一種皮膚成纖維細胞提取制備方法
【專利摘要】本發明公開一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，包括下述步驟：切取人體腹部皮膚，置于含有100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中漂洗；將漂洗后皮膚剪成0.8?1.2mm3的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質酸酶300U/ml的DMEM中，4℃條件下放置過夜；按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，離心收集細胞，用DMEM洗脫后開放培育48h；待培育的細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗，加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液消化；加入含有15％人自體血清的α?MEM培養液吹打終止消化，以1:2或1:4的比例傳代培養48h；取細胞懸液移入離心管中，4?8℃，1000rpm，10～30min條件下離心。本發明提供了充足、可靠的成纖維細胞滿足提取。
【專利說明】
_種皮膚成纖維細胞提取制備方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物細胞技術領域，涉及一種皮膚成纖維細胞提取制備方法。
【背景技術】
[0002]目前最常用的體細胞基因治療革El細胞有:骨髓細胞、成纖維細胞、角質細胞、肝細胞、內皮細胞、肌細胞等，成纖維細胞是皮膚的主要細胞成分，具有合成和分泌三種纖維APSC多能細胞以及基質的功能，在間質的更新和創傷修復過程中，具有十分重要的作用。成纖維細胞以其眾多的優點成為一種理想的靶細胞，皮膚為人體最大的器官，成纖維細胞較容易獲取、培養、傳代及凍存，從而使成纖維細胞用于基因治療成為可能。
[0003]現有技術中，皮膚成纖維細胞體外培養常用的方法為組織貼壁法和霉消化法。前者由于皮膚致密、質硬、不宜剪碎，在貼壁時容易造成組織塊干燥脫水，細胞不宜獲取營養，引起細胞破壞死亡的情況，同時還存在不能短期內獲取大量細胞及增殖能力不足的缺陷；后者存在對細胞損傷大、并且對纖維性結締組織無效的不足。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種皮膚成纖維細胞提取制備方法。
[0005]本發明的目的可以通過以下技術方案實現:
[0006]—種皮膚成纖維細胞提取制備方法，該方法包括下述提取步驟:
[0007]I)切取人體腹部皮膚，置于含有100U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中漂洗；
[0008]2)將漂洗后皮膚剪成0.8-1.2mm3的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質酸酶300U/ml的DMEM中，4°C條件下放置過夜；
[0009]3)按1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液，離心收集細胞，用DMEM洗脫后開放培育48h;
[0010]4)待培育的細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗，加入含有0.25 %胰酶和0.02% EDTA的PBS消化液消化；
[0011 ] 5)加入含有15 %人自體血清的α-ΜΕΜ培養液吹打終止消化，以1: 2或1:4的比例傳代培養48h，制成細胞懸液；
[0012]6)取細胞懸液移入離心管中，4-8°C，lOOOrpm，10?30min條件下離心，提取皮膚成纖維細胞。
[0013]步驟I)中，切取所述的人體腹部皮膚大小為2-3cm2，PBS反復漂洗3-6次，剪棄脂肪和結締組織。
[0014]步驟3)中，離心步驟為，37 °C、180rpm離心20min，血清終止后，100rpm離心1min
收集細胞。
[0015]步驟3)中，DMEM洗脫2次后，用含有15%人自體血清的α-ΜΕΜ培養液調定細胞密度，以每毫升2-4 X 15細胞接種，37°C，5 %CO2，90%適度條件下開放培育。
[0016]步驟4)中，用無鈣鎂離子的PBS漂洗I次，PBS消化液消化2-3min。
[0017]步驟4)中，傳代培養為:置于37°C，5%CO2，90 %適度條件下開放培養。
[0018]本發明的有益效果:本發明利用膠原酶、透明質酸酶的強消化能力，且低溫條件下長時間消化對細胞損傷力小等特點，實現了多種酶聯合消化提取皮膚成纖維細胞；
[0019]本發明方法只需2-3cm2的小面積皮膚即可獲得較多的原代細胞，通過傳代得到高純度的成纖維細胞，細胞經過擴增大量繁殖，在短時間內(4周左右)可達到18級，從而提供了充足、可靠的成纖維細胞滿足提取。
【具體實施方式】
[0020]下面將結合本發明實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[0021]實施例1
[0022]皮膚成纖維細胞提取制備方法，首先手術切取3cm2人體腹部皮膚，置于含有IlOU/ml氨芐青霉素和110mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復3次經過PBS漂洗后，剪棄脂肪和結締組織；
[0023]將皮膚剪成1.21111113左右的小塊，加入含有膠原酶2001]/1111、透明質酸酶3001]/1111的DMEM中，4 0C條件下放置過夜(12h);
[0024]按1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%EDTA的PBS消化液，37°C、180rpm離心20min，血清終止;再在100rpm離心條件下1min收集細胞；用DMEM洗脫2次后，用含有15%人自體血清的α-ΜΕΜ培養液調定細胞密度，以每毫升4 X 15細胞接種，37°C，5 %CO2，90 %適度條件下開放培育48h;
[0025]當培養的皮膚成纖維細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗I次，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液消化3min;加入含有15 %人自體血清的α-ΜΕΜ培養液吹打終止消化，以1: 2的比例傳代，置于37 °C，5 %⑶2，90 %適度條件下開放培養48h制成細胞懸液；
[0026]取細胞懸液移入離心管中，8°C，1000rpm，30min條件下離心，提取皮膚成纖維細胞。
[0027]實施例2
[0028]皮膚成纖維細胞提取制備方法，首先手術切取2cm2人體腹部皮膚，置于含有10U/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中，反復5次經過PBS漂洗后，剪棄脂肪和結締組織；
[0029]將皮膚剪成0.81111113左右的小塊，加入含有膠原酶2001]/1111、透明質酸酶3001]/1111的DMEM中，放置40C過夜；1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 %EDTA的PBS消化液，37 °C、180rpm空氣搖床20min，血清終止；100rpm離心1min收集細胞;DMEM洗脫2次后，用含有15 %人自體血清的α-ΜΕΜ培養液調定細胞密度，以每毫升2 X 15細胞接種，37°C，5 %CO2，90 %適度條件下開放培育48h;
[0030]當培養的皮膚成纖維細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗I次，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的I3BS消化液消化2-3min ；加入含有15 %人自體血清的α-ΜΕΜ培養液吹打終止消化，以1:4的比例傳代，置于37 °C，5 % C02，90 %適度條件下開放培養48h制成細胞懸液;取細胞懸液移入離心管中，4°C，lOOOrpm，1min條件下離心，提取皮膚成纖維細胞。
[0031]本發明利用膠原酶、透明質酸酶的強消化能力，且低溫條件下長時間消化對細胞損傷力小等特點，實現了多種酶聯合消化提取皮膚成纖維細胞;本發明方法只需2-3cm2的小面積皮膚即可獲得較多的原代細胞，通過傳代得到高純度的成纖維細胞，細胞經過擴增大量繁殖，在短時間內(4周左右)可達到18級，從而提供了充足、可靠的成纖維細胞滿足提取。
[0032]在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0033]以上公開的本發明優選實施例只是用于幫助闡述本發明。優選實施例并沒有詳盡敘述所有的細節，也不限制該發明僅為所述的【具體實施方式】。顯然，根據本說明書的內容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實施例，是為了更好地解釋本發明的原理和實際應用，從而使所屬技術領域技術人員能很好地理解和利用本發明。本發明僅受權利要求書及其全部范圍和等效物的限制。
【主權項】
1.一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，該方法包括下述提取步驟: 1)切取人體腹部皮膚，置于含有?οου/ml氨芐青霉素和100mg/ml硫酸鏈霉素的PBS中漂洗； 2)將漂洗后皮膚剪成0.8-1.2mm3的小塊，加入含有膠原酶200U/ml、透明質酸酶300U/ml的DMEM中，4°C條件下放置過夜； 3)按1:1的比例加入含有0.25 %胰酶和0.02 % EDTA的PBS消化液，離心收集細胞，用DMEM洗脫后開放培育48h; 4)待培育的細胞長成單層后，用無鈣鎂離子的PBS漂洗，加入含有0.25%胰酶和0.02 %EDTA的PBS消化液消化； 5)加入含有15%人自體血清的α-ΜΕΜ培養液吹打終止消化，以1:2或1:4的比例傳代培養48h，制成細胞懸液； 6)取細胞懸液移入離心管中，4-8°C，lOOOrpm，10?30min條件下離心，提取皮膚成纖維細胞。2.根據權利要求1所述的一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，步驟I)中，切取所述的人體腹部皮膚大小為2-3cm2，PBS反復漂洗3-6次，剪棄脂肪和結締組織。3.根據權利要求1所述的一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，步驟3)中，離心步驟為，37 °C、180rpm離心20min，血清終止后，100rpm離心1min收集細胞。4.根據權利要求1所述的一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，步驟3)中，DMEM洗脫2次后，用含有15 %人自體血清的α-ΜΕΜ培養液調定細胞密度，以每毫升2_4 X 15細胞接種，37°C，5%CO2，90 %適度條件下開放培育。5.根據權利要求1所述的一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，步驟4)中，用無鈣鎂離子的PBS漂洗I次，PBS消化液消化2-3min。6.根據權利要求1所述的一種皮膚成纖維細胞提取制備方法，其特征在于，步驟4)中，傳代培養為:置于37 °C，5 % CO2，90 %適度條件下開放培養。
【文檔編號】C12N5/071GK105969719SQ201610570570
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月19日
【發明人】張正亮
【申請人】安徽惠恩生物科技股份有限公司