改造的核苷酸環化酶及其應用

改造的核苷酸環化酶及其應用
【專利摘要】本發明涉及基因工程與生物化學技術領域,具體涉及一種來源于霍亂弧菌的經過改造的二核苷酸環化酶，基因堿基序列如序列表中序列1所示。一種改造的核苷酸環化酶，氨基酸序列如序列表中序列2所示。改造的核苷酸環化酶基因或改造的核苷酸環化酶或載體或質粒在合成c?di?GMP、c?di?AMP中的應用。改造后的核苷酸環化酶，PET22b?VC0179?ΔLOOP比PET22b?VC0179蛋白在酶的活性和產物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，減少酶的損耗，很大程度上降低了小分子的生產成本。酶的活性均有很大改善。而且純化后的酶純度較高，酶促反應效率很高，具有很好的開發應用價值。
【專利說明】
改造的核苷酸環化酶及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程與生物化學技術領域，具體涉及一種來源于霍亂弧菌的經過 改造的二核苷酸環化酶，還涉及含有此二核苷酸環化酶的載體或質粒，還涉及此二核苷酸 環化酶在合成c-di-GMP，c-di-AMP中的應用。
【背景技術】
[0002] 環二核苷酸（Cyclic dinucleotides/CDNs)，如c-di_GMP(cyclic diguanylate, c-di-GMP)、和c-di_AMP(Cyclic 3'，5'_diadenosine monophosphate，c-di_AMP)是細菌中 廣泛存在的第二信使，對于細菌生物膜的形成，毒力的產生發揮重要作用。它們不存在于高 等生物中，因此可以成為天然免疫系統識別的PAMP。當細胞內引入⑶Ns時，能通過STING產 生I型干擾素。
[0003] 目前的研究實驗中C-di-GMP，C-di-AMP，3 ' -5 ' CGAMP的合成主要是由酶催化合成， 就公布的專利：如國際專利W02013/066264A1與國內專利201080019476.X等都是采用不同 的酶催化合成。霍亂弧菌編碼一種能夠合成c-di-AMP，C-DI-GMP，3 ' -5 ' CGAMP三種不同環二 核苷酸的核苷酸環化酶DncV(VC0179)，序列比對顯示DncV類環化酶在腸道病原菌中廣泛存 在。VC0179作為環化酶可有效促進霍亂弧菌的腸道定殖，同時還可調節趨化性的細菌定殖。 DncV全長由436個氨基酸組成。序列分析表明，它包含一個在核苷酸轉移酶超家族中的保守 基序[G[G/S]x9-13Dx[D/E]，天冬氨酸殘基是激活(2'-5'）-118 〇&如1^1&仏合成酶((^1)和 poly (A)的核苷酸轉移酶超家族聚合酶(NTS)的關鍵殘基。但其合成效率不高。

【發明內容】

[0004] 為了解決以上現有技術中核苷酸環化酶DncV(VC0179)在合成C-di-AMP，c-di-GMP，兩種不同環二核苷酸時合成效率不高的問題，本發明提供了一種合成效率高的改造的 核苷酸環化酶。
[0005] 本發明還提供了改造的核苷酸環化酶在合成c-di-AMP，c-di-GMP中的應用。
[0006] 本發明是通過以下步驟得到的：
[0007] -種改造的核苷酸環化酶基因，堿基序列如序列表中序列1所示。
[0008] -種改造的核苷酸環化酶，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0009] 含有上述改造的核苷酸環化酶基因的載體或質粒。
[0010] 所述的改造的核苷酸環化酶基因或所述的改造的核苷酸環化酶或所述的載體或 質粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中的應用。
[0011] 所述的改造的核苷酸環化酶基因或所述的改造的核苷酸環化酶或所述的載體或 質粒在合成c-di-gmp、c-di-amp中提高GTP和ATP酶的利用率，減少酶的損耗。
[0012] 所述的改造的核苷酸環化酶基因或所述的改造的核苷酸環化酶或所述的載體或 質粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中提高GTP和ATP酶的活性和c-di-GMP、c-di-AMP生成效率。
[0013] 本發明在獲得VC0179晶體結構的基礎上，分析結構將核苷酸環化酶DncV (VC0179) 剔除一個LOOP環，命名為VCO179- Δ LOOP，重組構建表達載體PET22b中，實現VCO179- Δ LOOP 的活性可溶性表達。改造后的VC0179-Δ LOOP，在酶的活性和產物生成效率方面都有很大的 提高。提高GTP、ATP的利用率，減少酶的損耗，很大程度上降低了小分子的生產成本。同時， 一般實驗室均可獨立生產滿足實驗室需求。
[0014] 第一、根據GENEBANK上公布的基因序列設計引物，采用PCR技術以霍亂弧菌基因組 為模板擴增或全基因人工合成技術得到具有功能活性的VC0179基因（1-419位氨基酸)序 列。
[0015] 第二、將VC0179基因序列與PET22b質粒進行重組，構建PET22b-VC0179重組質粒載 體;轉化入大腸桿菌BL21中。
[0016] 第三、設計引物，以前期構建的PET22b-VC0179重組質粒為模板，采用重疊 PCR的方 法敲除一段(203-238位氨基酸)LOOP基因，構建表達載體PET22b-VC0179-A L00P，轉化入大 腸桿菌BL21中。
[0017] 第四、分別低溫誘導表達構建的PET22b-VC0179與PET22b-VC0179-AL00P重組質 粒。采用16°C，誘導表達過夜后，低溫壓力破碎大腸桿菌的方法，破碎誘導表達的細菌，超速 離心，上清經鎳柱純化，SourceQ離子交換柱層析，分子篩三步法純化。
[0018] 第五，生成c-di-GMP、c-di-AMP小分子的50mL反應體系：終濃度為100mM Tris，pH 7 · 51 OOmMNaCl 10mM MgCl2，ImMGTP/ATP/GTP和ATP及VCO 179蛋白約5~1 Omg，加入超純水至 50mL.緩慢搖擺，室溫條件下反應過夜。將粗產物溶液煮沸5-10min，使酶失活，12000rpm離 心5min，上清經0.22um濾膜過濾，收集濾液備用。
[0019] 第六，半制備高效HPLC純化c-di-GMP、c-di-AMP小分子
[0020] 經半制備高效液相色譜HPLC，應用反相色譜柱為Agela VenusilMP C18 50mm* 250mm，紫外檢測器在256nm處，洗脫液A為PH4.8的10mM乙酸銨，洗脫液B為純乙腈，流速為 1 OmL/min.梯度洗脫運行時間為45min，洗脫液A從95 %至70 %，同時洗脫液B由5 %逐漸升至 30 %。上樣量為100uL~9mL，摸索最大上樣量，根據前期確認好的出峰時間與位置，收集純 化的小分子。
[0021]本發明的有益效果：
[0022] 改造后的核苷酸環化酶，PET22b-VC0179-AL00P比PET22b-VC0179蛋白在酶的活 性和產物生成效率方面都有很大的提高。提高GTP、ATP的利用率，減少酶的損耗，很大程度 上降低了小分子的生產成本。同時，一般實驗室均可獨立生產滿足實驗室需求。總體而言， 本發明生產工藝較為成熟，操作簡單，改造后的VC0179穩定性，酶的活性均有很大改善。而 且純化后的酶純度較高，酶促反應效率很高，具有很好的開發應用價值。
【附圖說明】
[0023] 圖1為經分子篩純化后的PET22b-VC0179蛋白，
[0024]圖2為經分子篩純化后的PET22b-VC0179蛋白的凝膠電泳圖，
[0025] 圖3為經分子篩純化后的PET22b-VC0179-A LOOP蛋白
[0026] 圖4為經分子篩純化后的PET22b-VC0179- Δ LOOP蛋白的凝膠電泳圖，
[0027] 圖5為SIGNA公司C-DI-GMP標準品HPLC對照，
[0028] 圖6為PET22b-VC0179- Δ LOOP生成c-di-GMP小分子的HPLC圖，
[0029] 圖 7 為PET22b-VC0179 生成 c-di-GMP 小分子的 HPLC，
[0030] 圖8為SIGNA公司C-DI-AMP標準品HPLC對照，
[0031] 圖 9 為PET22b-VC0179 生成 c-di-AMP 小分子的 HPLC，
[0032] 圖 10為PET22b-VC0179- Δ LOOP生成c-di-AMP小分子的HPLC圖。
【具體實施方式】
[0033]下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明：
[0034] 實施例1
[0035] 1.1、根據GENEBANK上公布的基因序列設計引物，采用PCR技術以霍亂弧菌基因為 模板擴增得到具有功能活性的VC0179基因（1-419位氨基酸)序列。根據霍亂弧菌基因的序 列以及PET22b質粒的結構特點，加入限制性內切酶Ndel和Xhol兩個酶切位點，設計上下游 引物。
[0036]引物序列如下：
[0037] VC1079F-NdeI:GGAATTCCATATGATGAGAATGACTTGGAACT
[0038] VC1079-R-XhoI:GTTCTCGAGTTCTTGAGCGAAAGCCGGTA
[0039] PCR反應體系： ddH20： 66 u h
[0040] 10 X HiIllaq buffer； 10 ti L dNTP： 8 WL 二甲亞砜： 4 pL 模板.： 1 μ L
[0041 ] VC'1079F-NdcI (lOmM)： 5 W.L VClO'79-R-XhoI (lOmM)： 5 uL Hifitaq： 1 W L Tolal： 100 H L
[0042] PCR反應設置如下：
[0044] PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離PCR片段，并根據膠回收試劑盒 供貨商說明書將PCR片段進行回收。
[0045] 1.2、將VC0179基因序列與PET22b質粒進行重組，構建PET22b-VC0179重組質粒載 體;轉化入大腸桿菌BL21中，標記為菌種PET22b-VC0179-80°C保存。
[0046] 1.2.1用限制性內切酶Ndel和Xhol對載體質粒pET-22b進行切割，對PCR產物回收 片段進行雙酶切反應。反應溫度為37°C，載體酶切6h，PCR片段酶切3h。并用DNA凝膠回收試 劑盒回收酶切產物。
[0047] 酶切體系 載體（PCR產物）50 UL 3thoI 2: pL
[0048] NdcI/BamHl 2: μL 10 Η/Κ buffer 6 μι. Total 60 μΙ_.
[0049] 1.2.2酶切后的片段和相應載體的連接
[0050] 連接反應體系：
[0051 ] 酶切后的DNA片段：9 P L 酶切后的載體： 2 PL 5 X T4 Ligaso buficr： 3 μ L
[0052] T4 Ligase： 1 μ L Total： 15 μ L
[0053] 充分混勻，24°C，3h。
[0054] 1.2.3片段連接后的轉化
[0055] 將15yL PCR連接產物全部加入到100yL E.coli BL21(DE3)感受態細胞中并輕輕 混勻，冰浴30min，期間不要搖動，42°C熱激90sec，然后冰上孵育l-2min，加入200yL無抗液 體LB培養基，放置到搖床上120rpm，45-60min復蘇，均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)固體 LB培養基上，培養皿先37°C正面培養30min，再倒置培養12-16h。調取陽性菌落，擴增測序， 將測序正確的菌株_80°C保存。命名為PET22b-VC0179。
[0056] 1.3設計引物，以前期構建的PET22b-VC0179重組質粒為模板，采用重疊 PCR的方法 敲除一段(203-238位氨基酸)LOOP基因，構建表達載體PET22b-VC0179- Δ LOOP，轉化入大腸 桿菌BL21中。具體操作：
[0057]引物設計如下：
[0062] 1.3.1PCR 反應體系： 棚20; 66 μ L 10X Hilllaq buffer： 10 μ L dNTP* 8 P L 二甲亞駆U 4 U L
[0063] 模板： 1 pL Primer-il (lOmM)： 5 W L Primor-rl (lOrnM)： 5 P L HiHtaq： 1 μ L Total； 100 uL
[0064] PCR反應設置如下：
[0066] PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離PCR片段，并根據膠回收試劑盒 供貨商說明書將PCR片段進行回收。回收產物標記為模板1.
[0067] 1.3.2PCR 反應體系： ddH20： 66 μ L 10 X Hilltaq bulTcr： 10 μ L dNTP： 8 tiL 二甲亞砜： 4
[0068] 模板： 1 WL Primer-12 (lOrnM)： 5 μ L Primcr-r2 (lOmM)： 5 ti L Hifitaq： 1 vL Tolal： 100 μ L
[0069] PCR反應設置如下：
[0071] PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離PCR片段，并根據膠回收試劑盒 供貨商說明書將PCR片段進行回收。回收產物標記為模板2.
[0072] 1.3.3PCR 反應體系： ddH2〇： 65 μ L
[0073] 10X Hilllaq buficr： 10 li L dNTP： 8 w:L 二甲亞砜:： 4 wL 模板1: 1 uL 模板 2.:: 1 U..L
[0074] Primer-Π (lOmM ): 5 W L Primcr-r2 ClOmM)： 5 W L I-IiHlaq： 1 ?L Total： 106 u L
[0075] PCR反應設置如下：
[0077] PCR反應結束后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分離PCR片段，并根據膠回收試劑盒 [0078]供貨商說明書將PCR片段進行回收。回收產物標記為VC0179-A loop。
[0079] 1 · 4 ·將VC0179- Δ loop基因序列與PET22b質粒進行重組，構建PET22b-VC0179- Δ loop重組質粒載體;轉化入大腸桿菌BL21中。
[0080] 1.4.1用限制性內切酶Ndel和Xhol對載體質粒pET-22b進行切割，對PCR產物回收 片段進行雙酶切反應。反應溫度為37°C，載體酶切6h，PCR片段酶切3h。并用DNA凝膠回收試 劑盒回收酶切產物。
[0081] 酶切體系 載體（PCR產物）50: μL Xhol 2 μL
[0082] Ndel/BamHI 2 μΙ 10 H/K buffer 6 liL Total 60 μ L
[0083] 1.4.2酶切后的片段和相應載體的連接
[0084] 連接反應體系： 酶切后的DNA片段：9 WL 酶切后的載體： 2 pJL
[0085] 5 X T4 Ligasc buiTcr： 3 PL T4 Ligasc： 1 μ L Total： 15 UL
[0086] 充分混勻，24°C，3h。
[0087] 1.4.3片段連接后的轉化
[0088] 將15yL PCR連接產物全部加入到100yL E.coli BL21(DE3)感受態細胞中并輕輕 混勻，冰浴30min，期間不要搖動，42°C熱激90sec，然后冰上孵育l-2min，加入200yL無抗液 體LB培養基，放置到搖床上120rpm，45-60min復蘇，均勻涂布于含有氨芐青霉素(Amp)固體 LB培養基上，培養皿先37°C正面培養30min，再倒置培養12-16h。調取陽性菌落，擴增測序， 將測序正確的菌株_80°C保存，命名為PET22b-VC0179-Al 〇op。
[0089] 1.5重組蛋白的表達與純化
[0090] (1)活化菌體：分別挑取-8(TC保存的 PET22b-VC0179 與 PET22b-VC0179-AL00P 菌 種，于5mL含有Amp+抗性的LB培養基中，37 °C 200rpm過夜培養。
[0091] (2)菌體擴大培養:將過夜搖好的菌液接入1L含有Amp+抗性的LB培養基中，37°C 200rpm培養至0D600約為0.8時，降溫至16°C，一小時后加入lmL IPTG(24mg/mL)，誘導過夜。
[0092] (3)收集菌體：4200印111，4。〇離心 15min，棄上清，加40mL Resuscitation buffer重 新懸起菌體，按照1:100加 PMSF(蛋白酶抑制劑），混勻。
[0093] (4)采用低溫壓力破碎大腸桿菌的方法，破碎誘導表達的細菌。
[0094] (5)超速離心:將超聲后的菌液14000rpm，4°C離心50min，收集上清。
[0095] (6)Ni-NTA親和層析:將離心后的上清倒入處理過的Ni-NTA柱中，上清流完后，用 Resuscitation buffer重新2個柱體積，以去除雜蛋白，然后用Elution buffer 10mL洗脫 目的蛋白，收集于預冷的小燒杯中，使用SDS-PAGE檢測蛋白是否為所需蛋白。
[0096] (7)將上一步洗脫下來目的蛋白用平衡液buffer A(25mM Tris-HCl pH 8.0)稀釋 3倍后上樣到平衡好的Source Q強陰離子交換柱上，上完樣后用洗脫液buffer B(25mM Tris-HCl pH 8.0,1M NaCl)線性梯度洗脫；
[0097] (8)對有紫外吸收峰的蛋白組分取樣進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，根據 紫外吸收峰形和電泳染色結果對收集的蛋白進行濃縮，濃縮到2mL以內；
[0098] (9)在過分子篩之前將上一步濃縮的蛋白12000rpm離心10min，將樣品上樣到已平 衡好的分子篩24mL Superdex-200柱子上，用分子篩buffer(10mM Tris-HCl pH8.0，100mM NaCl或者lOmM Tris-HCl pH 8.0,300mM NaCl)進行洗脫，結果分別見圖1、圖3。取樣進行 SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色，結果見圖2、圖4。
[0099]所有的蛋白純化步驟均在4°C進行。
[0100] 實施例2
[0101] 2.1生成c-di-GMP、c-di-AMP小分子的50mL反應體系：終濃度為100mM Tris，pH 7 · 51 OOmMNaCl 10mM MgCl2，ImMGTP/ATP/GTP和ATP及VCO179蛋白約5~1 Omg，加入超純水至 50mL.緩慢搖擺，室溫條件下反應過夜。將粗產物溶液煮沸5-10min，使酶失活，12000rpm離 心5min，上清經0.22um濾膜過濾，收集濾液備用。
[0102] 2.2半制備高效冊1^：純化(3-(1丨-6103、(3-(1丨-艦?小分子
[0103] 經半制備高效液相色譜HPLC，應用反相色譜柱為Agela VenusilMP C18 50mm* 250mm，紫外檢測器在256nm處，洗脫液A為PH4.8的10mM乙酸銨，洗脫液B為純乙腈，流速為 1 OmL/min.梯度洗脫運行時間為45min，洗脫液A從95 %至70 %，同時洗脫液B由5 %逐漸升至 30 %。上樣量為100uL~9mL，摸索最大上樣量，根據前期確認好的出峰時間與位置，收集純 化的小分子。
[0104] 改造后的VC0179-A LOOP，從圖6和7、圖9和10的對比中明顯能看出PET22b-VC0179-AL00P比PET22b-VC0179蛋白在酶的活性和產物生成效率方面都有很大的提高。即 在相同的反應體系、相同的反應條件、相同的上樣量的情況下，圖6中可以明顯看出剩余的 GTP的量遠小于圖7中GTP的量，同時c-di-GMP的產量顯著高于圖7。同樣可以明顯看出圖9、 圖10的對比差異。PET22b-VC0179-AL00P表達的核苷酸環化酶提高GTP、ATP的利用率，減少 酶的損耗，很大程度上降低了小分子的生產成本。同時，一般實驗室均可獨立生產滿足實驗 室需求。總體而言，本發明生產工藝較為成熟，操作簡單，改造后的VC0179穩定性，酶的活性 均有很大改善。而且純化后的酶純度較高，酶促反應效率很高，具有很好的開發應用價值。
[0105] 上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受實施例的限 制，其它任何未背離本發明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為 等效替換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種改造的核苷酸環化酶基因，其特征在于堿基序列如序列表中序列1所示。2. -種改造的核苷酸環化酶，其特征在于氨基酸序列如序列表中序列2所示。3. 含有上述改造的核苷酸環化酶基因的載體或質粒。4. 一種權利要求1所述的改造的核苷酸環化酶基因或權利要求2所述的改造的核苷酸 環化酶或權利要求3所述的載體或質粒在合成c-di-GMP、c-di-AMP中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于權利要求1所述的改造的核苷酸環化酶基因 或權利要求2所述的改造的核苷酸環化酶或權利要求3所述的載體或質粒在合成c-di-gmp、 c-d i -amp中提高GTP和ATP的利用率，減少酶的損耗。6. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于權利要求1所述的改造的核苷酸環化酶基因 或權利要求2所述的改造的核苷酸環化酶或權利要求3所述的載體或質粒在合成c-di-GMP、 c-di-AMP中提高酶的活性和c-di-GMP、c-di-AMP生成效率。
【文檔編號】C12P19/32GK105969754SQ201610280953
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】叢曉燕, 王黎文, 李桂華, 趙學峰, 田偉, 位賓, 杜以軍, 陳蕾, 孫文博, 時建立, 王金寶, 谷立川
【申請人】山東省農業科學院畜牧獸醫研究所, 濟南海之華飼料有限公司