗脫液分別收集。
[0047] (5)用SDS-PAGE分析收集到的蛋白樣品，確定目的蛋白的純度。收集高純度的蛋白 洗脫液。
[0048] 實施例3酪氨酸脫羧酶突變體的酶活性分析
[0049] 酪氨酸脫羧酶的活力用反相HPLC(C18柱)測定，通過測定反應前后酪胺的增加量 來確定酪氨酸脫羧酶的活力。酶活力定義為，測活條件下，lmin轉化Ιμπιο?底物生成產物所 需的酶量為1U。比活力定義為，每毫克蛋白所具有的活力單位數。
[0050] 酪氨酸脫羧酶的測活體系（lmL)為：40°C預熱的2.75mmol/L底物950yL(溶于 0.2mol/L，pH 5.0的醋酸鈉緩沖液中），5mmol/L輔酶PLP 40yL，10yL合適濃度的酶液。反應 在2mL EP管中進行，40°C反應lOmin后，用金屬浴100°C滅活lOmin以終止反應。反應液冷卻 后，12，000 X g離心10min并通過0 · 22μηι濾頭過濾。利用Diamonsil C18柱(迪馬科技）、安捷 倫1260液相分析底物與產物的相對含量。液相檢測條件:進樣體積為10yL，柱溫30°C，流速 0.8mL/min，檢測波長220nm。流動相為甲醇：水:冰醋酸=10:90:0.1。蛋白濃度用Bradford 法蛋白定量試劑盒測定。
[0051] 野生型酪氨酸脫羧酶與突變體酶的比活力見下表(野生型酪氨酸脫羧酶的比活力 定義為100%)。
[0052]表2酪氨酸脫羧酶突變體對酪氨酸的比活力
[0054]上表列出了實施例2純化后的突變體蛋白的比活力情況。結果表明在將酪氨酸脫 羧酶底物結合位點周圍位阻較大的殘基突變為位阻較小的丙氨酸后，S586A突變體具有最 高的脫羧活力，對酪氨酸的催化活性提高了 2.23倍。
[0055]為闡明S586突變成丙氨酸活力增加的詳細機制，我們首先對586位絲氨酸進行飽 和突變，但飽和突變體中多數沒有可檢測的活性，僅有S586G、S586T、S586V、S586F、S586L、 S586I、S586N、S586Y、S586C和S586E表現出了一定的催化活力。下表列出了具有可檢測酶活 力的586位的突變體。
[0056]表3第586位飽和突變體催化酪氨酸脫羧的比活力
[0059] 上表表明除3586六外，只有35866和35861'對酪氨酸底物保留超過10%(32.6%和 10.0%)的相對活力，其他突變體對酪氨酸的酶活力都低于5%或沒有可檢測的酶活力，這 表明S586是底物結合或催化的關鍵殘基。為從機理上分析S586A催化活力提高的原因，我們 對S586A進行了動力學分析。動力學參數測定是在不同底物濃度(0.55、1.1、2.2、3.3、4.4、 5.5mmol/L)下，按照實施例3中的酶活測定的方法測定酶活力，并通過比活力來表征反應速 率，利用0ringin9.0軟件擬合到米氏方程，從而得到他們的1和1^值。表4列出了野生型酪 氨酸脫羧酶與S586A突變體對酪氨酸的動力學參數。
[0060]表4酪氨酸脫羧酶野生型及突變體對酪氨酸的動力學常數
[0062] 結果表明S586A突變體蛋白對酪氨酸的親和力和催化效率較野生型均有提高。結 合飽和突變比活力和動力學參數結果我們推測LbTDC發揮脫羧作用對586位的氨基酸具有 空間位阻與疏水性的要求。
[0063] 實施例4酪氨酸脫羧酶突變體在催化酪胺形成中的應用
[0064]實施例3結果表明，將酪氨酸脫羧酶586位的絲氨酸突變成丙氨酸后具有相對較高 的比活力。將實施例2所得到的酪氨酸脫羧酶S586A突變體的粗酶粉對酪胺進行了合成。酪 胺合成體系為:在1L，0.2M，pH 5.0的醋酸鈉緩沖液中，加入100mM酪氨酸，0.2mM磷酸吡哆 醛，S586A突變體蛋白20mg，在40°C條件下200rpm攪拌反應。反應進行0.5h、1.0h、1.5h、 2. Oh、2.5h、3. Oh、4. Oh、5. Oh和6.0后按實施例3所述方法取0.5mL反應液進行滅活處理，反 相HPLC法檢測底物與產物的含量，計算酪氨酸的轉化率和酪胺的合成速率。結果顯示酪氨 酸可以完全轉化。
[0065]上述結果顯示本發明所述酪氨酸脫羧酶突變體對酪氨酸脫羧反應具有良好的催 化效果。
[0066]應理解，在閱讀了本發明的上述內容之后，本領域技術人員可以對本發明做各種 改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
【主權項】
1. 一種分離的蛋白質，其特征在于，所述蛋白質的氨基酸序列是將序列表中SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的第586位的絲氨酸突變為丙氨酸所得的氨基酸序列。2. -種分離的核酸，其特征在于，所述核酸是編碼如權利要求1所述蛋白質的核酸序 列。3. -種包括如權利要求2所述的核酸的重組表達載體。4. 一種包含如權利要求3所述的重組表達載體的重組表達轉化體。5. 如權利要求1所述蛋白質或如權利要求4所述重組表達轉化體作為催化劑在催化氨 基酸脫羧反應，制備生物胺的應用，其中所述氨基酸為酪氨酸。
【文檔編號】C12N15/60GK105969755SQ201610373870
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】倪曄, 許國超, 祝海霞, 韓瑞枝, 董晉軍
【申請人】江南大學