具有長效化作用的胰高血糖素(Glu)類似物及其應用
【專利摘要】本發明涉及具有長效化作用的胰高血糖素(Glu)類似物及其合成方法。通過對C端酰胺化的Glu的16，17，21位氨基酸進行替換修飾得到具有更長藥理作用時間的Glu類似物，目標多肽的合成是通過微波促進固相合成方法快速實現，粗品經純化，凍干得到Glu類似物。
【專利說明】
具有長效化作用的胰高血糖素 (GI u)類似物及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及降糖和減肥的藥物領域，具有長效化作用的胰高血糖素(Glu)類似物 及其應用。
【背景技術】
[0002] 代謝綜合征的病因是蛋白質、脂肪及碳水化合物等多種代謝異常的共同病理、生 理基礎。營養過剩、體力活動減少等原因會導致肥胖以及肥胖相關疾病如2型糖尿病、血脂 代謝異常的發病率日益增高。
[0003] 胰高血糖素：（Glu)含29個氨基酸組成的，胰臟胰島a-細胞分泌的激素。肽序為： HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT-OH。它的藥理活性是通過激動 GLP-1 受體(GLP-1R)和胰 高血糖素受體(GCGR)發揮作用。激動GCGR，表現出促進分解作用，胰高血糖素具有很強的促 進糖原分解和糖異生作用，使血糖明顯升高。胰高血糖素通過cAMP-PK系統，激活肝細胞的 磷酸化酶，加速氨基酸進入肝細胞，并激活糖異生過程有關的酶系，糖異生增強，促進氨基 酸的代謝分解。胰高血糖素還可激活脂肪酶，促進脂肪分解，同時又能加強脂肪酸氧化，使 酮體生成增多，表現為促進脂肪分解，降低體重;而激動GLP-1受體，能葡萄糖依賴性的促進 胰島素的釋放，降低血糖。并且激活GLP-1受體也表現出生熱作用，能一定程度降低體重。而 胰高血糖素對GCGR的激動活性遠遠強于對GLP-1受體的激動活性，因此主要表現出GCGR的 作用，表現出升糖作用、很好的促分解和減肥作用。
[0004] 多肽類似物在體內也易被二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase IV，DPP-IV)快 速降解，還會被腎臟快速濾過代謝，所以需要我們對該Glu類似物進行長效化改造，以提高 穩定性。
[0005] 因此這里，我們設計了一類具有長效化的降糖減肥作用多肽，通過對胰高血糖素 進行結構改造，提高對GLP-1R的激動作用，并且適度降低對GCGR的激動作用，通過肽鏈的半 胱氨酸與馬來酰亞胺化的脂肪鏈或脂肪酸綴合，增加肽鏈與血清白蛋白的結合，避免了多 肽的腎臟快速濾過和代謝失活，從而顯著延長半衰期及體內降糖作用時間，有效的逆轉了 升糖作用，協同發揮減肥作用，獲得了長效化和降糖減肥效果更優的多肽。
【發明內容】
[0006] 本發明涉及一類胰高血糖素(Glu)相關綴合物，其序列為：
[0007] His-Xaal-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa2-Xaa3-Arg-Ala-Gln_Xaa4 Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Arg-Asn-Asn-Ile-Ala-NH2(SEQ.ID N0：1)
[0008] 其中：
[0009] Xaal:Leu，Val，Met，lie，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser 或 Gly;
[0010] Xaa2:Ser或脂肪鏈修飾的Cys;
[0011] Xaa3:Arg或脂肪鏈修飾的Cys;
[0012] Xaa4:Asp或脂肪鏈修飾的Cys;
[0013]其中脂肪鏈修飾的Cys選自
[0015] 這里:n選自1~20。
[0016] 其中優選的脂肪鏈修飾的Cys結構為
[0018]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0020]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0022]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0024]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0026]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0028]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0030]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0032]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0034]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0036]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0037]
[0038] 在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0040]在一個實施方案中，本發明涉及具有如下序列的胰高血糖素(Glu)綴合物：
[0042] 本發明還提供了一種藥物組合物，包括治療有效量的至少一種上述化合物和其藥 學上可接受的鹽，或藥學上可接受的載體或稀釋劑。
[0043] 本發明進一步提供了述化合物和其藥學上可接受的鹽，或藥學上可接受的載體或 稀釋劑在制備用于降糖和減肥的藥物中的運用。
[0044] 本發明提供的上述化合物化學性質穩定，較原型胰高血糖素(Glu)(半衰期2min) 有顯著的提高，另外，本發明提供的上述化合物或化合物作為有效成分制備的藥物組合物 用于降低體內血糖濃度時，具有顯著的降糖效果，還能顯著減輕體重。長效化效果達12h，從 而克服了多肽必須持續靜脈滴注或持續皮下注射才能產生療效的缺陷。
[0045]本發明還提供了上述化合物的制備方法，本發明采用微波促進Fmoc/tBu正交保護 固相合成策略高效快速地合成得到上述目標化合物。
[0046]本發明的優點在于：
[0047] 1.提出的一種具有長效化作用的胰高血糖素(Glu)綴合肽具有降糖減肥活性，并 提尚了穩定性。
[0048] 2.微波促進固相合成的胰高血糖素(Glu)綴合肽大大的提高了偶合反應速率，常 規固相合成方法充分偶合一個氨基酸到樹脂上去，往往需要2小時到20小時不等，甚至更 長。而微波促進則平均只需要10分鐘左右，常規固相合成方法脫Fmoc保護基，往往需要30分 鐘到1小時不等，而微波促進則平均只需要5分鐘左右，這極大的提高了多肽合成的效率， 縮短了合成周期。
[0049] 3.微波促進固相合成胰高血糖素(Glu)綴合肽的粗品純度大于80%，較常規固相 合成方法大大提高，這方便了后續的純化工作。
[0050] 4.微波促進固相方法合成胰高血糖素(Glu)綴合肽，其成本低，由于偶合效率較 高，所需要保護氨基酸平均只需要2倍過量，較常規固相合成方法需要4到5倍過量大為降 低。
[0051] 5.微波促進固相合成胰高血糖素(Glu)綴合肽的方法易于實現自動化、大規模化， 這使其更適合工業化生產。
[0052]因此用本發明提供的微波促進固相合成技術制備的具有長效化作用的胰高血糖 素(Glu)綴合肽，收率高、合成周期短、粗品純化容易，生產成本低、易于工業自動化生產。制 備得到的胰高血糖素(Glu)綴合肽，降血糖作用明顯、減肥作用時間長，適合作為治療糖尿 病、減肥藥物的活性成分。
【具體實施方式】
[0053]在本說明書全文中采用以下縮寫：
[0054] Et3N:三乙胺；NMM:N-甲基嗎啉；DIEAj，^-二異丙基乙胺；DMF:二甲基甲酰胺； DMS0:二甲亞砜;DCM:二氯甲烷;Fmoc:N-9-芴甲氧羰基;DIC:N，N'_二異丙基碳二亞胺;CDI: N，N'_羰基二咪唑;DMAP:4-二甲氨基吡啶;H0SU:N-羥基琥珀酰亞胺;EDC.HC1:1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽;HATU:2-(7-偶氮苯并三氮唑)，^_四甲基脲六 氟磷酸酯;HBTU:苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯;HCTU: 6-氯苯并三氮唑-1， 1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯;H0AT: 1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑;H0BT: 1-羥基-苯并三氮唑； PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷;HPLC:高效液相色譜;ESI-MS:電噴霧 質譜;Gly ?甘氨酸;Ser:絲氨酸;Ala:丙氨酸;Thr:蘇氨酸;Val:纈氨酸；Ile:異亮氨酸;Leu: 亮氨酸;Tyr:酪氨酸;Phe:苯丙氨酸;Hi s:組氨酸;Pro:脯氨酸;Asp:天門冬氨酸;Met:蛋氨 酸;Glu:谷氨酸;Trp:色氨酸;Lys:賴氨酸;Arg:精氨酸。Asn:天冬酰胺;Gin:谷氨酰胺。
[0055] 本發明是通過下列實施例來進行說明的，但這些實施例不做任何限制本發明的解 釋。
[0056] 實施例1
[0058]的微波促進固相合成
[0059] (1)樹脂的溶脹
[0060] 稱取Fmoc-Rink amide-MBHA Resin 50mg(取代量0 ? 4mmol/g)，經7mL DCM溶脹 30min，抽濾去DCM，再用lOmL NMP溶脹30min，最后分別用NMP，DCM，NMP 7mL沖洗干凈。
[0061] (2)微波促進Fmoc保護基的脫除
[0062] 將溶脹好的樹脂放入反應器中，加入7mL含0.1M H0BT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液， 在微波反應器中反應lmin，微波功率為15W，反應溫度控制在50°C以內，使用空氣壓縮機壓 縮空氣冷卻，反應結束后濾去溶液;再加入7mL含0.1M H0BT的25%哌啶/NMP(V/V)溶液在微 波反應器中再反應4min，微波功率為25W，反應溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓縮空氣 冷卻。反應結束后濾去溶液，用NMP洗滌干凈。得到脫去初始連接的Fmoc保護基的樹脂。
[0063] (3)微波促進Fmoc-Thr(tBu)-Rink amide-MBHA Resin的合成
[0064] 將卩111〇。-1'1^(七811)011(0.4111111〇1)，冊1'1](0.4111111〇1)，11081'(0.4111111〇1)和01?￡八 (0.08mmol)溶于lOmL NMP中，再將此溶液加入上面的樹脂中，在微波反應器中反應7min，微 波功率為25W，反應溫度控制在50°C，使用空氣壓縮機壓縮空氣冷卻。反應結束后濾除反應 液，用DCM和NMP各7mL洗滌樹脂3次。
[0065] (4)偶合效率的檢測
[0066]用茚三酮法或者溴酚蘭法定性檢測樹脂的偶合效率，顯色反應為陰性即可進入下 一個偶合循環。
[0067] 茚三酮法:取少量樹脂顆粒用乙醇洗滌，放入透明小瓶中加入5 %茚三酮乙醇、KCN 吡啶溶液(2ml 0.001M KCN稀釋于98ml吡啶中）、80 %苯酚乙醇溶液各2滴，于100°C加熱5分 鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。
[0068] 溴酚蘭法:取少量樹脂顆粒用二甲酰乙酰胺洗滌，放入透明小瓶中加入3滴1 %的 溴酚藍二甲基乙酰胺溶液，常溫下振搖3分鐘，如果樹脂顯藍色即為陽性。
[0069] (5)肽鏈的延長
[0070]按照肽鏈的序列，重復上述脫保護和偶合的步驟依次連接上相應的氨基酸，合成 到肽鏈17位時，加入脂肪鏈修飾的半胱氨酸，偶合45min，然后繼續重復脫保護和偶合的步 驟依次連接上相應的氨基酸直至肽鏈合成完畢，得到連有化合物的樹脂。
[0071] (6)樹脂上多肽的裂解
[0072]將上述得到的連有化合物的樹脂放入反應瓶中，各加入裂解劑Reagent K(TFA/苯 甲硫醚/水/苯酚/EDT，82.5:5:5:5:2.5，V/V) 10mL，先在0 °C下振搖30min，再在常溫下反應 3h。反應結束后抽濾，加少量TFA和DCM洗滌三次，合并濾液。將濾液加入大量的冰乙醚中析 出白色絮狀沉淀，冷凍離心得到目標多肽的粗品。最終得到化合物的粗品332mg，收率為 94.3%〇
[0073] (7)馬來酰亞胺化的脂肪鏈或脂肪酸的合成
[0074] 將氨基丙氨酸，6-氨基己酸，12-氨基十二酸（1 .Oequiv)與馬來酸酐（1.2equiv) 溶于冰醋酸中，超聲溶解后，120°C回流反應，薄層板檢測反應完畢后，反應液冷卻至室溫， 加入大量水，乙酸乙酯萃取三次（3 X20mL)，合并上層萃取液，萃取液使用飽和食鹽水洗3 次，無水Na2S04干燥過夜。萃取液真空旋干得到粗品，粗品柱層析（乙酸乙酯/石油醚)分離得 得純品。（8)馬來酰亞胺化的脂肪鏈與多肽的綴合
[0075] 稱取1-己基-1H-馬來酰亞胺_2,5_酮（O.lmmol)溶于2ml甲醇中，粗肽溶于2ml水 中，并相互混合，5ul DIEA作為催化劑，5ul NMP助溶，室溫下攪拌反應2h。
[0076] (9)多肽綴合物的純化
[0077]將多肽混合物溶于50%的乙腈/水中，使用制備液相色譜純化，色譜條件為:C18反 相柱（320mm X 28mm，5wn);流動相A: 0 ? 1 % TFA/水(V/V)，流動相B: 0 ? 1 % TFA/乙腈(V/V);流 動相梯度:流動相B 40 %~90 %，20min;流速為6mL/min檢測波長為214nm。收集的溶液凍干 得純品300mg。理論相對分子質量為3495.6DESI-MS m/z:found[M+3H]3+1227.0，[M+4H]4+ 920? 6;calu[M+3H]3+1226? 6，[M+4H]4+920 ? 2。
[0078] 實施例2~12
[0079] 根據實施例1所述的一般性方法，根據相應的序列合成得到實施例2~12的胰高血 糖素類似物，通過電噴霧質譜(ESI-MS)確證各自的分子量。
[0080] 實施例2
[0081]
[0082] 理論相對分子質量為3760 ? 9iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1254 ? 7，[M+4H]4+941 ? 3; calu[M+3H]3+1254.6，[M+4H]4+941.2
[0083] 實施例3
[0085] 理論相對分子質量為3790 ? 9iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1264 ? 2，[M+4H]4+948 ? 9; calu[M+3H]3+1264 ? 7，[M+4H]4+948 ? 7。
[0086] 實施例4
[0088] 理論相對分子質量為3817 ? 1 iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1273 ? 7，[M+4H]4+955 ? 6; calu[M+3H]3+1273 ? 4，[M+4H]4+955 ? 3。
[0089] 實施例5
[0091 ]理論相對分子質量為3607 ? 7iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1204 ? 1，[M+4H]4+903 ? 4; calu[M+3H]3+1203.6，[M+4H]4+902.9。
[0092] 實施例6
[0094] 理論相對分子質量為3691 .LESI-MS m/z :found[M+3H]3+1232 ? 1，[M+4H]4+924.1; calu[M+3H]3+1231 ? 6，[M+4H]4+924 ? 0。
[0095] 實施例7
[0096]
[0097] 理論相對分子質量為3721 ? 9iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1241 ? 2，[M+4H]4+931 ? 4; calu[M+3H]3+1241 ? 6，[M+4H]4+931 ? 5。
[0098] 實施例8
[0100] 理論相對分子質量為3748 ? 0iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1250 ? 7，[M+4H]4+938 ? 1; calu[M+3H]3+1250.4，[M+4H]4+938.0〇
[0101] 實施例9
[0103] 理論相對分子質量為3694 ? 9iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1232 ? 4，[M+4H]4+924 ? 9; calu[M+3H]3+1232 ? 6，[M+4H]4+924 ? 7。
[0104] 實施例10
[0106] 理論相對分子質量為3779 ? 2iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1260 ? 7，[M+4H]4+945 ? 6; calu[M+3H]3+1260.7，[M+4H]4+945.8。
[0107] 實施例11
[0109]理論相對分子質量為3808 ? 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1270 ? 9，[M+4H]4+953 ? 1; calu[M+3H]3+1270? 6，[M+4H]4+953 ? 2。
[0110] 實施例12
[0112]理論相對分子質量為3834 ? 8iSI-MS m/z :found[M+3H]3+1279 ? 1，[M+4H]4+959 ? 6; calu[M+3H]3+1279 ? 3，[M+4H]4+959 ? 7。
[0113] 實施例13
[0114] Glu及脂肪鏈綴合的胰高血糖素(Glu)類似物的血漿半衰期測定實驗
[0115] 大鼠眼球取血，血液裝入含有肝素的離心管中，3000rpm離心10分鐘，取上清血漿 作為溫孵血漿，利用LC-MS來檢測化合物的響應信號。100ul的Glu和Glu類似物溶液與100ul 的血漿，渦旋混合后置入37°C水浴中，溫孵96小時，在0，0.5，1，2，4，8，12，24，36，48，72，96h 時間點取l〇ul，加入20ul乙腈沉淀，14000rpm離心，取上清液進LC-MS，計算各個時間點的峰 面積，做出衰減曲線，計算半衰期。如表1所示，沒有經過改造的原型Glu類似物半衰期半小 時不到，而脂肪鏈修飾后的Glu類似物血漿穩定性明顯提高，半衰期明顯延遲，最長的化合 物半衰期已經達到30小時以上。.
[0116] 表1脂肪鏈綴合的Glu多肽類似物體外血漿穩定性數據
[0119] 實施例14
[0120] 脂肪鏈綴合的胰高血糖素類似物的GLP-1R和GCGR受體激動活性篩選
[0121] HEK293細胞分別共轉染編碼GLP-1R或GCGR的cDNA，細胞系表達并利用Western Blot檢測已構建的HEK293細胞中GLP-1R或GCGR的蛋白水平，以考察是否建立了穩定高表達 的細胞株HEK293。
[0122] 測定化合物的試驗中，提前2h將細胞種于96孔板中，化合物用DMS0溶解，使用含有 0.1 %牛血清蛋白的培養基稀釋至不同倍數，加入共轉染的細胞中。細胞孵化20min后，使用 Cisbo公司的ELI SA試劑盒，使用酶標儀測定熒光讀數，建立標準曲線將熒光讀數轉化為相 應的cAMP數值，使用Graphpad Prism 5.0軟件的非線性回歸計算化合物的EC5Q數值。
[0123] 如表2所示，大部分化合物較原型胰高血糖素相比，對GLP-1R的激動活性表現出明 顯的提高，而保持了對GCGR的激動活性，其中SEQ. ID N0:4對GLP-1R的激動活性提高了近10 倍。
[0124] 表2長效化脂肪鏈綴合的Glu類似物對GLP-1R和GCGR激動活性
[0127] 實施例15
[0128] Glu及脂肪鏈綴合的胰高血糖素類似物的口服降血糖實驗
[0129] 正常ICR小鼠，分為14組，每組6只，小鼠飼養在標準化動物房中。禁食12h后，給予 Glu及脂肪鏈綴合的胰高血糖素類似物，對照組注射生理鹽水。進行小鼠單次腹腔葡萄糖耐 量實驗。各組按照小鼠體重每千克腹腔注射18_〇1的葡萄糖溶液(濃度20%)，注射葡萄糖 時定為Omin，在0，15，30，60，120min用血糖儀測定血糖水平。
[0130] 如表3所示，改造后部分化合物的降糖活性與給生理鹽水組相比，降糖活性提高明 顯。其中以36〇.10勵:4,3￡〇.10勵 :6和3￡〇.10勵：12的降糖活性最為顯著，與我們獲得的 化合物具有很好的GLP-1R激動活性，并且GCGR激動活性適度減弱結果一致。
[0131] 表3 Glu及胰高血糖素綴合肽口服降血糖的效應
[0133] n = 6,!T±s*P<0.05,**P<0.01 ,***P<0.001 vs saline as control
[0134] 實施例16
[0135] Glu及優選的胰高血糖素綴合肽的多次腹腔葡萄糖耐量實驗
[0136] 選取8周齡ICR小鼠，隨機分組，每組8只，適應性飼養7天后，在實驗開始前12小時 禁食，只給予飲水。每組小鼠在給予Glu及優選的胰高血糖素綴合肽之前，測初始血糖值，定 為Omin，然后腹腔給予長效化Glu類似物，30min后腹腔注射葡萄糖(每千克ISmmol)，對照組 注射相同體積的生理鹽水。Omin，15min，30min，60min，120min分別尾部取血，測定血液葡萄 糖濃度。并且于180min，360min，540min再次注射葡萄糖，繼續測定血糖值，一共重復給予4 次葡萄糖，檢測化合物的長效化降糖活性。
[0137] 如表4所示，Glu綴合肽SEQ. ID N0:4在第四次給予葡萄糖時，仍然維持了很好的降 糖活性，表明化合物經過改造后，其長效化降糖作用顯著，達到了 12h以上。
[0138] 表4 Glu及胰高血糖素(Glu)綴合肽多次腹腔葡萄糖耐量效應
【主權項】
1. 一種含有式KSEQ.ID N0:1)結構的長效化膜高血糖素(Glu)類似物，其序列為祖13- Xaal-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Xaa2-Xaa3-Arg-Ala- Gln-Xaa4-Phe-Val-Gln-T巧-Leu-Met-Asn-T虹-N肥（沈Q.ID NO:1) 其中： Xaal:Leu，Val，Met，Ile，Tyr，Phe，Arg，Asn，Lys，Thr，Asp，His，Trp，Gln，Glu，Ser或 Gly ； Xaa2: Ser或脂肪鏈修飾的切s; Xaa3: Arg或脂肪鏈修飾的切s; Xaa4:Asp或脂肪鏈修飾的切s;2. 根據權利要求1所述的膚，其中脂肪鏈修飾的切s選自運里:η選自1~20。3. 根據權利要求2所述，其中優選的脂肪鏈修飾的切S結構為4. 根據權利要求1所述的膜高血糖素(Glu)類似物，優選的序列為：5. -種藥物組合物，包括治療有效量的權利要求1中所述的膜高血糖素類似物和其藥 學上可接受的鹽。6. -種藥物組合物，包括治療有效量的權利要求1中所述的膜高血糖素類似物和藥學 上可接受的載體或稀釋劑。7. 權利要求1中所述的膜高血糖素類似物和其藥學上可接受的鹽在制備用于降糖和減 肥的藥物中的運用。8. 權利要求1中所述的膜高血糖素類似物和藥學上可接受的載體或稀釋劑在制備用于 降糖和減肥的藥物中的運用。9. 權利要求1中所述的膜高血糖素類似物的制備方法，包括生物表達、液相合成和固相 合成制備方法。
【文檔編號】A61P3/04GK105968186SQ201610397412
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】黃文龍, 錢海, 周潔, 廖晨, 戴宇軒, 張博
【申請人】中國藥科大學