可拆分外消旋胺制備手性胺的轉氨酶及其編碼基因與應用
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種可拆分外消旋胺制備手性胺的轉氨酶及其編碼基因與應用。轉氨酶是如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，轉氨酶的基因是如SEQ ID NO.2所示的堿基序列。采用本發明所述轉氨酶作為催化劑來拆分外消旋胺，與化學法相比，有著高的選擇性和轉化率，且反應條件溫和，對環境無污染，對于醫藥及化工領域手性胺的高效、綠色合成具有重大意義。
【專利說明】
可拆分外消旋胺制備手性胺的轉氨酶及其編碼基因與應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，更具體地涉及一種轉氨酶應用于拆分外消旋胺制備手 性胺的方法。該酶能利用外消旋胺作為氨基供體，丙酮酸作為氨基受體，在PLP存在下，將外 消旋胺中一個對映體完全轉化為酮，剩下另一個未反應的對映體，同時生成副產物丙氨酸。
【背景技術】
[0002] 手性胺類化合物是一類重要的藥物合成中間體。近年來，手性制藥工業迅速發展 壯大，單一對映體藥物每年以大于20%的速度增長，其對手性胺的需求也隨之增長。目前， 超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感 染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作為中間體。因此，找到一種高效制備手性胺的方法 迫在眉睫。制備手性胺的方法主要有兩種:化學法和生物法。化學法主要通過化學拆分和化 學合成來制備手性胺，化學拆分法是利用手性胺中的氨基(拆分基團）與純的旋光化合物 (拆分劑)發生反應從而把一對對映體分成兩個非對映體，產生物理性質上的差異，用蒸餾、 結晶、色譜分離等常規的方法將其分離。化學合成法是在手性助劑的幫助下，將底物在一定 的條件下反應轉化為手性胺。
[0003] 雖然化學的方法生產手性胺類化合物的工藝已經比較成熟，但是操作過程復雜 (如手性拆分R，S-苯乙胺時，可能需要反復的重結晶)或是需要特殊的手性助劑幫助并且產 物的e. e.值并不高，同時也易對環境造成嚴重污染。
[0004] 生物法是主要利用轉氨酶作為生物催化劑促使化學反應的進行，將底物轉化為手 性胺的過程。轉氨酶(4111；[1101^3118€6抑86 8,418)是依賴5-磷酸[1比咳醛(？1^>)的一種酶，它在 細胞的氮代謝過程中有著重要的氨基轉移作用，并且廣泛存在于大自然中。轉氨酶催化的 轉氨反應由兩步反應組成，第一步反應是轉醛亞胺過程，酶活性位點上賴氨酸殘基上5-磷 酸吡哆醛(PLP)和-NH 2之間的席夫堿被氨基供體和PLP之間的席夫堿所取代形成一個外部 的醛亞胺，釋放出來的賴氨酸殘基成為以后的催化劑，然后是1，3氫轉移到從外部醛亞胺去 質子化的亞胺，得到酮亞胺中間體，再將酮亞胺中間體水解釋放氧化產物和5-磷酸吡哆胺 (PMP)。第二步反應包括氨基受體接受氨基生成相應的胺類產品和輔酶再生的過程。
[0005] 生物法以轉氨酶為催化劑有著高的選擇性和轉化率，且反應條件溫和，對環境無 污染，對于醫藥及化工領域手性胺的高效、綠色合成具有重大意義。
【發明內容】
[0006] 本發明旨在提供一種以轉氨酶為催化劑的生物法制備手性胺，具體是一種可拆分 外消旋胺制備手性胺的轉氨酶及其編碼基因與應用。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：轉氨酶，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序 列。
[0008] 本發明的另一目的是提供轉氨酶的基因，是如SEQ ID N0.2所示的堿基序列。
[0009] 上述轉氨酶的制備步驟為：
[0010] S1:將如SEQ ID NO.2所示的轉氨酶的基因插入到質粒中得到重組表達載體；
[0011] S2:將所述重組表達載體轉移到宿主微生物中得到基因工程菌；
[0012] S3:培養所述基因工程菌得到重組轉氨酶，即本發明所述轉氨酶。
[0013] 該轉氨酶來源于惡臭假單胞菌Pseudomonas putida，其具有的酶學性質為：（a)通 過SDS-PAGE測定的分子量為45-60kDa;(b)酶活最大為3.6U/mg，Km為130.9mM，kcat/km為 0·; (c)與紫色色桿菌Chromobacterium violaceum中獲得的CV2025具有的58% 氨基酸序列同源性。
[0014]本發明另一目的是提供所述轉氨酶或轉氨酶的基因在拆分外消旋胺制備手性胺 中的應用。具體實施時，該應用是在轉氨酶、氨基供體、氨基受體以及PLP輔酶存在下，反應 體系中底物外消旋胺的其中一個對映體發生氧化反應生成酮，剩下另一個未反應的對映 體。外消旋胺的拆分是在pH為5.0~11.0的反應體系中實現的。
[0015]優選的，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反應體系中實現的。所述反應體系中PLP 輔酶的添加量為〇. 01~1. 〇mM。所述反應體系中底物外消旋胺的添加量為5.0~100.0 mM。
[0016]下面以拆分外消旋苯乙胺(底物)為例來解釋本發明所述應用的反應過程:在磷酸 緩沖液中，氨基受體丙酮酸和輔酶PLP存在下，底物外消旋苯乙胺被拆分反應生成苯乙酮， 剩下未反應的R-苯乙胺，同時生產副產物丙氨酸。其轉化生成路線如下：
[0018] 式中：PpTA指轉氨酶;PLP指5-磷酸吡哆醛。
[0019] 采用本發明所述轉氨酶作為催化劑來拆分外消旋胺，與化學法相比，有著高的選 擇性和轉化率，且反應條件溫和，對環境無污染，對于醫藥及化工領域手性胺的高效、綠色 合成具有重大意義。
【附圖說明】
[0020] 圖1為PpTA經蛋白純化后聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。
[0021]圖2為PpTA最佳pH研究結果示意圖。
[0022]圖3為PpTA最適催化溫度的研究結果示意圖。
[0023]圖4為PpTA溫度穩定性的研究結果示意圖。
[0024]圖5為PpTA在一定酶量下，酶活隨底物濃度變化的研究結果示意圖。
【具體實施方式】
[0025]下面結合附圖，給出本發明的較佳實施例，并予以詳細描述。
[0026] SanPrep柱式PCR產物純化試劑盒（SK8141)購于生工生物工程(上海)股份有限公 司。SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒（SK8192)購于生工生物工程(上海）股份有限公 司；PCR擴增試劑dNTP，Buf f er，Taq酶購于生工生物工程(上海)股份有限公司；限制性內切 酶BamHI、XhoI購于Takara;連接酶和ligation buffer購于SCIENTIFIC;PCR引物購于生工 生物工程(上海)股份有限公司；DNA上樣緩沖液，DNA標準分子量Marker購于生工生物工程 (上海)股份有限公司；蛋白雙染色Marker購于生工生物工程(上海)股份有限公司。
[0027] 下列實施中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件。
[0028] 1.在本發明的下述實施例中，使用的大腸桿菌培養基配制方法如下：
[0029] (1)LB 培養基
[0030] 1L的LB液體培養基中加入10.0g NaCl，10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，定容到1L 后，用pH計檢測其pH，一般顯酸性，然后用5mol/L的NaOH慢慢調節pH至7.0。若是配置固體培 養基，可在配好的液體培養基的基礎上，按1.5 %的含量加入瓊脂粉。密封好后，用高壓蒸汽 滅菌鍋在121°C下，滅菌30min，待冷卻后放在4 °C低溫冰箱中保存待用。
[0031] (2)TB 培養基
[0032]將下列組分溶解在0.9L水中：胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。將各組分溶 解后高壓滅菌。冷卻到60°C，再加入100mL滅過菌的磷酸緩沖液(2.31g的KH2P〇4和12.54g的 K2HPO4溶于 100mL水中。）。
[0033] 2.底物苯乙胺和產物苯乙酮含量的檢測方法:將反應液加氯化鈉到飽和，用等體 積含有內標(十二烷）乙酸乙酯進行萃取，取有機相用無水硫酸鈉干燥，在氣相色譜儀上進 行分析，在進樣口 250 °C，柱溫120 °C，檢測器250 °C下進行檢測。
[0034]實驗例1轉氨酶基因的篩選和分析
[0035] 通過對NCBI基因數據庫進行篩選和分析，確定在惡臭假單胞菌Pseudomonas putida基因組中與紫色色桿菌Chromobacterium violaceumCV2025轉氨酶具有較高同源性 的蛋白基因序列為候選研究對象，基因序列SEQ ID N0.2所示。
[0036] 實驗例2重組表達載體pET28a_PpTA構建
[0037]根據基因序列（P p T A )設計引物，P p T A基因上游引物為 C G C G G A T C CATGAGTGAAAAGAATTCGCAGACC，下游弓| 物為 CCCCTCGAGTCAGCGGACAGCTTCGTAGGTCAGG;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。 下劃線部分為BamHI和Xhol酶切位點。再以惡臭假單胞菌Pseudomonas putida基因組為模 板PCR擴增得到PpTA基因，瓊脂糖凝膠電泳結果表明擴增得到的基因大小與理論值一致。將 回收的PpTA基因和pET28a，用限制性內切酶BamHI和Xho I在37 °C水浴中酶切2小時，經純化 回收的目的片段與質粒在T4連接酶的作用下室溫過夜連接，得到重組表達載體pET28a-PpTA。將重組表達載體轉化至大腸桿菌BL21(DE3)的感受態細胞中，在含有卡納抗性的平板 上對陽性重組體進行篩選，挑取單菌落PCR驗證挑選陽性子。
[0038]可通過將本發明的重組表達載體轉化至宿主微生物中制得所述重組表達轉化體。 所述宿主微生物可以是本領域的各種常見宿主微生物，只要該微生物可以穩定的自行復制 重組表達載體，且能有效的表達所攜帶的本發明的PpTA基因即可。本發明優選大腸桿菌，更 優選大腸桿菌BL21(DE3)。
[0039]實驗例3大腸桿菌重組PpTA的表達及純化
[0040]所述的培養重組表達轉化體中所用的培養基可以是本領域內常規的任何可使轉 化體生長并且產生本發明PpTA的培養基，對于大腸桿菌接種時優選LB培養基，擴培時優選 TB培養基。培養方法和培養條件沒有特殊限制，可以根據宿主類型和培養方法等因素的不 同按本領域普通知識進行選擇，只要能使轉化體生長并且產生本發明PpTA即可。其他培養 轉化體具體操作均可按本領域常規操作進行。
[0041]對于大腸桿菌菌株本發明選用下述方法:將實施例2中構建好的菌株，接種至含卡 納的LB培養基中，37°C180r振蕩培養8h，按2%的接種量接入裝有50mL TB培養基的搖瓶中， 37°C 180r培養，當培養液的0D6Q()達到0.6時加入終濃度為0.1 mM的IPTG，20°C，180r誘導12h。 4°C，8000r離心5min收集菌體，用100mM pH為7.0的磷酸鈉緩沖液洗滌兩次。將獲得的菌體 用100mM pH為7.0的磷酸鈉緩沖液懸浮，冰浴中超聲破碎，離心收集上清，即為PpTA的粗酶 液。上清液中的重組蛋白經過鎳柱進行純化，500mM咪唑進行洗脫，獲得純化的PpTA，聚丙烯 酰胺凝膠電泳結果見圖1。
[0042]實施例4 PpTA酶活測定
[0043]利用氣相色譜儀檢測苯乙酮的生成量計算重組轉氨酶PpTA的酶活。
[0044] PpTA活力測定方法如下：在lmL體系中，50mM苯乙胺，0 · ImM PLP，50mM丙酮酸鈉， 0.1 mM磷酸緩沖液(pH7)，30°C、200r震蕩反應lOmin后按苯乙酮含量測定方法進行測定。 [0045] PpTA轉氨酶活力單位定義:在上述條件下，lmL轉氨酶酶液每分鐘轉化底物生成1μ mol苯乙酮定義為一個酶活單位(U)。
[0046] 公式:酶活⑶=a/(c · t)
[0047]比活力(U/mg)=酶活/m
[0048] 其中：a:苯乙酮的物質的量(μπιο?)
[0049] t:反應時間(min)
[0050] c:酶的體積(mL)
[0051] m:酶液中蛋白含量(mg)
[0052] 實驗例5 PpTA酶學性質
[0053] 接種子液后，在20°C誘導12h，收取菌液后進行細胞超聲破碎5min，8000g、4°C離心 5min，取上清粗酶液，測定PpTA酶活，對酶純化之后進行酶學性質表征。
[0054] (1)ΡρΤΑ 最佳 pH 測定
[0055] 分別取pH為5、6、7、8、9、10、11、12測定PpTA的酶活，繪制酶活隨pH的變化曲線，比 較在不同pH值條件下PpTA酶活的大小，確定PpTA的最適催化pH。實驗結果如圖2所示。
[0056] (2)PpTA最佳溫度測定
[0057]分別取溫度為20°C、25 °C、30°C、35 °C、40°C、45 °C、50°C，測定PpTA的酶活，繪制酶 活隨溫度的變化曲線，比較在不同溫度條件下PpTA酶活的大小，確定PpTA的最適催化溫度。 實驗結果如圖3所示。
[0058] (3)PpTA溫度穩定性
[0059] 分別取溫度為冰浴，4°C、20°C、30°C、40°C、50°C、60°C，在相應溫度下放置2h后，測 定PpTA殘余的酶活，繪制酶活隨溫度的變化曲線，確定PpTA的溫度穩定性。實驗結果如圖4 所示。
[0060] (4)不同底物濃度對PpTA酶活影響測定
[0061 ]分別取底物苯乙胺的濃度為 5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、 90mM、100mM，測定PpTA的酶活，制作酶活隨底物濃度的變化曲線，比較在不同底物條件下 PpTA酶活的大小。實驗結果如圖5所示。
[0062]實驗例6 PpTA拆分外消旋苯乙胺的轉化率及e.e.值測定 [0063] 標準反應體系為1 mL的10OmM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5OmM外消旋苯乙胺， 0 · ImM PLP，50mM丙酮酸鈉，1 · 0-3 · OU/mL PpTA酶液。反應液置于1 · 5mL離心管中，30 °C，200r 振蕩反應〇-24h，隔不同時間進行取樣測定反應體系中苯乙酮的含量。取反應液500yL，加氯 化鈉到飽和，用等體積乙酸乙酯進行萃取，充分震蕩混勻后，12000r離心5min，取有機相用 無水硫酸鈉干燥，用氣相色譜儀測定苯乙酮的含量，以4-二甲氨基吡啶在醋酸酐中的濃度 為50mg/mL為衍生劑，同時在40°C、700r下衍生有機相，再與飽和氯化胺溶液混合均勻后離 心，取有機相，無水硫酸鈉干燥后用于氣相色譜儀測定底物e.e.值。實驗結果如表1所示。 [0064]實驗例7 PpTA拆分外消旋1-甲基-3-苯基丙胺的轉化率及e.e.值測定 [0065] 標準反應體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有10mM 1-甲基-3-苯基丙 胺，0.1 mM PLP，1 OmM丙酮酸鈉，4U/mLPpTA。反應液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應 0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉化率和e.e.值。實驗結果如表1所示。
[0066]實施例8 PpTA拆分外消旋苯甘氨醇的轉化率及e.e.值測定 [0067]標準反應體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5mM外消旋苯甘氨醇， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉化率和e. e.實驗結果如表1所示。
[0068]實施例9 PpTA拆分外消旋1-氨基茚滿的轉化率及e.e.值測定
[0069] 標準反應體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有10mM外消1-氨基茚滿， O.lmM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振蕩反應0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉化率和e. e.實驗結果如表1所示。
[0070] 實施例10 PpTA拆分外消旋1，2，3，4_四氫-1-萘胺的轉化率及e.e.值測定
[0071 ] 標準反應體系為lmL的100mM pH8.0的磷酸鉀緩沖液，含有5mM外消旋1，2，3，4-四 氫-1-萘胺，〇. ImM PLP，10mM丙酮酸，4U/mLPpTA。反應液置于1.5mL離心管中，30°C，200r振 蕩反應0-24h，隔不同時間進行取樣測定轉化率和e. e.實驗結果如表1所示。
[0072]表1. PpTA拆分外消旋手性胺的轉化率及e.e.值
[0073]
[0074]表中la:外消旋苯乙胺；lb:外消旋1-甲基-3-苯基丙胺；lc:外消旋苯甘氨醇；Id: 外消旋1_氨基諱滿;le:外消旋1,2,3,4-四氫-1-萘胺;上述外消旋胺的結構式如下：
[0076]當然，在本發明的某些實施例中反應體系中PLP輔酶的添加量還可以為O.OlmM、 1.OmM〇
【主權項】
1. 轉氨酶，其特征在于，是如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列。2. 轉氨酶的基因，其特征在于，是如SEQ ID NO.2所示的堿基序列。3. 如權利要求1所述的轉氨酶，其特征在于，所述轉氨酶來源于惡臭假單胞菌 Pseudomonas putida〇4. 權利要求1或3所述轉氨酶或者是權利要求2所述轉氨酶的基因在拆分外消旋胺制備 手性胺中的應用。5. 根據權利要求4所述的應用，其特征在于，該應用是在轉氨酶、氨基供體、氨基受體以 及PLP輔酶存在下，反應體系中底物外消旋胺的其中一個對映體發生氧化反應生成酮，剩下 另一個未反應的對映體。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在pH為5.0~11.0的反 應體系中實現的。7. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，外消旋胺的拆分是在4~60°C的反應體系 中實現的。8. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述反應體系中PLP輔酶的添加量為0.01 ~1·0 mM〇9. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述反應體系中底物外消旋胺的添加量為 5.0~100.0 mM〇
【文檔編號】C12P13/00GK105969746SQ201610458515
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】張建棟, 范曉軍, 武華磊, 張照昱, 常宏宏
【申請人】太原理工大學