一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌，所述混合內(nèi)生真菌由臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌木霉屬（Trichoderma sp.）A菌株和鐮刀菌屬（Fusarium sp.）E菌株組成，其已于2016年1月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其中A菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 11909。本發(fā)明混合內(nèi)生真菌中所含菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，將該混合內(nèi)生真菌制備成應(yīng)用菌液，具有促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的作用，從而促進(jìn)植株生長。CGMCC No. 1190920160127CGMCC No. 1191120160127
【專利說明】
一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑増長的混合內(nèi)生真菌
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生菌的研究始于19世紀(jì)末，Vogl從黑麥草Lolium temulentum L.種子中分 離出第一株內(nèi)生菌。但真正開始大量研究植株中的內(nèi)生菌起始于上世紀(jì)八十年代，主要是 在溫帶地區(qū)、亞熱帶地區(qū)和熱帶地區(qū)的植被中開展研究。
[0003] 植物內(nèi)生真菌的分布廣、種類多，前人研究表明，絕大多數(shù)植物體內(nèi)都能分離得到 內(nèi)生真菌，由此可見內(nèi)生真菌普遍存在于植物體內(nèi)。在全世界范圍內(nèi)至少在80多個(gè)屬290多 種的禾本科農(nóng)作物中發(fā)現(xiàn)了內(nèi)生菌。目前從植物中分離的內(nèi)生菌根據(jù)其具有的獨(dú)特功能可 以分為：固氮菌、固鉀菌、固磷菌等植物促生菌、具有抗病蟲害的生防菌和具有促進(jìn)植物對(duì) 不良環(huán)境的修復(fù)能力的抗性菌。
[0004] 經(jīng)查閱文獻(xiàn)材料，目前有關(guān)內(nèi)生真菌對(duì)臺(tái)灣相思生長的影響研究還為空白。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌，其 所用菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，其制成的應(yīng)用菌液具有促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高 及地徑增長的作用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌，其由臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌木霉屬 (TYicAoc/erffia Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬（Fusarit/ffi Sj〇.)E菌株組成；所述木霉屬 (rricAoc/e_?a Sj〇.)A菌株和鏡刀菌屬(Ft/sari? Sj〇.)E菌株已于2016年1月27日在中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏(地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3 號(hào)），其中，A菌株的保藏號(hào)為CGMCCNo. 11911，E菌株的保藏號(hào)為CGMCCNo. 11909。
[0007] 所用臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌的分離、純化過程包括： A、 材料:將采集得到不同年份的根、枝莖、葉分成三個(gè)部分，用自來水清洗干凈，分裝到 自封袋內(nèi)，于4°C冰箱保存； B、 消毒:75%酒精漂洗30s-無菌水沖洗3-4次-15%的次氯酸鈉漂洗(根10min，莖5min， 葉2min)-無菌水沖洗4-5次;將樣品最后一次浸洗后的水盛于滅菌的小燒杯中，在平板上 劃線作為對(duì)照，以檢驗(yàn)樣品的消毒是否徹底，若干天后如有菌落生成，則表明樣品表面消毒 不徹底，需繼續(xù)調(diào)整消毒方法； C、 接種部位的選擇:葉片：葉尖部、葉中部和葉基部3個(gè)處理;枝莖:上中下分為3部位， 其中第3部位為枝莖交接處;根部:分為根尖和根基2個(gè)部分； D、 接種:將消毒后的外植體用接種刀切開，鋪放在培養(yǎng)基表面，于28°C恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培 養(yǎng)5-7天后觀察菌落生長狀況;有的菌株繁殖迅速，可先將其產(chǎn)生的菌株進(jìn)行分離純化;生 長緩慢且數(shù)量較少的菌株可延長觀察時(shí)間，直到其生長穩(wěn)定后純化； 固體培養(yǎng):使用改良馬丁固體培養(yǎng)基，配方為蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄 糖20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、瓊脂14 · Og/L、其它為無菌水，pH值6 · 4土 0.2，培養(yǎng)溫度為28 °C，培養(yǎng)方式為平板培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為48h; E、將分離繁殖出的不同種類的內(nèi)生真菌接入平板培養(yǎng)基進(jìn)行純化，經(jīng)過2-3次點(diǎn)接純 化、轉(zhuǎn)接后分別得到單一菌種的上述rricAoc/er?a S/7.和Fusari? S/7.功能菌株。
[0008]所得能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌可制備成應(yīng)用菌液，用于臺(tái) 灣相思苗木的根際土壤澆施與苗木直接接種。
[0009]所述應(yīng)用菌液的制備方法是分別將木霉屬（7>icAoc/er_ffla S/7. )A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h， 利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X10 6cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得;所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5. Og/L、酵母浸 出粉2. Og/L、葡萄糖20.0 g/L、磷酸氫二鉀1. Og/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4 土 0.2。
[0010]該應(yīng)用菌液的使用方法是按每株l〇〇mL將所得應(yīng)用菌液澆施于臺(tái)灣相思的根際。
[0011] 本發(fā)明所用菌株是從臺(tái)灣相思植株中分離純化得到的，其具有促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高 及地徑增長的作用，從而促進(jìn)植株生長。
[0012] 將該混合內(nèi)生真菌制備的應(yīng)用菌液通過澆施的方法接種于臺(tái)灣相思幼苗，測(cè)定接 種4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)臺(tái)灣相思的苗高、地徑。結(jié)果顯示，臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌AE處理的植株與對(duì) 照植株的苗高增長率、地徑增長率差異顯著，菌株AE處理的苗高增長率為對(duì)照的1.5倍菌株 AE處理的地徑增長率為對(duì)照的2.3倍，證明該混合內(nèi)生真菌AE對(duì)臺(tái)灣相思苗高、地徑的增長 具有明顯的促進(jìn)作用。
【具體實(shí)施方式】
[0013] -種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌，其由臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌木 霉屬（7>icAot/er?a Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬（Fusarit/ffi Sj〇.)E菌株組成；所述木霉屬 (rricAoc/e_?a Sj〇.)A菌株和鏡刀菌屬(Ft/sari? Sj〇.)E菌株已于2016年1月27日在中國微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其中，A菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 11909。
[0014] 所述能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌可制備成應(yīng)用菌液，用于臺(tái) 灣相思苗木的根際土壤澆施與苗木直接接種。
[0015]所述應(yīng)用菌液的制備方法是分別將木霉屬（7>icAot/er_ffla Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h， 利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X10 6cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得;所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.0g/L、酵母浸 出粉2.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、硫酸鎂0.5g/L、其它為無菌水、pH值6.4 土 0.2。
[0016] 為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明所述的 技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
[0017] 根際土壤澆施與苗木直接接種應(yīng)用 本試驗(yàn)采用土培盆栽試驗(yàn)，試驗(yàn)所用材料為福建省漳州市市林業(yè)局提供的臺(tái)灣相思一 年生苗。選擇長勢(shì)一致的臺(tái)灣相思苗木定植于直徑15cm、高10cm的塑料盆中。所用土壤是嚴(yán) 格經(jīng)過熏蒸消毒的黃心土。經(jīng)過混勻稱量，每盆放入3kg 土壤。經(jīng)過一個(gè)月的恢復(fù)性生長后， 連續(xù)三天于臺(tái)灣相思根際施入100mL濃度為5.5 X 106cfu/mL的菌液AE，另用蒸餾水溶液澆 施作為空白對(duì)照CK。
[0018] 菌液制備:將供試菌株分別接入40mL的液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其 中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖20.Og/L、磷酸氫二鉀1.Og/L、硫酸鎂0.5g/L、 其它為無菌水、pH值6.4 ± 0.2;在恒溫振蕩培養(yǎng)箱中經(jīng)過72h的培養(yǎng)，用無菌生理鹽水按十 倍稀釋法將菌液稀釋，利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5 X 106cfu/mL，再按體積比1:1將兩種菌液混合制得。
[0019] 于接種4個(gè)月、6個(gè)月時(shí)，采用鋼尺測(cè)定苗高，數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)定地徑，結(jié)果見表1。
[0020] 表1不同處理對(duì)臺(tái)灣相思幼苗地徑和苗高的影響
如表1所示，接種菌株AE的幼苗苗高增長率為47.432%，對(duì)照僅為26.438%，通過方差分 析可得，菌株AE處理后的臺(tái)灣相思幼苗苗高增長率與對(duì)照組相比達(dá)到極顯著水平（sig= 0.000，顯著水平為0.01)。接種菌株AE的幼苗地徑增長率為35.466%，對(duì)照僅為15.190%，與 對(duì)照組差異性達(dá)到極顯著水平(sig=0.001，顯著水平為0.01)。
[0021] 由此可見，本發(fā)明提供的混合內(nèi)生真菌能顯著促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑的增長， 從而促進(jìn)植株生長。
[0022] 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌，其特征在于:該混合內(nèi)生真 菌由臺(tái)灣相思內(nèi)生真菌木霉屬（yh'cAoc/ei-ffla Sj〇.)A菌株和鐮刀菌屬(Fusari? Sj〇.)E菌株 組成;所述木霉屬（rricAoc/erffia SjO. )A菌株和鐮刀菌屬(Fusari? SjO. )E菌株已于2016年1 月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心登記保藏，其中，A菌株的保藏號(hào) 為CGMCC No. 11911，E菌株的保藏號(hào)為CGMCC No. 11909。2. -種如權(quán)利要求1所述能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌的應(yīng)用，其 特征在于:將所述混合內(nèi)生真菌制備成應(yīng)用菌液，用于臺(tái)灣相思苗木的根際土壤澆施與苗 木直接接種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述能促進(jìn)臺(tái)灣相思苗高及地徑增長的混合內(nèi)生真菌的應(yīng)用，其特 征在于：所述應(yīng)用菌液的制備方法是分別將木霉屬（rricAot/eiwa s/7. )A菌株和鐮刀菌屬 印.）E菌株接入液體培養(yǎng)基，搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為28°C，培養(yǎng)時(shí)間48~72h， 利用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌液濃度，然后將菌液用超純水稀釋成5.5X106cfu/mL，再按體積比 1:1將兩種菌液混合制得； 所述液體培養(yǎng)基為改良馬丁培養(yǎng)基，其中蛋白胨5.Og/L、酵母浸出粉2.Og/L、葡萄糖 20 · Og/L、磷酸氫二鉀1 · Og/L、硫酸鎂0 · 5g/L、其它為無菌水、pH值6 · 4 ± 0 · 2。
【文檔編號(hào)】A01N63/04GK105969672SQ201610452322
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年6月22日
【發(fā)明人】周艷芬, 林晗, 陳燦, 林宇, 洪滔, 吳承禎
【申請(qǐng)人】福建農(nóng)林大學(xué)