模擬植物懸浮細胞與其內生真菌代謝交流的共培養裝置的制造方法
【專利摘要】本發明公開了模擬植物懸浮細胞與其內生菌體內代謝交流的體外共培養裝置，其裝置包括盛有培養基的培養瓶，一定分子量大小的透析袋，封口蓋及其固定器。其中，透析袋垂直浸入液面一定深度，透析袋兩端伸出瓶口，利用固定器將封口膜固定于培養瓶瓶口，透析袋內置有共培養的內生菌，袋外瓶內為植物懸浮細胞，培養瓶置于恒溫震蕩器中。通過緩慢的震蕩培養，內生菌與懸浮細胞的信號因子由透析膜孔一端進入另一端，從而模擬了菌與植物之間交流的過程。本發明裝置既模擬植物與內生菌的共生環境，又避免了植物細胞和內生真菌之間的相互混淆，可以分別收集細胞和菌體，并獨立地進行觀察和分析，操作簡單，價格低廉。
【專利說明】
模擬植物懸浮細胞與其內生真菌代謝交流的共培養裝置
技術領域
[0001] 本發明涉及一種模擬植物懸浮細胞與其內生真菌代謝交流的共培養裝置，屬于生 物技術領域，它可以創造一個模擬植物與菌的共生環境，研究植物與內生菌的相互作用和 相互關系。
【背景技術】
[0002] 大多數植物體內都存在著多種多樣的內生真菌，它們生活在植物組織內，但對植 物組織沒有引起明顯病害癥狀，包括那些在其生活史中的某一階段表面生的腐生菌和對宿 主暫時沒有傷害的潛伏病原菌和菌根菌。植物懸浮細胞是將來自于植物愈傷組織的單個細 胞或較小的細胞團分散在液體培養基內，安放于恒溫震蕩器內搖動培養。
[0003] 目前很多研究表明，內生真菌與宿主植物在長期進化過程中，它們之間已經形成 了復雜的內共生關系。內生真菌在長期與藥用植物共生的過程中，對藥用植物產生各種作 用，包括促進植物次級代謝產物合成，促進宿主植物生長發育，增強宿主植物的抗逆性。
[0004] 目前許多研究表明，植物懸浮細胞單獨培養條件下，產生的藥效次級代謝產物的 產量很低，通過使用內生真菌培養上清液刺激后，藥效產物有明顯的提高，但是以往的實驗 方法不能準確地模擬植物與內生菌之間的交互作用，也不能實時的觀察植物和菌的變化。
[0005] 結合體外環境與體內環境，為使植物與內生菌間信息能相互溝通，從而建立一個 類似于體內環境的共培養體系，該體系是植物懸浮細胞與其內生菌共培養，這是為研究植 物與其內生真菌相互作用機制而建立的模型，旨在模擬植物細胞與真菌之間信號交流環 境。然而，單純將懸浮細胞與真菌置于同一空間培養，難以將植物細胞和菌絲體分開;而將 二者完全分開阻礙了二者之間信號分子實時交流，更難以模擬植物體內真菌的生活環境。 所以急需研發一種既能實現兩者間信號分子實時交流，又方便分別收集真菌和細胞的共培 養裝置。本裝置對于研究和了解植物與內生真菌之間的相互作用和相互關系有極大的幫 助，并為以后的科學研究提供了極大的便利。
【發明內容】
[0006] 針對目前共培養技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種模擬植物懸浮細胞 與其內生真菌的共培養裝置，它模擬了植物與菌的共生環境，實現二者之間信號分子實時 交流，同時又避免兩者間的交叉污染，以便分別收集細胞和菌體進行后續實驗。
[0007] 本發明是一種模擬植物懸浮細胞與其內生真菌的共培養裝置，所述裝置包括透析 袋(3 )，其特征在于，通過透析袋(3)隔離植物懸浮細胞和內生菌。
[0008] 進一步優選的方案，所述透析袋(3)內部含有內生菌種，透析袋(3)外部含有植物 懸浮細胞。
[0009] 進一步優選的方案，所述裝置進一步包括封口蓋（1)，固定器(2)，培養瓶(4)，所述 的透析袋(3)中間呈U形插入裝有植物懸浮細胞及培養基的培養瓶(4)內，透析袋(3)內置有 內生真菌及一定量的培養基，透析袋(3)兩端伸出瓶口并使用封口蓋（1)蓋住瓶口，運用固 定器(2)固定，置于恒溫振蕩器，搖動培養。
[0010]進一步優選的方案，所述培養瓶(4)包括不同型號錐形瓶、燒杯或其它培養容器。
[0011] 進一步優選的方案，所述透析袋(3)為生物過濾膜，可以隔絕植物懸浮細胞和內生 真菌，而大分子的代謝產物可以自由通過。
[0012] 進一步優選的方案，所述透析袋(3)中間呈U形插入培養瓶，兩端延長至瓶口，沿瓶 口緊貼瓶外壁，下端比封口膜長〇. 5-3厘米。
[0013] 進一步優選的方案，所述透析袋(3)能夠通過在培養瓶瓶口拉伸透析袋，調節透析 袋浸入液面的高度，而調節培養基和透析袋接觸的面積。
[0014] 進一步優選的方案，所述封口蓋（1)包括紗布、封口膜、濾紙或其他隔菌透氣的封 口裝置。
[0015] 進一步優選的方案，所述固定器包括尼龍繩，橡皮圈、夾子或其它固定裝置。
[0016] 本發明進一步提供一種模擬植物懸浮細胞與其內生真菌的共培養方法，使用前述 的共培養裝置。
[0017] 進一步優選的，所述植物懸浮細胞是柴胡懸浮細胞。
[0018] 進一步優選的，所述共培養方法包括1)培養基的配置，優選馬鈴薯蔗糖培養基，MS 培養基母液的配置，激素母液的配置，2)內生真菌的分離，包括柴胡的清洗、浸泡、切片、培 養菌絲、收集內生真菌孢子，3)柴胡懸浮細胞的制備，包括柴胡種子的萌發、愈傷組織的誘 導、懸浮細胞體系的建立，4)共培養模型的建立。
[0019] 進一步優選的，所述方法包括5)代謝交流檢測，對柴胡懸浮細胞中的cAMP(環磷酸 腺苷）、cGMP(環磷酸鳥苷)和CaM(鈣調素)交流信號分子分析。
[0020] 進一步優選的，所述5)代謝交流檢測包括a. cAMP和cGMP的提取，b. CaM的提取，c. 狹葉柴胡懸浮細胞的cAMP、cGMP及CaM檢測。
[0021 ]進一步優選的，所述狹葉柴胡懸浮細胞的cAMP、cGMP及CaM檢測包括標準樣品的稀 釋與加樣、加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、終止、測定。
[0022]本發明為植物懸浮細胞與內生菌提供了一個體外的模擬共生環境，為探索菌和宿 主間共培養提供了一種可行裝置，該裝置可模擬植物體內環境，盡可能的使體內體外生長 環境一致，從而實現二者間信息實時交流，讓菌和宿主能夠相互促進生長繁殖，并增加藥效 次級代謝產物的產量。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明結構示意圖.
[0024] 1.瓶蓋2.瓶蓋固定器3.透析袋:含有MS培養基和內生真菌4.瓶內（透析袋外的 部分)為MS培養基和植物懸浮細胞
[0025] 圖2狹葉柴胡內生真菌Alternaria alternate CH5
[0026] A菌落形態B菌絲形態C孢子形態
[0027] 圖3狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild的愈傷組織和懸浮細胞
[0028] A愈傷組織B懸浮細胞C處于分裂階段的單個懸浮細胞
[0029] 圖4 MS培養基的共培養實物圖
[0030] A含有內生真菌的大分子透析袋B透析袋外瓶內的柴胡懸浮細胞
[0031] 圖5 cAMP標準曲線
[0032] 圖6 cGMP標準曲線
[0033] 圖7 CaM標準曲線
[0034] 圖8狹葉柴胡總RNA電泳圖
【具體實施方式】
[0035] 本發明包括:封□蓋（1)，固定器(2)，透析袋(3)，培養瓶(4)，如圖1所示，將培養瓶 (4)里加入培養基和植物細胞，用封口蓋（1)和固定器(2)封住培養瓶瓶口，置于恒溫震蕩器 內，搖動培養一段時間。
[0036] 當培養瓶內植物細胞生長到適合數量，取下固定器(2 )，打開封口蓋(1 )，將透析袋 (3)中間呈U形插入培養瓶(4)內，浸入液面以下。透析袋(3)-端固定在培養瓶瓶口，此時由 另一端加入培養基，并接入適量植物的內生菌種，將透析袋(3)在液面中的高度調整到適當 高度后，用固定器(2)固定透析袋兩端，蓋住封口蓋（1)，裝置重新置于恒溫震蕩器內搖動培 養。共培養結束后，分別收集植物懸浮細胞和內生菌，進行后續實驗。
[0037] 本發明裝置是在體外模擬植物與其內生菌共培養的裝置，使其盡可能的實現體內 體外的生長環境一致，從而使植物與內生菌間能相互交流，相互刺激，由此提高藥效代謝產 物的產量。
[0038] 具體實施案例:柴胡懸浮細胞與其內生真菌代謝交流對柴胡皂苷合成影響的檢測 及分析
[0039]利用該模型對柴胡懸浮細胞及其內生真菌的交流信號進行檢測并分析了共培養 對柴胡皂苷合成基因表達的影響。
[0040] 1培養基的配置
[0041] 1.1馬鈴薯蔗糖培養基(PDA)
[0042] 馬鈴薯200g，去皮切成碎塊，放入蒸餾水中煮爛，用紗布過濾除去馬鈴薯塊，加入 蔗糖20g，瓊脂15g溶于蒸餾水1000ml中。121°C高壓蒸汽滅菌20min，備用。
[0043] 1.2 MS培養基母液的配置
[0044]配置MS培養基時，一般將各成分歸類，配置成母液，并于冰箱4°C儲存，使用時再按 照所配置的倍數稀釋。以下為MS培養基母液的配方：
[0045]大量元素母液（X 20倍）
[0046]
[0047]微量元素母液（X 200倍）
[0049]有機成分母液（X 200倍）
[0051] 鐵鹽母液（X 100倍）[0052]
[0053]前三種母液按照配方分別稱取試劑，加入干凈燒杯中，加入適量去離子水充分混 勻后定容到500ml，置于儲存瓶內，經高壓蒸汽滅菌，待冷卻后于4°C冰箱儲存。
[0054]鐵鹽母液的配置:將兩者分別溶解于200ml去離子水中，在攪拌下混合均勻，最后 加 NaOH調節pH值至5.5，定容至500ml，直接儲存于4°C冰箱即可。
[0055] MS液體培養基的配置:在燒杯中加入適量的蒸餾水，量筒稱取相應稀釋倍數的母 液加入其中，稱取蔗糖3% (w/v)加入燒杯后，在攪拌器上混勻，定容。121°C滅菌20min。 [0056] MS固體培養基的配置：向配置好的MS液體培養基中加入0.85% (w/v)瓊脂，121°C 滅菌20min。
[0057]激素母液的配置:分別稱取0.025g 2，4_二氯苯氧乙酸(2，4-D)、6_芐基腺嘌呤(6-BA)和激動素(KT)。其中2，4-D在堿性條件下使用NaOH溶解，6-BA和KT在酸性條件下使用HC1 溶解，待充分溶解后加入去離子水定容至50ml，濃度為0.5mg/ml的激素母液，經0.22μπι濾膜 除菌，儲存于4°C冰箱。
[0058] 2內生真菌的分離
[0059] 取新鮮健康的柴胡植株，用洗潔劑清洗材料表面，用自來水沖洗除去泥土大顆粒 及表面浮灰，再用無菌蒸餾水沖洗干凈。無菌條件下將實驗材料放入75%乙醇中浸泡45s， 無菌水沖洗4~5次(每次2min)，再放入0.1 %升汞溶液中浸泡3min，無菌水沖洗4~5次(每 次2min)。用無菌刀片將根切成5mm X 5mm X 5mm的小塊，將莖切成5mm的小段，將葉切成5mm X 5mm的小片。將切好的材料放入TOA培養基中，每個平皿中放置4~5塊，并盡量將切面貼于培 養基。置于28°C恒溫培養箱中，倒置，暗培養5~10天，觀察材料切口處是否有真菌生長。
[0060] 每日定時觀察材料，待材料切口處長出菌絲后，及時地挑取前端的菌絲，將其轉接 至新的PDA培養基中培養，待菌落出現后，根據菌落形態和顏色的差異以及出現時間的不 同，分別挑取各平板上菌落邊緣的菌絲，將其接入新的PDA培養基中進行分離培養。采用菌 絲頂端純化法逐步純化柴胡內生真菌。將純化的菌種編號，轉入TOA斜面，置于4°C冰箱中保 存。
[0061 ]內生真菌孢子的收集:將內生真菌接種于PDA培養皿中培養5~10天，觀察菌落形 態，當有大量孢子形成時，用移液器吸取2.5ml無菌MS液體培養基反復吸吹沖洗培養基的表 面，然后吸取2ml洗下的孢子。取0.5ml稀釋后孢子懸液用血球計數板計數，根據計數結果， 取2ml的10 6個/ml孢子加入48ml的MS液體培養基中（終體積50ml)備用。本實驗選取了能產 生與宿主相同成分的內生真菌Alternaria alternate CH5(圖2)作為與宿主代謝交流的菌 株。
[0062] 3柴胡懸浮細胞制備
[0063] 本實驗以狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Wild為對象，柴胡懸浮細胞來 源于由柴胡無菌苗下胚軸誘導的愈傷組織。
[0064]柴胡種子的萌發:采集的柴胡種子加入40°C的溫水中，邊浸泡邊攪拌，浸泡12小時 后，撈出浮在水面上癟的種子，選取沉底的飽滿的種子，用75%的乙醇溶液浸泡lmin，再用 〇. 1%升汞溶液消毒5min，無菌水清洗后，在無菌操作臺中，用無菌水滴加入含有濾紙的并 已預先滅菌的培養皿中，使其中濾紙潤濕，把準備好的柴胡種子分散地放入平皿的濕潤濾 紙上。用封口膜封好，放入組織培養箱中25 °C孵育7天進行萌發。
[0065]愈傷組織的誘導：選取柴胡的下胚軸部位用自來水反復沖洗后，用75%的乙醇滅 菌3min，再用0.1%的升汞消毒30s。無菌水沖洗三次，將下胚軸切成lcm的小段接種到6-BA 3mg/l，2,4-D (hlmg/l，KT 0.6mg/l的MS培養基，25°C，20天誘導愈傷組織。
[0066] 懸浮細胞系的建立:取松散的柴胡愈傷組織，接入6-BA 2 · 5mg/l，2,4-D0 · lmg/1， KT 0.9mg/l的MS培養液中。每30ml溶液中加入5g愈傷組織。在25°C，120r/min的震蕩培養箱 中培養一周。
[0067]結果表明，采用上述方法能夠有效地誘導產生柴胡的愈傷組織并以此制備懸浮細 胞(圖3)。
[0068] 4共培養模型的建立
[0069] 含有300ml MS培養基的500ml三角瓶中加入4g懸浮細胞，在高分子透析袋中加入2 中制備的50ml內生真菌孢子，25°C、黑暗、120r/min恒溫培養7天（圖4)。以單獨培養的懸浮 細胞為對照，分別對細胞和內生真菌進行分析。在該共培養模型中，內生真菌的代謝產物能 夠透過透析袋進入三角瓶內與瓶內的宿主細胞接觸，同時，宿主細胞的代謝產物也可進入 透析袋中與透析袋內的內生真菌接觸。在此共培養體系中，雖然被透析袋隔離的宿主懸浮 細胞和其內生真菌處于相對獨立的培養狀態，而二者間的代謝交流卻沒有中斷，在檢測時， 可有效地將宿主和其內生真菌分離進行獨立的分析檢測，進而在一定程度上模擬自然條件 下柴胡內生真菌與宿主代謝交流的過程。
[0070] 5代謝交流檢測
[0071] 5 · 1對柴胡懸浮細胞中的cAMP(環磷酸腺苷）、cGMP(環磷酸鳥苷)和CaM(鈣調素)交 流信號分子分析
[0072] 取出共培養的懸浮細胞，真空抽濾，分別稱取lg組織細胞置于-80°C預冷的研缽內 迅速研碎至無明顯顆粒狀，加入5ml PBS緩沖液溶解（PBS緩沖液：NaC1137mmol/l，KCl 2.7mmol/l，Na2HP〇4 10mmol/l，KH2P〇4 2mmol/l，pH7.2~7.4)，制成勻漿液。
[0073] a.cAMP和cGMP的提取:首先取13支經高壓蒸汽滅菌處理的2ml離心管，分別向管內 加入lml PBS緩沖液，再將研磨完畢的勻漿液lml加入離心管中，顛倒搖勻，3000 Xg離心 20min，上清即含有cAMP和cGMP，小心吸取上清轉入另一干凈離心管，4°C保存待測。
[0074] b.CaM的提取:取13支經高壓蒸汽滅菌處理的2ml離心管，分別向管內加入lml鈣調 素提取緩沖液，再將研磨完畢的勻漿液lml加入離心管中，顛倒十次左右搖勻，4°C，10000 X g離心30min，上清即為鈣調素粗提液，有小心吸取上清轉入另一干凈離心管，4°C保存待測。 [0075] c.狹葉柴胡懸浮細胞的cAMP、cGMP及CaM檢測
[0076]按照試劑盒說明書進行標準曲線的繪制及樣品的檢測。每個樣品設三個復孔。具 體操作方法如下：
[0077] 1)標準品的稀釋與加樣:在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別 加標準品1〇〇μ1，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μ1，混勻；從第一、第二孔中各取 出100μΙ分別加入到第三、第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μ1，混勻；然后 在第三、第四孔中先各取出50μ1棄掉，再各取50μ1分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六 孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μ1分別加到第七、第 八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第七、第八孔中分別取50μ 1加到第九、第十孔中，再在第九和第十孔中分別加標準品稀釋液50μ1，混勻后從第九和第 十孔中各取50μ1棄掉。
[0078] 2)加樣:分別設空白孔(空白孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）及待測 樣品孔，在酶標包被板上待測樣品空中先加樣品稀釋液40μ1，然后再加待測樣品10μ1(樣品 最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標孔板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
[0079] 3)溫育：用封板膜封板后置于37°C溫育30min。
[0080] 4)配液:將20倍的濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
[0081 ] 5)洗滌:小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此 重復5次，拍干。
[0082] 6)加酶:每孔加入酶標試劑50μ1，空白孔除外。
[0083] 7)溫育：操作同3。
[0084] 8)洗滌:操作同5。
[0085] 9)顯色:每孔先加入顯色劑Α 50μ1，再加入顯色劑Β 50μ1，輕輕振蕩混勻，37°C避 光顯色15min。
[0086] 10)終止:每孔加終止液50μ1，終止反應(此時藍色立轉黃色）。
[0087] 11)測定：以空白孔調零，用酶標儀在450nm波長下測定各孔的吸光度(0D值）。測定 應在加終止液后15min內進行。
[0088] 狹葉柴胡懸浮細胞內cAMP(環磷酸腺苷）、cGMP(環磷酸鳥苷)和CaM(鈣調素）的標 準曲線如圖5、6和7,其R 2均符合試劑盒要求(R2>0.95)，可依據該標準曲線對所提取的樣品 進行定量分析。與CH5共培養后檢測狹葉柴胡懸浮細胞的cAMP、cGMP及CaM的含量，見表1、2 和3。經與狹葉柴胡內生真菌CH5共培養后，宿主懸浮細胞與空白組對比均有顯著性差異(p <0.05)。其數據結果表明內生真菌CH5能夠分別提高細胞內鈣調素和cGMP的濃度，降低了 cAMP的含量。說明二者交流主要經鈣離子和cGMP的信號調節，而cAMP的濃度降低表明cAMP 可能沒有參與二者間的交流調控。
[0089] 表1共培養前后柴胡懸浮細胞cAMP的含量
[0091]表2共培養前后柴胡懸浮細胞cGMP的含量
[0092]
[0093] 表3共培養前后柴胡懸浮細胞CaM的含量
[0094]
[0095] 5.2內生真菌與懸浮細胞的代謝交流對柴胡皂苷合成基因的影響
[0096]采用Real-Time PCR(實時定量PCR)檢測交流模型中內生真菌CH5對柴胡懸浮細胞 合成柴胡皂苷關鍵基因表達的影響。主要檢測基因包括3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 (HMGR)、異戊烯基焦磷酸異構酶(IPPI)、法尼基焦磷酸合酶(FPS)、鯊烯合酶(SS)、β-香樹脂 素合成酶(β-AS)、鯊烯環氧酶(ESE)，i3-actin為內標，引物序列參見表4。
[0097]表4 Real-Time PCR引物序列
[0099] 5.2.1狹葉柴胡懸浮細胞中總RNA的提取
[0100] 準備工作:將經DEPC水處理后的ΙΟΟΟμΙ、200μ1、10μ1的移液器槍頭和1 · 5ml、200μ1 的ΕΡ管高壓蒸汽滅菌20min，干燥箱內干燥;研缽、杵子、鑷子需經180 °C干熱滅菌4h，其中研 缽及杵子冷卻后置于_80°C低冰箱內預冷，實驗過程中必須戴一次性手套，以免污染，致使 RNA降解。
[0101] 1)處理后的狹葉柴胡懸浮細胞，真空抽濾，蒸餾水沖洗兩遍后，稱取lg置于經180 °(：干熱滅菌4h，-80°C預冷處理的研缽內，快速研磨至無明顯可見顆粒的粉末，其間不斷加 入液氮；
[0102] 2)將30mg研磨完全的細胞加入1.5ml離心管，再每個向離心管內加入lmlRNAiso Plus，移液槍吹打數遍，混勻，室溫靜置5min;
[0103] 3)12000Χ8,4Γ 離心 5min;
[0104] 4)小心吸取上清液，移入另一新的離心管中，在向管內加入200μ1氯仿，蓋緊離心 管蓋，用手劇烈振蕩15s，待溶液充分乳化(無分層現象)后，再室溫靜置15min;
[0105] 5)12000Χ8,4Γ 離心 15min;
[0106] 6)離心結束，取出離心管，此時管內分為三層(無色上清液，中間的白色蛋白層和 帶有顏色的下層有機相），小心吸取上層轉移至另一新的離心管中，切勿吸到白色中間層；
[0107] 7)向上清液中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，室溫靜置 lOmin；
[0108] 8)12000Χ8,4Γ 離心 lOmin;
[0109] 9)小心傾去上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇lml(使用無水乙醇+DEPC水 現用現配），輕輕上下顛倒數次洗滌離心管管壁，靜置lmin后，12000Xg，4°C離心5min，小心 傾去乙醇；
[0110] 10)室溫干燥離心管5分鐘，加入50μ1的RNase-Free水溶解沉淀，待RNA完全溶解 后，于-80°C保存，備用。
[0111] 5.2.2提取的狹葉柴胡RNA濃度及純度檢測
[0112] 將提取的RNA在紫外分光光度計波長260nm檢測。并計算0D26Q/0D28Q的比值。
[0113] 配制1.0%的瓊脂糖凝膠，取狹葉柴胡總RNA 5μ1與溴酚藍上樣緩沖液ΙμL混勻，電 壓100V，在1 X ΤΑΕ溶液中電泳30min，取出凝膠放入凝膠成像儀內，在紫外光下觀察RNA條帶 并拍照（圖8)。
[0114] 5.2.3 Real-Time PCR檢測柴胡皂苷合成基因的表達
[0115]逆轉錄合成cDNA的操作按照Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)試劑盒說明書進行微小改動，每個樣品實驗重復三次。
[0116] 1)基因組DNA的除去反應:配置20μ1反應體系，取RNase_Free200yl離心管，衣次加 入2μ1 5XgDNA Eraser Buffer，lyl gDNA Erase，lyl(0.4yg)DEPC水，6μ1 總RNA，然后使用 移液槍吸打混勻，室溫放置lOmin;
[0117] 2)室溫放置步驟1反應液時，取另一支200μ1 RNase-Free離心管，按所需反應+1的 量配制Master Mix:4μ1 5 XPrime Script Buffer2, ΙμL Prime Script RT Enzyme Mix 1，1μ1 RT Primer Mix，4μ1 RNase-Free dH2〇
[0118] 待步驟1反應結束，將配置完畢的Master Mix混勻后，分裝到每個反應管中制成20 μL反應體系，放入PCR儀，反應條件為：37°(：15!1^11，851€58,4°(：4^。3)步驟2反應合成〇0嫩 時，于冰上配置Real-Time PCR反應液，操作按照SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒說 明書進行稍微改動，按所需反應數+1的量配制Real-Time PCR反應液:SYBR12.5μ1，dH208.5 μL，混勻后每管21μ1分裝至八聯管，再向管內加入上游引物和下游引物各ΙμL以及步驟2中 反應得到的cDNA溶液2μ1，制得25μ1的反應體系，最后將八聯管裝入Real-Time PCR儀內，關 上蓋，進行實時定量PCLPCR擴增反應條件為:95 °C預變性30S; 95 °C變性5S; 60 °C退火30S， 40個循環。采集熒光信號，采用相對定量法對實驗數據進行分析。
[0119] 5.2.4 Real-Time PCR結果與數據分析
[0120]將與內生真菌共培養的柴胡懸浮細胞中提取的總RNA，采用Real-Time PCR法，以 β-actin作為內參，檢測共培養前后狹葉柴胡懸浮細胞中HMGR、IPPI、FPS、SS、β-AS、ESE等6 個三萜皂苷合成的關鍵酶基因表達量的差異。并采用2-Δ ACt法對數據進行分析，其公式 如下：
[0121] ACt(目的基因）=Ct(目的基因）_Ct(同一樣本的內參基因）
[0122] Δ ACt(目的基因）=ACt(實驗組目的基因）-ACt(空白組目的基因）
[0123] 相對倍數(實驗組/空白組）=24Aet(目的基因）
[0124] 因此若2^Aet值大于1則表示該目的基因與空白組對比基因表達量上調，反之則下 調。數值越大表明實驗組表達水平越高，反之亦然。
[0125] 結果（見表5)可看出，內生真菌CH5菌液處理后，基因043、1??1、？?3、33四個基因 均上調，ESE及HMGR基因均被下調，其中β-AS和SS上調較大，是空白組表達的大約5倍，FPS為 2倍左右，而ΙΡΡΙ上調幅度很小，幾乎與空白組持平;菌絲體的實驗組中，上調及下調幅度不 及菌液大，i3_AS、ESE及SS上調將近2倍，HMGR和ΙΡΡΙ均被下調三倍左右，FPS幾乎持平。說明 內生真菌CH5的代謝產物能夠影響柴胡細胞內柴胡皂苷的合成，這種調控關系為柴胡與其 內生真菌共培養模型的進一步應用奠定了基礎。
[0126] 表4內生真菌CH5處理后RT-PCR 2-^&值
[0128] 6 小結
[0129] 本實驗以模擬植物與其內生真菌代謝交流的裝置為基礎，在體外對內生真菌及其 宿主的代謝交流機制進行了有效的分析。在該共培養模型中，內生真菌的代謝產物能夠通 過透析袋進入三角瓶內與瓶內的宿主細胞接觸，同時，宿主細胞的代謝產物也可進入透析 袋中與透析袋內的內生真菌接觸。在此共培養體系中，雖然被透析袋隔離的宿主懸浮細胞 和其內生真菌處于相對獨立的培養狀態，而二者間的代謝交流卻沒有中斷，在檢測時，可有 效地將宿主和其內生真菌分離并進行獨立的分析檢測，進而在一定程度上模擬自然條件下 柴胡內生真菌與宿主代謝交流的過程。
[0130] 在本實驗中，對內生真菌與宿主交流的信號通路進行了分析，同時也對內生真菌 對宿主細胞合成柴胡皂苷關鍵基因表達的影響進行了檢測，并證明了狹葉柴胡內生真菌 CH5是通過鈣離子及cGMP的信號通路與其宿主細胞進行交流，而且CH5調控了柴胡皂苷合成 基因的表達，上調了 P-AS、ESE和SS，下調了 HMGR和IPPI。
[0131] 內生真菌在自然界中普遍存在，植物體內生物活性成分的合成可能會受到其內生 真菌的調控，但是，這種調控關系在自然狀態下難以觀察。以上事實證明該發明裝置可在實 驗室的條件下有效地觀察和分析內生真菌和其宿主的代謝調控關系，為該領域的深入研究 提供了基礎。此外，也可利用此裝置通過內生真菌與宿主懸浮細胞共培養的方式合成生物 活性物質。
[0132] 以上所述僅為本發明的優化實例，并不用于限制本發明，對于本領域研究人員來 說，本發明可以有多種變化。凡是在本發明的原則之內，所作的任何修改、等同、改進等，均 應涵括在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種植物懸浮細胞和內生菌的共培養裝置，所述裝置包括透析袋(3)，其特征在于， 通過透析袋(3)隔離植物懸浮細胞和內生菌。2. 根據權利要求1所述的共培養裝置，其特征在于，所述透析袋(3)內部含有內生真菌， 透析袋(3)外部含有植物懸浮細胞。3. 根據權利要求2所述的共培養裝置，其特征在于，所述裝置進一步包括封口蓋(1 )，固 定器(2)，培養瓶(4)，所述的透析袋(3)中間呈U形插入裝有植物懸浮細胞及培養基的培養 瓶(4)內，透析袋(3)內置有內生真菌及一定量的培養基，透析袋(3)兩端伸出瓶口并使用封 口蓋(1)蓋住瓶口，運用固定器(2)固定，置于恒溫振蕩器，搖動培養。4. 根據權利要求3所述的共培養裝置，其特征在于:所述培養瓶(4)包括不同型號錐形 瓶、燒杯或其它培養容器。5. 根據權利要求1-4任一項所述的共培養裝置，其特征在于:所述透析袋(3)為生物過 濾膜，范圍在3500-14000道爾頓，一定范圍分子量內的各類代謝產物能夠自由通過，而植物 懸浮細胞和真菌能夠被有效地隔離。便于對植物懸浮細胞和內生真菌進行獨立的觀察和分 析。6. 根據權利要求1-5任一項所述的共培養裝置，其特征在于:所述透析袋(3)中間呈U形 插入培養瓶，兩端延長至瓶口，順瓶口緊貼瓶外壁，下置比封口膜長〇. 5-3厘米。7. 根據權利要求1-6任一項所述的共培養裝置，其特征在于:所述透析袋(3)能夠通過 在培養瓶瓶口拉伸透析袋，調節透析袋浸入液面的長度，而調節培養基和透析袋接觸的面 積。8. 根據權利要求3-7任一項所述的共培養裝置，其特征在于:所述封口蓋（1)包括紗布、 錐形瓶封口膜、濾紙或其他隔菌透氣的封口裝置。9. 根據權利要求3-8所述的共培養裝置，其特征在于:所述固定器包括尼龍繩，橡皮圈、 夾子或其它固定裝置。10. -種模擬植物懸浮細胞與其內生真菌的共培養方法，其特征在于使用權利要求1-9 所述的共培養裝置。
【文檔編號】C12N1/14GK105969652SQ201610304161
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月10日
【發明人】程玉鵬, 李慧玲, 高寧, 李天聰, 林進華, 陳琦, 馬愛萍, 王強
【申請人】程玉鵬