一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體及其應用
【專利摘要】本發明提供了一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體及其應用。本發明通過分析魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列，將原始25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變（K8R、V16K和L21R），同時為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N。將魚源抗菌肽pleurocidin突變體基因進行畢赤酵母偏愛密碼子優化后人工合成，克隆于畢赤酵母中表達，結果重組表達的魚源抗菌肽pleurocidin突變體與原始抗菌肽相比抗菌效力獲得顯著提高。將重組菌株發酵規模放大到發酵罐水平，發酵液進一步純化后可制成抗菌肽制劑，用于水產動物疾病的預防和治療。
【專利說明】
一種魚源抗菌肽PI euroc i d i n突變體及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于功能基因改造技術領域，具體涉及一種魚源抗菌肽pleurocidin突變 體及其應用。
【背景技術】
[0002] 抗菌肽（Antibacterial peptide，ABP)是生物體經誘導產生的一類具有多種生 物活性的小分子多肽，是宿主免疫防御系統的一個重要組成部分，具有廣譜抗菌、無耐藥性 及毒副作用等優點。近年來，人們發現抗菌肽存在多種動物體內，且具有抑菌機制獨特、抑 菌譜廣、抑菌活性高以及宿主不產生抗性等優點，應用前景廣闊。魚類抗菌肽是一類小分子 蛋白質，其結構與組成復雜多樣，從已報道的序列來分析，它們并沒有很高的同源性，但存 在一些共同特征，如含有較多精氨酸或賴氨酸而使分子帶正電;含有較多疏水氨基酸，可使 分子折疊成疏水或雙親性a螺旋結構等。魚類抗菌肽是魚體非特異性免疫系統的重要組成 部分，當魚體受到損傷或病原微生物侵襲時，能迅速產生抗菌肽以預防和殺傷病原微生物 的入侵，其合成速度快，在體內擴散迅速、靈活的特點是其他大分子蛋白質(如抗體等)和免 疫細胞所不具備的，在防御海水性細菌和病毒入侵方面起著重要作用。
[0003] 抗菌肽在水產養殖中替代抗生素的應用前景非常廣闊，但在工業化應用方面存在 很多問題需要解決。如抗菌肽的來源問題，由于抗菌肽在動物體內含量很低，直接從動物體 內提取成本太高;天然抗菌肽抑菌效果較差，直接應用效果不理想;天然抗菌肽帶有一定的 細胞毒性，需要重新設計其結構才具有臨床應用價值等。以其空間結構的模擬為基礎，天然 抗菌肽的結構優化的一種方式是通過抗菌肽親水性和疏水性氨基酸替換來調整抑菌活性 的高低，另一種方式是將不同抗菌肽的活性部位進行雜合，合成一種新的雜合抗菌肽來提 高其抑菌活性，降低其毒性。隨著基因工程技術的發展，原核、真核表達系統的成熟應用也 為抗菌肽的規模化生產提供了可能。
[0004] 魚源抗菌肽pleurocidin是由25個氨基酸殘基組成的多肽，是從美洲擬蝶皮膚分 泌液中分離得到的，與樹娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果繩的抗菌肽ceratotoxin具有 序列同源性。魚源抗菌肽pleurocidin的抑菌機理是通過形成兩親性的a螺旋結構，穿透細 菌的細胞膜來行使抑菌功能的。魚源抗菌肽pleurocidin帶有較高的陽離子電荷，這些結構 與其起始的細胞膜結合相關。本發明通過氨基酸替換的方法對魚源抗菌肽pleurocidin進 行改造，獲得一種新型魚源抗菌肽pleurocidin突變體，大大提高了其抑菌活性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，即通過生物軟件對魚 源抗菌肽pleurocidin(GenBank登錄號:AAF17252)的氨基酸序列進行空間結構分析，分別 將魚源抗菌肽pleurocidin的25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變(K8R、V16K和L21R)，同時 為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力獲得顯著提高。 [000 6]本發明首先提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，其編碼蛋白的氨基酸序列 為SEQ ID N0:1; 上述蛋白的一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2; 本發明還提供一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體的重組畢赤酵母的制備方法，其制 備步驟如下： 1) 根據魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因 序列，連入重組酵母表達載體中，構建成表達重組質粒； 2) 將構建的表達重組質粒電轉化宿主酵母菌，構建能表達魚源抗菌肽突變體的重組基 因工程酵母菌;用該重組基因工程菌高密度發酵表達出魚源抗菌肽突變體； 3) 對重組表達的魚源抗菌肽突變體進一步濃縮、純化后，測定效價達12000U/ml。稀釋 分裝，即為抗菌肽制劑。
[0007] 本發明利用基因工程技術構建了能表達一種魚源抗菌肽突變體的重組酵母菌株。 將重組魚源抗菌肽突變體制備成抗菌肽制劑，其抑菌效價高、抑菌譜廣，具有廣闊的市場前 景和開發價值。
【具體實施方式】
[0008] 下面結合【具體實施方式】來進一步描述本發明，但本領域技術人員應該理解的是， 在不偏離本發明的技術方案的情況下可以對本發明的技術方案的細節和形式進行修改或 替換，這些修改和替換均落入本發明保護范圍內。
[0009] 實施例1新型魚源抗菌肽突變體及其基因的獲得 1、魚源抗菌肽pleurocidin(GenBank登錄號:AAF17252)是由25個氨基酸殘基組成的抗 菌肽，與樹娃的抗菌肽dermaseptin和地中海果繩的抗菌肽ceratotoxin具有序列同源性。 為了進一步提高其抑菌活性，通過生物軟件對魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸序列進行 空間結構分析，分別將魚源抗菌肽pleurocidin的25個氨基酸中的3處氨基酸進行突變 (K8R、V16K和L21R)，同時為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其 抗菌效力獲得顯著提高，獲得一種新型魚源抗菌肽突變體，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0010] 2、根據獲得的新型魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列SEQ ID NO: 1，按照畢赤酵母 基因密碼子偏好性進行重新設計，獲得編碼新型魚源抗菌肽突變體的核苷酸序列SEQ ID N0:2。并在其N端引入Kex2酶切位點。兩端引入Xhol和Xbal酶切位點，以便于克隆入畢赤酵 母表達載體中。
[0011] 實施例2基因工程魚源抗菌肽突變體表達載體的構建與工程菌的獲得 1、將含抗菌肽基因的載體和酵母表達載體均用XAol和Zhl雙酶切，酶切產物回收并 連接，進行PCR鑒定、測序。
[0012] 2、陽性質粒經SacI單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態細胞懸液中。電轉化后均 勻涂布于含l〇〇yg/mL Zeocin的YPDS選擇平板上，30°C孵育3 -5天。待YPDS平板上的陽性轉 化子生長較大，將各轉化子依次點種至含Zeocin 200yg/mL、500yg/mL、1000yg/mL的YPDS選 擇平板，以在高濃度Zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株。
[0013] 3、將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100yg/mL Zeocin的Yro培養液中，28°C 振搖培養18個小時。取此菌液按5%體積比轉接于5mL BMGY培養基中，28°C搖振培養18-24h 左右，0D值約為5-6。培養物直接轉接于25mL BMMY培養基中，28°C繼續搖振培養。為了維持 誘導表達，每隔24h補加100%甲醇使終濃度達1%。4811后，4°C 5000r/min離心10min，收集上 清，進行抑菌活性測定。能產生抑菌活性的重組酵母菌株即為能產生新型魚源抗菌肽突變 體的陽性菌株，命名為YA株。
[0014]實施例3新型魚源抗菌肽突變體的發酵、純化制備 1、發酵工藝 1)將篩選得到的陽性重組子活化后按1%_1〇%接種量接種于三角瓶，28-30°C，200r/min 搖床培養16-24h后以5%-20%接種量接入10L發酵罐（實裝培養基7L)，溫度28-30°C，轉速 500-1500r/min，培養基pH值5.0-6.0，通氣量0.1-1. OVVM( 1L發酵液lmin通入的氧氣量），溶 氧>20%情況下進行發酵，在培養18-24h后流加50%甘油4h，待溶氧突然升至100%時流加甲醇 至發酵結束，整個發酵持續48-72h。
[0015] 2)發酵結束后原罐蒸汽100°C滅菌10_20min，放料，5000r/min離心10min，收集發 酵上清即為抗菌肽半成品。
[0016] 3)新型抗菌肽制劑 抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥、凍干等生產的粉劑和以生化方法精制、純化后 得到液體制劑。
[0017] 上述基因工程抗菌肽可開發成水產動物飼料添加劑或水產動物疾病的預防和治 療制劑。
[0018] 實施例4新型魚源抗菌肽突變體的最小抑菌濃度測定(MIC) 1、試驗菌株 金黃色葡萄球菌(CowanI)、鰻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌。
[0019] 2、菌株處理:將菌種復蘇，在固體培養基中劃線，在28°C培養箱中過夜培養。將過 夜培養的細菌挑單菌落于含有25mL液體培養基的三角瓶中，將三角瓶放于搖床28°C培養 12-18h。將培養后的菌液在600nm處測其吸光度值，用培養基調節菌液濃度，使其處于0.6-0.8之間。之后將菌液稀釋成濃度為5 X 105CFU/mL，依次取90yL加入到96孔板的各孔內。
[0020] 3、抗菌肽定量后用培養基依次做倍比稀釋。將稀釋好的抗菌肽各取10此依次加入 到96孔板的各個孔中，此時每個孔的反應體系為100此。96孔板蓋蓋后，28°C振蕩培養24h 后，觀察并用酶標儀測量〇D_值并記錄實驗結果。抗菌肽樣品經過二倍稀釋后，成一系列濃 度，以抑制細菌生長的最小濃度來定義最小抑菌濃度(MIC)。菌液和培養基分別用來做陰性 和陽性對照，各自代表抑菌率為0和100%。同時設立魚源抗菌肽pleurocidin標準品試驗組 作為對照，用于觀察抗菌肽改造前后的抑菌活性變化。
[0021 ] 4、用微量稀釋法測定重組魚源抗菌肽pleurocidin及其突變體對多種細菌的最低 抑菌濃度，結果表明其對水產常見病害菌均有顯著的抑制效果，特別是改造的新型魚源抗 菌肽突變體與魚源抗菌肽pleurocidin標準品相比，對暢弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏 菌的抑菌能力均得到廣泛提高，顯示了本發明對魚源抗菌肽pleurocidin的氨基酸突變效 果顯著。
[0022]表1抗菌肽對多種水產病害菌的最低抑菌濃度
【主權項】
1 · 一種魚源抗菌肽pleurocidin突變體，其特征在于，所述的魚源抗菌肽pleurocidin 突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 1。2. -種核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段用于編碼權利要求1所述的魚源抗 菌肽pleurocidin突變體。3. 如權利要求2所述的核苷酸片段，其特征在于，所述的核苷酸片段的序列為SEQ ID N0:2〇4. 權利要求1所述的魚源抗菌肽pleurocidin突變體在制備水產動物飼料添加劑或疾 病的預防和治療制劑中的應用。
【文檔編號】A23K50/80GK105968179SQ201610363295
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】侯竹美
【申請人】青島農業大學