產纖維素酶細菌及應用
【專利摘要】本發明涉及高效纖維素酶產生菌及產酶條件，具體的說是一株產纖維素酶細菌及產酶條件。細菌(Novosphingobium sp.)YIC32，已于2016年4月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(簡稱GDMCC，地址為：廣東省廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓)，其保藏編號為GDMCC No.60031。本發明菌株生長速度快，纖維素酶活高，產酶能力強，不會對自然界的碳循環產生負面影響，不會對環境造成危害，是應用于秸稈腐熟生產有機肥料、秸稈還田、促進生態恢復和保護生態環境、飼料加工等行業的好材料。在農林廢棄物回收利用過程中可發揮重要作用。GDMCC No：6003120160421
【專利說明】
產纖維素酶細菌及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及產纖維素酶，具體的說是一種產纖維素酶細菌及應用。
【背景技術】
[0002] 纖維素是自然界中分布最為廣泛、產量最為豐富的可再生資源，廣泛存在于植物 的根莖葉中。我國是農業大國，每年秸桿產量約為7億噸左右，秸桿中的主要成分為纖維素。 纖維素降解后可轉化為生物燃料、優質飼料等物質。然而在自然界中，纖維素降解困難，主 要源于其特殊的結構。纖維素是由葡萄糖通過β_(1，4)糖苷鍵連接而成的線狀大分子聚合 物。纖維素酶是能夠將纖維素降解為葡萄糖的一類酶的總稱，根據其催化功能分為三大類： 1)葡聚糖內切酶(1，4-0-D-glucan glucanohydrolase):該酶能夠隨機切割纖維素多糖鏈 內的無定型區，產生不同長度的寡糖和新鏈末端；2)葡聚糖外切酶（l，4-i3-D-glucan cellobilhydrolase):作用于纖維素還原性和非還原性的纖維素多糖鏈的末端，產生葡萄 糖或纖維二糖;3)β_葡聚糖苷酶(β-l，4-glucosidase):該酶功能為水解纖維二糖產生葡萄 糖。由于纖維素酶的三個組分經過協同作用，將大分子的纖維素降解為低分子量的寡糖、雙 糖或多糖，而被廣泛應用于食品加工、釀造、造紙、飼料添加劑、紡織、醫藥等工農業領域。使 得纖維素酶成為酶制劑工業中的一個新的增長點。纖維素酶主要由微生物產生，受制于纖 維素酶制劑工業化生產的因素主要有菌種和酶活及產量，因而高酶活微生物的篩選和產酶 條件的優化尤為重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的是提供一種高效產纖維素酶細菌及其應用。
[0004] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0005] 一種高效產纖維素酶細菌，細菌(Novosphingobium sp. )"HC32,已于2016年4月21 日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(簡稱GDMCC，地址為:廣東省廣州市先烈中路100號大 院59號樓5樓），其保藏編號為GDMCC No.60031。
[0006] 所述產纖維素酶細菌分離自粉碎的蘋果樹枝條自然發酵腐熟的木肩中，通過纖維 素酶活的測定及菌種鑒定表明，該菌是一株產酶能力強、纖維素酶活高的細菌菌 (Novosphingobium sp.)。對該菌進行16S rRNA基因序列分析，并通過在GenBank中比對發 現，本發明的細菌擴增的16S rRNA序列與Novosphingobium panipatense SM16T(登錄號： NR044210 )相似性最高，為99 %。從而將分離出來的細菌命名為Novosphingobium sp.YIC32。
[0007] 所述細菌(Novosphingobium sp. )YIC32在生產纖維素酶中的應用。
[0008] 進一步的說，將所述細菌(Novosphingobium sp. )YIC32于羧甲基纖維素鈉產酶培 養基中培養，獲得纖維素酶。
[0009]所述羧甲基纖維素鈉產酶培養基成分為：羧甲基纖維素鈉5~15g、KH2P〇4 lg、 恥如33~1(^、1((：10.58、]\^504 0.58、蒸餾水10001111、卩6504.7!120 0.018，調節口11在5.5~ 6.0，調口!1在5.5~6.0，于121°〇，0.11]\^?下滅菌3〇111；[11備用。
[0010] 更進一步的說，將所述細菌(Novosphingobium sp. )YIC32在羧甲基纖維素鈉產酶 培養基中培養獲得纖維素酶;其中，羧甲基纖維素鈉產酶培養基的pH=5、羧甲基纖維素鈉 濃度為12.5g/L、NaN0 3濃度為5g/L時纖維素內切酶酶活最高，為2·45±0·05?υ/πιΙ^ρΗ = 5、 羧甲基纖維素鈉濃度為12.5g/L、NaN03濃度為3g/L時濾紙酶活、外切酶酶活最高，產酶能力 最強，濾紙酶活達20.75 ± 1.61 IU/mL，外切酶產酶能力最強，酶活達47.72 ± 0.24IU/mL。
[0011] 本發明所具有優點：
[0012] 1.本發明的細菌YIC32具有產纖維素酶活高的特性，該菌在纖維素篩選平板上降 解圈/菌落直徑達到4.0，在發酵培養基中酶活較高，濾紙酶活為12.37 ± 0.13IU/mL，內切酶 酶活為 2.45 ± 0.05IU/mL，外切酶酶活為 23.60 ± 0.887IU/mL。
[0013] 2 ·經本發明優化后，該菌產酶能力明顯提高，濾紙酶活為20 · 75 ± 1 · 61 IU/mL，內切 酶酶活為 2.45 ± 0.05IU/mL，外切酶酶活為47.72 ± 0.24IU/mL。
[0014] 3.本發明菌株分離自猜桿腐熟發酵的猜桿中，屬于Novosphingobium菌株，因而無 毒無害，未經遺傳改造，可放心應用到秸桿堆肥腐熟、秸桿還田、飼料加工、纖維素酶工程領 域中。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發明實施例提供的菌株YIC32產纖維素酶的剛果紅染色前照片。
[0016] 圖2為本發明實施例提供的菌株YIC32產纖維素酶的剛果紅染色照片。
[0017]圖3為本發明實施例提供的菌株YIC32培養條件優化前后纖維素酶酶活。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例對本發明作進一步說明。實施例旨在對本發明進行舉例描述，而 非以任何形式對本發明進行限制。
[0019] 實施例1:菌株YIC32的獲得
[0020]從粉碎的蘋果樹枝條堆肥腐熟物中采集約lg腐熟物，進行梯度稀釋，從ΠΓ1~10 _8,分別吸取l〇〇yL懸濁液進行涂布至羧甲基纖維素鈉固體培養基，28°C倒置培養3-5天，分 別挑取單菌落至PDA培養基平板，反復劃線直至純化后轉接至PDA培養基斜面(參見圖1)。將 純化后的菌株分別轉接至羧甲基纖維素鈉固體培養基，培養3天，測定菌落直徑后，用lmg/ ml的剛果紅溶液染色lh，棄去染料，加入lmol/L的NaCl溶液脫色lh，然后用去離子水沖洗3-5遍后測定透明圈直徑。一般說來，比值的大小與菌株降解纖維素能力大小有關。水解圈和 菌株直徑的比值越大，菌株降解纖維素的能力越強，因此比值大小的定性試驗，直接反映了 菌降解纖維素的的能力。因此，本研究選取了水解圈和菌株直徑的比值最大的菌株YIC32作 為研究對象。
[0021] 羧甲基纖維素鈉固體培養基:羧甲基纖維素鈉5g、KH2P〇4 lg、NaN〇3 3g、KCl 0.5g、 MgS〇4 0 · 5g、蒸餾水 1000ml、FeS〇4.7H200 · Olg，瓊脂粉15g。（調pH在5 · 5-6 · 0，于121°C， 0· llMpa下滅菌30min備用）。
[0022] PDA培養基：去皮馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蒸餾水1000ml、1.5%瓊脂。（自然pH值， 于 121°C，0· llMpa下滅菌30min備用）。
[0023] 1)菌株鑒定
[0024] 將上述純化獲得的產纖維素酶活高的菌株進行菌落觀察，在TOA固體培養基上，菌 落表面濕潤，黃綠色，為典型細菌的表型特征。
[0025] 分子鑒定:為了確定本實施細菌菌株YIC32的系統進化地位，對其16S rRNA基因序 列測定與系統發育分析。
[0026]首先提取該菌株的基因組DNA，并擴增其16S rRNA的基因序列，PCR引物為27F: (AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，1492R:(AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG)，將PCR產物進行 測序并進行序列分析，表明，與Novosphingobium panipatense SM16T(登錄號：NR044210) 相似性最高為99 %。
[0027] Novosphingobium sp.YIC32的 16S rRNA基因序列：
[0029] 綜合以上鑒定結果，將菌株HC32定名為Novosphingobium sp.;已于2016年4月21 日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(簡稱GDMCC，地址為:廣東省廣州市先烈中路100號大 院59號樓5樓），其保藏編號為GDMCC No.eOOSUNovosphingobium sp.YIC32,簡稱菌株 YIC32〇
[0030] 上述細菌菌菌株YIC32降解纖維素能力強，酶活高，未進行遺傳改造。當菌體被釋 放入自然環境后，對人、動植物無害，不污染環境，不能夠促進秸桿還田，農林廢棄物的降 解，在農業上有潛在的應用價值。
[0031 ] 所得Novosphingobium sp.YIC32細菌菌株的實驗室保藏方式：
[0032]短期保藏方式為，接種至PDA固體斜面，待菌落長好后保藏于4°C冰箱內，此保藏方 式用于不超過3個月短期保藏；
[0033] 長期保藏方式為:將細菌菌體加入終濃度為20%甘油中混勻并保藏至-80 °C冰箱 中，此保藏方式大約可保藏10年。
[0034] 實施例2產酶能力及其他特性分析
[0035] 1)菌株YIC32的產纖維素能力初篩分析
[0036]將上述獲得細菌菌株YIC32點接至羧甲基纖維素鈉培養基固體平板上，28°C培養5 天，測定菌落直徑后，用lmg/mL的剛果紅溶液染色lh后，棄去染料，加入lmol/L氯化鈉溶液 脫色lh，測定透明圈直徑。透明圈直徑/菌落直徑為4.0(參見圖1，2)，因此，該菌株有著很強 的降解纖維素能力。
[0037]其中，羧甲基纖維素鈉固體培養基成分:羧甲基纖維素鈉5g、K2HP〇4lg、NaN03 3g、 KC1 0.5g、MgS〇4 0.5g、蒸餾水 1000ml、FeS〇4 O.Olg，瓊脂 15g(pH 5.5-6.0)。
[0038] 2)菌株YIC32的纖維素酶活測定
[0039] 對產纖維素酶菌株進行酶活的測定，酶活力的測定參考Miller G.L的DNS法，這種 方法可以對菌株產纖維素酶活強度進行有效定量。酶活力定義在50°C條件下lmL粗酶液在 lmin內水解生成1 .Oyg的葡萄糖，稱為1個纖維素酶酶活力單位(yg/min，IU)。
[0040] 將上述獲得菌株接種到50ml(100ml三角瓶)羧甲基纖維鈉液體培養基中，于28°C、 180r/min搖床培養，3d后取菌液，6000r/min離心10min，上清即為粗酶液。
[0041 ] 其中，羧甲基纖維鈉液體培養基為：羧甲基纖維素鈉5g、K2HP〇41 g、NaN03 3g、KC1 0.5g、MgS〇4 0.5g、蒸餾水 1000ml、FeS〇4 O.Olg，瓊脂 15g(pH 5.5-6.0)。
[0042] 對粗酶液進行三種酶活的測定：
[0043] ①濾紙酶活的測定。將新華1號濾紙（lcmX3cm)卷成小卷，放進15ml EP管內，加入 1.75mL HAc-NaAc緩沖液(pH=4.8)，再加入0.25mL粗酶液，輕輕搖勻，使濾紙完全浸泡在液 體中，50°C保溫lh后，加入3ml DNS溶液，放于沸水浴中煮沸lOmin，用冷水立即終止反應。在 波長為540nm下測定光吸收值(0D值）。
[0044]②內切酶活測定。移取含有0.5%CMC-Na的醋酸緩沖液1.75mL于試管中，加入粗酶 液0.25mL，50°C保溫30min，加入3ml DNS溶液，放于沸水浴中煮沸lOmin，置冷水中終止反 應。在波長為540nm下測定光吸收值(0D值）。
[0045] ③外切酶活測定。移取含有0.5%微晶纖維素的醋酸緩沖液1.75mL于試管中，加入 酶液0.25mL，于50°C保溫2h后，加入3ml DNS溶液，置沸水浴中煮沸lOmin，置冷水中終止反 應。在波長為540nm下測定光吸收值(0D值）。
[0046] 將上述三種酶活的測定的對照組選用經沸水煮lOmin后冷水冷卻的上述粗酶液。 每個樣品做三個重復。測定結果顯示菌株YIC32有著較高的酶活，濾紙酶活為12.37 ± 0.13IU/mL，內切酶酶活為2.45 ±0.05IU/mL，外切酶酶活為23.60 ±0.89IU/mL(參見圖3)。
[0047] 實施例3菌株YIC32產纖維素酶培養條件的優化
[0048] 纖維素酶的產生及分泌能力與菌的生長狀態和培養環境(如碳、氮源配比、pH等） 密切相關，本發明對發酵產酶過程中碳、氮源配比、pH進行了優化，最終使產酶能力顯著提 尚。
[0049]優化的基礎培養基為羧甲基纖維素鈉培養基，由于羧甲基纖維素鈉培養基配制完 成要求pH 5.5-6.0,這可能不是YIC32產纖維素酶的最優pH，且碳源、氮源的配比都影響著 產酶菌株的產酶能力，因此，本發明分別設置了？11 = 3,4,5,6,7,8-系列的?!1培養條件、羧 甲基纖維素鈉培養基中羧甲基纖維素鈉質量濃度百分比為〇.25%，0.5%，0.75%，1%， 1.25%-系列碳源濃度和恥勵3濃度為0.25%，0.3%，0.5%，1%，1.5%，2%-系列的氮源 濃度，并進行了正交試驗。
[0050]結果表明，羧甲基纖維素鈉培養基的pH=5、培養基中羧甲基纖維素鈉濃度為 12.5g/L、培養基中NaN03濃度為5g/L時纖維素內切酶酶活最高，為2.45 ± 0.05IU/mL= 5、羧甲基纖維素鈉濃度為12.5g/L、NaN03濃度為3g/L時濾紙酶活、外切酶酶活最高，產酶能 力最強，濾紙酶活達20 · 75 ± 1 · 61 IU/mL，外切酶產酶能力最強，酶活達47 · 72 ±0 · 24IU/mL。 培養條件優化后，濾紙酶活、外切酶酶活分別比原始酶活增加了67.74%和102.2% (參見圖 3)〇
【主權項】
1. 一種高效產纖維素酶細菌，其特征在于：細菌(Novosphingobium sp · )YIC32，已于 2016年4月25日保藏于廣東省微生物菌種保藏中心(簡稱GDMCC，地址為:廣東省廣州市先烈 中路100號大院59號樓5樓），其保藏編號為GDMCC No.60031。2. 按權利要求1所述的細菌的應用，其特征在于：所述細菌（Novosphingobium sp.) YIC32在生產纖維素酶中的應用。3. 按權利要求2所述的細菌的應用，其特征在于:將所述細菌(Novosphingobium sp.) YIC32于羧甲基纖維素鈉產酶培養基中培養獲得纖維素酶。4. 按權利要求2所述的細菌的應用，其特征在于:所述羧甲基纖維素鈉產酶培養基成分 為：羧甲基纖維素鈉5~15g、KH2P〇4 lg、NaN〇3 3~10g、KCl 0.5g、MgS〇4 0.5g、蒸餾水 1000ml、FeS〇4.7H20 0·Olg，調節pH在5·5~6·0〇
【文檔編號】C12N9/42GK105969689SQ201610378968
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】李巖, 解志紅, 王玲玲, 韓京龍, 常大勇, 劉衛, 任承鋼
【申請人】中國科學院煙臺海岸帶研究所