7-o-乙基莫諾苷的制備方法
【專利摘要】本發明公開了7?O?乙基莫諾苷的制備方法。通過大量實驗篩選出最佳的7?O?乙基莫諾苷制備工藝，包括溶解方法，反應pH值，加熱溫度，加熱時間等應參數，并且優選出最佳的純化方法，整個反應工藝設計合理，可操作性強，7?O?乙基莫諾苷合成率高，雜質少，純度高，成本低，可實現工業化生產。本發明進一步通過體內外抗炎實驗篩選，結果表明7?O?乙基莫諾苷體內和體外均具有很好的抗炎效果，具有制備成抗炎藥物的潛在用途。
【專利說明】
7-0-乙基莫諾苷的制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種化合物的制備方法，具體涉及7-0-乙基莫諾苷的制備方法，屬醫藥技術領域。【背景技術】
[0002]山萸肉是山茱萸科植物山茱萸的干燥成熟果肉，是四十種極為常用的名貴中藥之一。現代研究表明，環烯醚萜苷類成分為山萸肉的重要活性物質，具有抗炎、保肝、免疫抑制等活性。目前的藥理學研究已經初步揭示了其中莫諾苷、馬錢苷、山茱萸新苷等成分的活性，而其它環烯醚萜苷類成分的藥理作用目前尚不明確。文獻研究表明莫諾苷具有改善糖尿病并發癥和減輕腦缺血損傷等作用，具有抗炎、抗氧化、和神經保護等活性。7-0-乙基莫諾苷為山萸肉中的一種環稀醚砲苷類成分(含量約為0.05?0.06mg/g)，含有莫諾苷骨架結構，然而其是否具有莫諾苷類似的藥理活性還未見系統的研究。由于7-0-乙基莫諾苷在山萸肉飲片中含量較少，從飲片中分離、純化不能較好地滿足體內外藥理活性研究的需要。因此，本發明研發7-0-乙基莫諾苷的轉化合成的方法，在此基礎上對7-0-乙基莫諾苷的體內外抗炎作用進行了系統的研究。
【發明內容】
[0003]發明目的:本發明的目的是提供一種7-0-乙基莫諾苷的新制備方法，并且本發明考察7-0-乙基莫諾苷的體內外抗炎作用。
[0004]技術方案:為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為:
[0005]7-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:
[0006](1)溶解:取山茱萸環烯醚萜總苷為原料，加原料重量10?20倍體積的乙醇，超聲溶解；
[0007](2)調pH:超聲溶解后，調節溶液的pH值至1?3或者加入乙酰化試劑；
[0008](3)加熱:加熱回流提取10?20h，過濾得提取液，濃縮得浸膏；
[0009](4)純化、結晶:將浸膏溶于乙酸乙酯，過濾，除去不溶物，濃縮，濃縮液加入二氯甲烷，放置結晶，重復結晶1?3次，減壓干燥即得7-0-乙基莫諾苷。
[0010]作為優選方案，以上所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，山茱萸環烯醚萜總苷是以山茱萸為原料，采用水提取方法制備得到山茱萸環烯醚萜總苷。作為優選方案，山茱萸環烯醚萜總苷中含有重量百分比20?40%莫諾苷和重量百分比10?20%馬錢苷。
[0011]作為更加優選方案，所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，山茱萸環烯醚萜總苷中含有重量百分比40%莫諾苷和重量百分比20%馬錢苷。
[0012]作為優選方案，以上所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，步驟(1)中乙醇為無水醇；超聲頻率為20?60kHz，功率為30kW。本發明通過大量實驗篩選得到最佳超聲溶解的超聲頻率和功率，可大大提高反應物的溶解率，保證反應轉化率。[0013 ]作為優選方案，以上所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，步驟(2)中的pH值調節劑為磷酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的一種。本發明通過大量實驗篩選，調節反應物pH值為1?3,可提高合成速率，提高反應得率，可使7-0-乙基莫諾苷的轉化率在93 %以上。[〇〇14]作為優選方案，以上所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，步驟(3)中在80?100°C 加熱回流提取16h，本發明通過大量實驗篩選不同的反應溫度和反應時間，對比實驗結果表明，在80?100°C加熱回流提取16h可以使7-0-乙基莫諾苷的合成率最高，雜質少，得率高。 [〇〇15]作為優選方案，以上所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，純化步驟，本發明通過大量實驗篩選不同的溶劑，實驗結果表明采用乙酸乙酯溶解，可以有效去除不溶物，并且采用優選的二氯甲烷溶劑作為重結晶溶劑，可以得到純度98%以上的7-0-乙基莫諾苷。本發明不需要經過柱層析復雜的純化步驟，純化速度更快，工作效率更高，成本低，更有利于工業化生產。
[0016]本發明通過體內外抗炎實驗，結果表明7-0-乙基莫諾苷體內和體外均具有很好的抗炎效果。
[0017]有益效果:本發明提供的7-0-乙基莫諾苷的制備方法和現有技術相比具有以下優占.[〇〇18]本發明通過大量實驗篩選出最佳的7-0-乙基莫諾苷制備工藝，包括溶解方法，調節優選的pH值，加熱溫度，加熱時間反應參數，并且優選出最佳的純化方法，整個反應工藝設計合理，可操作性強，7-0-乙基莫諾苷合成率高，雜質少，純度高，成本低，可實現工業化生產。
[0019]本發明通過體內外抗炎實驗篩選，首次證明7-0-乙基莫諾苷體內和體外均具有很好的抗炎效果，可以用于制備成抗炎藥物。【附圖說明】
[0020]圖1為本發明所提供的7-0-乙基莫諾苷的結構示意圖。
[0021]圖2為7-0-乙基莫諾苷對LPS刺激的Raw264.7細胞分泌TNF-a影響的柱狀圖。[〇〇22]圖3為7-0-乙基莫諾苷對LPS刺激的Raw264.7細胞分泌IL-6影響的柱狀圖。[〇〇23]圖4為7-0-乙基莫諾苷對LPS誘導系統性炎癥小鼠血清IL-6水平影響的柱狀圖。 [〇〇24]圖5為7-0-乙基莫諾苷對LPS誘導系統性炎癥小鼠血清TNF-a水平影響的柱狀圖。【具體實施方式】[〇〇25]根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。
[0026] 實施例1[〇〇27] 7-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:[〇〇28] (1)溶解:稱取山茱萸環烯醚萜總苷(含有莫諾苷40%，馬錢苷20%)lkg，加入10L 無水乙醇，常溫條件下攪拌使之分散均勻；[〇〇29] (2)調pH值:加入適量的稀磷酸調節pH=3;[〇〇3〇] (3)加熱反應:在80°C回流16h;過濾得提取液，濃縮得浸膏；[〇〇31] (4)純化、結晶:浸膏加入乙酸乙酯溶解，過濾出去不溶物，濾液濃縮至小體積，向濃縮液中加入二氯甲烷攪勻至有沉淀析出，放置結晶，結晶物再用乙酸乙酯溶解，加入二氯甲烷重結晶，過濾減壓干燥得化合物7-0-乙基莫諾苷產物365g，轉化率93% JS提示所得化合物分子量:434g/mol，高分辨質譜分子式:C19H3QO11。( iH-NMR與文獻報道一致，參見 Fortunatus SUNGHffA ,H.S.,e t al.1odine-Catalyzed Etherificat1n of Morroniside.Chem.Pharm.Bull ,2009.57(1):112-115.)，結構式如圖l〇 [〇〇32] 實施例2[〇〇33]7-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:[〇〇34](1)溶解:稱取山茱萸環烯醚萜總苷(含有莫諾苷40%，馬錢苷20%)lkg，投入提取罐，加入15L無水乙醇，常溫條件下攪拌使之分散均勻；[〇〇35](2)調pH值:加入適量的稀硫酸調節PH=2;[〇〇36](3)加熱反應:90°C回流16h;過濾得提取液，濃縮得浸膏；[〇〇37](4)純化、結晶:浸膏加入乙酸乙酯溶解，過濾除去不溶物，濾液濃縮至小體積，向濃縮液中加入二氯甲烷攪勻至有沉淀析出，放置結晶，結晶物再用乙酸乙酯溶解，加入二氯甲烷重結晶，過濾減壓干燥得化合物7-0-乙基莫諾苷產物390g，轉化率98 % JS提示所得化合物分子量:434，高分辨質譜分子式:C19H3QO11。結構式如圖1。
[0038] 實施例3[〇〇39]7-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:[〇〇4〇] (1)溶解:稱取山茱萸環烯醚萜總苷(含有莫諾苷40 %，馬錢苷20 % ) lkg，加入20L 無水乙醇，常溫條件下攪拌使之分散均勻；[0〇41 ](2)調pH值:加入適量的稀鹽酸調節pH = 1;
[0042](3)加熱反應:100°C回流提取16h;過濾得提取液，濃縮得浸膏；[〇〇43](4)純化、結晶:浸膏加入乙酸乙酯溶解，過濾出去不溶物，濾液濃縮至小體積，向濃縮液中加入二氯甲烷攪勻至有沉淀析出，放置結晶，結晶物再用乙酸乙酯溶解，加入二氯甲烷重結晶，過濾減壓干燥得化合物7-0-乙基莫諾苷產物380g，轉化率95 %，MS提示所得化合物分子量:434g/mol，高分辨質譜分子式:C19H3QO11。結構式如圖1。
[0044]實施例4
[0045]7-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:
[0046](1)溶解:稱取山茱萸環烯醚萜總苷(含有莫諾苷30%，馬錢苷15%)lkg，加入10L 無水乙醇，常溫條件下攪拌使之分散均勻；[〇〇47](2)調pH值:加入適量的稀硝酸調節pH=l;
[0048](3)加熱反應:100°C回流16h;過濾得提取液，濃縮得浸膏；[〇〇49](4)純化、結晶:浸膏加入乙酸乙酯溶解，過濾出去不溶物，濾液濃縮至小體積，向濃縮液中加入二氯甲烷攪勻至有沉淀析出，放置結晶，結晶物再用乙酸乙酯溶解，加入二氯甲烷重結晶，過濾減壓干燥得7-0-乙基莫諾苷產物375g，轉化率93% IS提示所得化合物分子量:434g/mol，高分辨質譜分子式:C19H3QO11。結構式如圖1。
[0050] 實施例5[〇〇5117-0-乙基莫諾苷的制備方法，包括以下步驟:[〇〇52](1)溶解:稱取山茱萸環烯醚萜總苷(含有莫諾苷30 %，馬錢苷20 % ) lkg，加入20L無水乙醇，常溫條件下攪拌使之分散均勻；[0〇53](2)調pH值:加入適量的稀鹽酸調節pH=l.5;
[0054](3)加熱反應:100°C回流16h;過濾得提取液，濃縮得浸膏；
[0055](4)純化、結晶:浸膏加入乙酸乙酯溶解，過濾出去不溶物，濾液濃縮至小體積，向濃縮液中加入二氯甲烷攪勻至有沉淀析出，放置結晶，結晶物再用乙酸乙酯溶解，加入二氯甲烷重結晶，過濾減壓干燥得7-0-乙基莫諾苷產物392g，轉化率98% IS提示所得化合物分子量:434g/mol，高分辨質譜分子式:C19H3QO11。結構式如圖1。[〇〇56]實施例6抗炎實驗 [〇〇57] 1、體外抗炎實驗方法:[〇〇58] 實驗分為5組，即正常對照組、地塞米松陽性藥組、LPS模型組、7-0-乙基莫諾苷低劑量組(5yM)、7-0-乙基莫諾苷高劑量組(20yM)。取對數生長期的RAW264.7細胞，消化制備細胞懸液，將細胞密度調整為5 X 104個/ml，取lmL接種于24孔培養板內，每組4個復孔，置于含5 % C02、37 °C培養箱中培養，至融合度為80 %左右。[〇〇59] 各組給藥法為:(1)正常對照組，加入完全無血清培養基；(2)地塞米松陽性藥組， 加入含地塞米松(lyg/ml)培養基；(3)LPS模型組，加入完全無血清培養基；(4)7-0-乙基莫諾苷低、高劑量組:分別加入含5、20yM 7-0-乙基莫諾苷的無血清培養基；各實驗組細胞置于含5%⑶2、37°C培養箱中30min后，除正常組外，每組加入LPS至終濃度為lyg/ml。繼續培養24h后吸取細胞上清液，采用ELISA法檢測TNF-a、IL-6。
[0060]2、體內抗炎實驗方法:[〇〇611 實驗分組:取BALB/C小鼠(雄性，10-12周齡)50只，隨機分為5組，分別為對照組、 LPS模型組、地塞米松陽性對照組(1.3mg/kg)、7-0-乙基莫諾苷低劑量組(1 Omg/kg)、7-0-乙基莫諾苷高劑量組(30mg/kg)(尾靜脈注射生理鹽水+腹腔注射生理鹽水組)，每組10只。 [〇〇62]各組給藥法為:正常對照組和LPS模型組小鼠尾靜脈注射生理鹽水，其余3組尾靜脈相應藥物。lh后，除對照組外，每組小鼠腹腔注射LPSW.Smg/kg)。^后取血，冰浴10到15 分鐘，8000g離心10分鐘分離血清，采用ELISA方法測定IL-6和TNF-a。[〇〇63]3、實驗結果[〇〇64]3.1體外抗炎實驗結果:[〇〇65] 如圖2所示，本發明提供的7-0-乙基莫諾苷對LPS刺激的Raw264.7細胞分泌TNF-a 的影響和如圖3所示，本發明提供的7-0-乙基莫諾苷對LPS刺激的Raw264.7細胞分泌IL-6的影響，與正常組比較，7-0-乙基莫諾苷能明顯抑制由于LPS刺激的Raw264.7細胞分泌TNF-a 和IL_6。[〇〇66]3.2體內抗炎實驗結果:[〇〇67]如圖4所示，本發明提供的7-0-乙基莫諾苷對LPS誘導系統性炎癥小鼠血清IL-6水平的影響和如圖5所示，本發明提供的7-0-乙基莫諾苷對LPS誘導系統性炎癥小鼠血清TNF-a水平的影響，小鼠體內給藥30mg/kg時，7-0-乙基莫諾苷既能抑制LPS誘導系統性炎癥小鼠血清IL-6,也能抑制TNF-a的釋放，且l〇mg/kg時既能抑制LPS誘導系統性炎癥小鼠血清IL-6 的釋放。
[0068]以上實施方式只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人了解本
【發明內容】
并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明精神實質所做的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(1)溶解:取山茱萸環烯醚萜總苷為原料，加原料重量10?20倍體積的乙醇，超聲溶解；(2)調pH:超聲溶解后，調節溶液的pH值至1?3或者加入乙酰化試劑；(3)加熱:加熱回流提取10?20h，過濾得提取液，濃縮得浸膏；(4)純化、結晶:將浸膏溶于乙酸乙酯，過濾，除去不溶物，濃縮，濃縮液加入二氯甲烷， 放置結晶，重復結晶1?3次，減壓干燥即得7-0-乙基莫諾苷。2.根據權利要求1所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于，山茱萸環烯醚萜總 苷中含有重量百分比20?40%莫諾苷和重量百分比10?20%馬錢苷。3.根據權利要求2所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于，山茱萸環烯醚萜總 苷中含有重量百分比40%莫諾苷和重量百分比20%馬錢苷。4.根據權利要求1所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于，步驟(1)中乙醇為 無水醇;超聲頻率為20?60kHz，功率為30kW。5.根據權利要求1所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于，步驟⑵中的pH值 調節劑為磷酸、鹽酸、硫酸或硝酸中的一種。6.根據權利要求1所述的7-0-乙基莫諾苷的制備方法，其特征在于，步驟(3)中在80? 100°C加熱回流提取16h。7.權利要求1制備得到的7-0-乙基莫諾苷在制備抗炎藥物中的應用。
【文檔編號】C07H17/04GK105968150SQ201610309791
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月11日
【發明人】劉志輝, 鄭嘯, 王麗靈, 王瓊, 陳慧, 姜譽弘
【申請人】江蘇省中醫院