一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明涉及一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應用，屬于有機光電材料技術領域。該配合物包括C^N配體、金屬中心和含有烷基鏈的輔助配體，結構式如下式所示。本發明的磷光銥配合物能夠被可見光激發，產生在近紅外區域的發射光，從而減弱激發光源對生物樣品的損傷并具有較深的組織穿透深度。此外，該配合物有著良好的抗光漂白性能，在成像上可以實現對細胞組織較長時間有效的觀測。本發明的磷光銥配合物可應用于溶酶體標記以及生物成像領域，其具有簡單的化學結構以及良好的生物相容性，是很好的溶酶體靶向磷光探針。
【專利說明】
一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和 應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其制備方法和應用，屬于 有機光電材料技術領域。
【背景技術】
[0002] 目前研究較多的電致磷光材料主要包括銥、釕、鉑、鋨等有機金屬配合物，其中磷 光環金屬銥配合物有著優異的磷光特性，例如高的量子產率，大的Stokes位移，長的磷光壽 命，發光顏色的易調節性以及好的抗光漂白性，是目前研究得最多的一種磷光材料。并且磷 光過渡金屬配合物的發射壽命(幾百納秒到幾十微秒)比熒光(幾納秒)長得多，這個特性不 僅賦予其對氧氣敏感的特性，還使其能夠在時間分辨成像技術中發揮其特長，有效濾除背 景熒光的干擾，目前，它們已廣泛應用于生物成像和傳感探針等領域中。申請公開號為 CN104402936A的專利申請中記載了一種銥配合物的制備方法，但是其制備而成的銥配合物 中配體結構只有一種，無法通過配體結構的調整而調節發光波長從而使電致發光器件的顏 色覆蓋整個可見光區。
[0003] 溶酶體內部含有多種水解酶，這些酶能夠降解幾乎所有種類的生物分子，因此溶 酶體是細胞內的消化器官。細胞自溶、防御以及對某些物質的利用均與溶酶體的消化作用 有關，因此對活細胞中溶酶體進行生物成像具有重要意義。但是由于細胞一般沒有明確有 效的靶點，能夠實現特定細胞靶向作用的化學小分子很少。目前為止，以特定細胞器為靶 點，如溶酶體，能夠在活體細胞中作用于這些靶點的，應用比較成熟的有染料和抗體兩類。 一般染料都會有光漂白性和光致毒性，在紫外可見光的照射下短時間內即失去熒光活性， 或者產生單線態氧等極易對活細胞發生毒害作用的物質，不利于活體細胞的無損傷成像。 抗體雖然低毒，但是價格昂貴、易失活的特性限制了其應用。申請公開號為CN101962536A的 專利申請中記載了一種溶酶體靶向的熒光物質，但是其化學結構較復雜，生物相容性不是 很好。
【發明內容】
[0004] 本發明解決的技術問題是:提出了一種具有溶酶體靶向功能的磷光銥配合物及其 制備方法和應用，以實現對溶酶體的靶向功能，利于細胞的無損傷成像。
[0005] 為了解決上述技術問題，本發明提出的技術方案是：一種具有溶酶體靶向功能的 磷光銥配合物，包括C~N配體、金屬中心以及含有烷基鏈的輔助配體，該銥配合物具有如下 結構式：
[0007] 其中，C~N配體為下列中的任意一個：
[0009]為了解決上述另一技術問題，本發明提出的技術方案是:一種制備具有溶酶體靶 向功能的磷光銥配合物的制備方法，該方法的合成路線如下：
[0011]具體步驟:室溫下將化合物1與甲醇鈉溶液攪拌反應22小時，然后向反應液中加入 氯化銨反應6小時，反應結束后過濾掉未反應的氯化銨，將濾液旋干去除甲醇溶劑，得到淺 黃色粉末，之后用乙醚洗滌三次，除去未反應的化合物1，再用乙醇-乙醚的混合溶劑重結 晶，得到白色固體化合物2;再將化合物2與乙酰乙酸乙酯在乙醇鈉催化條件下加熱回流24 小時，旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調節pH值至4-5,水中會有大量白色固 體析出，過濾得該白色固體，并用水和乙醚洗滌三次，得到白色固體化合物3;將化合物3、溴 己烷與K 2C03溶于丙酮后在氮氣氛圍中60°C回流攪拌過夜，再將反應液用水和二氯甲烷萃取 三次除去殘留的的K 2C03，收集有機相，用無水Na2S04干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油 狀混合物用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4;最后將化合物4和銥二氯橋在二氯甲 烷與甲醇的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攪拌過夜，反應完成后待反應溶液溫度降 至室溫，再向其中加入KPF 6繼續攪拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶劑，并將得到的固體用層 析柱提純，得到紅色粉末狀固體Ir-alkyl(l-7)。
[0012] 為了解決上述另一技術問題，本發明提出的技術方案是:具有溶酶體靶向功能的 磷光銥配合物的應用，該磷光銥配合物應用于活細胞溶酶體的標記。
[0013] 進一步的，該磷光銥配合物應用于細胞成像領域。
[0014] 進一步的，該磷光銥配合物應用于生物標記領域。
[0015] 進一步的，該磷光銥配合物應用于乏氧檢測領域。
[0016] 與現有技術相比，本發明的有益效果為:本發明的磷光銥配合物能夠被可見光激 發，產生在近紅外區域的發射光，從而減弱激發光源對生物樣品的損傷并具有較深的組織 穿透深度。另外，其具有長壽命的磷光發射能夠在生物成像方面利用時間門有效地消除背 景熒光以達到提高圖像信噪比的目的，并且該配合物有著優秀的抗光漂白性能，在成像上 可以實現對細胞組織較長時間有效的觀測。本發明的磷光銥配合物可應用于溶酶體標記， 生物成像，具有簡單的化學結構以及良好的生物相容性，是很好的溶酶體靶向磷光探針。
【附圖說明】
[0017] 下面結合附圖對本發明的作進一步說明。
[0018] 圖1.實施例3中銥配合物Ir-alky 1 (7)的甲苯溶液（10-5M)的紫外-可見吸收光譜； [0019 ]圖2.實施例3中銥配合物Ir-alky 1 (7)的甲苯溶液(10-5M)的發射光譜；
[0020] 圖3.實施例4中銥配合物Ir-alkyl(7)在Hela細胞中的MTT細胞毒性實驗；
[0021] 圖4.實施例5中銥配合物Ir-alkyl(7)與商業溶酶體染料的在A549細胞中的共染 成像；
[0022]圖5.實施例5中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業溶酶體染料的在Hela細胞中的共染 成像；
[0023]圖6.實施例5中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業溶酶體染料的在HepG2細胞中的共染 成像；
[0024]圖7.實施例6中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業溶酶體染料的在Hela細胞中的抗光 漂白性實驗；
[0025]圖8.實施例7中銥配合物Ir_alkyl(7)與商業溶酶體染料的在Hela細胞中的PLIM (a)和時間門成像(b~f)。
【具體實施方式】
[0026] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實例。
[0027] 實施例1:含烷基鏈的輔助配體的制備
[0029] 化合物2的制備：取20ml甲醇加入50ml單口瓶中，加入50mg金屬Na，室溫下攪拌直 至Na完全反應溶解，室溫下將化合物1 (24_〇1)與甲醇鈉溶液攪拌反應22小時，然后向反應 液中加入氯化銨(26mmol)反應6小時，反應結束后過濾掉未反應的氯化銨，將濾液旋干去除 甲醇溶劑，得到淺黃色粉末，之后用乙醚洗滌三次，除去未反應的化合物1，再用乙醇-乙醚 的混合溶劑重結晶，得到白色固體化合物2產率：83 %。NMR(400MHz，DMSO) S = 9.69(s， 4H)，8.85-8.73(m，lH)，8.45(d，J = 8.0Hz，lH)，8.14(td，J = 7.8，1.7Hz，lH)，7.85-7.71(m, lH)〇13C NMR(101MHz,DMS0)8=162.67,150.33,144.37,138.76,129.01,124.00〇 [0030]表1.合成化合物2的反應原料用量與產物的產量和產率
[0032]化合物3的制備:將化合物2 (6mmo 1)與乙酰乙酸乙酯(6mmo 1)在乙醇鈉催化條件下 加熱回流24小時，旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調節pH值至4-5,水中會有 大量白色固體析出，過濾得該白色固體，并用水和乙醚洗滌三次，得到白色固體化合物3。產 率：55% </H MlR(400MHz，DMS0)S = ll .89(s，lH)，8.69(d，J = 4.4Hz，lH)，8.25(d，J = 7.9Hz,lH) ,8.00(td,J = 7.8,1.2Hz,lH) ,7.60(dd,J = 6.9,5.1Hz,lH),6.25(s,lH) ,2.26 (s，3H)〇
[0033]表2.合成化合物3的原料用量與產物的產量和產率
[0035] 化合物4的制備:將化合物3 (1.5mmo 1)、溴己燒(6. Ommo 1)與K2CO3 (5.25mmo 1)溶于 丙酮(6ml)后在氮氣氛圍中60°C回流攪拌過夜，再將反應液用水和二氯甲烷萃取三次除去 殘留的的1( 20)3,收集有機相，用無水Na2S04干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油狀混合物 用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4。產率25%。4 Mffi(400MHz，DMS0-d6)S(ppm): 8.72(ddd，J=1.2,2.0,4.8Hz，lH)，8.33(dt，J = 0.8,8.0Hz，lH)，7.95(td，J=l .6,7.6Hz， 1H)，7.51(ddd，J=1.2,4.8,7.6Hz，lH)，6.81(s，lH)，4.42(t，J = 6.4Hz，2H)，2.46(s，3H)， 1.78-1.71(m,2H),l.45-1.37(m,2H),l.33-1,29(m,4H),0.86(t,J=7.2Hz,3H)〇
[0036] 表3.合成化合物4的反應原料用量與產物的產量和產率
[0037]
[0038]實施例2:含烷基鏈銥配合物Ir_alkyl(7)的制備
[0040] 化合物Ir-a 1 ky 1 (7)的制備:將化合物4 (0.22mmo 1)和銥二氯橋(0. lmmo 1)在二氯 甲烷(3mL)與甲醇（lmL)的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攪拌過夜，反應完成后待反 應溶液溫度降至室溫，再向其中加入KPF 6(2.2mmo 1)繼續攪拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶 劑，并將得到的固體用層析柱提純，得到紅色粉末狀固體Ir_alkyl(7)。產率23%。4匪R (400MHz，DMS0-d6)S(ppm):8.45(d，J=7.6Hz，lH)，8.12-8.08(m，3H)，8.01-7.68(m，9H)， 7.36-7.31(m,2H),7.15-7.14(m,lH),7.08-6.98(m,10H),6.94-6.85(m,4H),6.82-6.79(m, 4H),6.76-6.70(m,5H),6.50(ddd ,J = 2.0,4.0,8.4Hz,2H),5.84(d ,J = 2.0Hz,lH),5.53(d, J=2.4Hz,lH),4.46-4.34(m,2H),1.97(s,3H),1.65-1.58(m,2H),1.22-1.21(m,6H),0.83 (t ,J = 7.2Hz,3H)〇
[0041] 表4.合成Ir_alkyl(7)的反應原料用量與產物的產量和產率
[0043] 其他六種不同主配體的銥的配合物[
Ir-alkyl (1-6)]的合成方法與實例一致，得 到不同的銥的配合物只需在合成配合物的那個反應中用不同主配體的銥二氯橋替換即可。 [0044]實施例3:銥配合物Ir-alkyl (7)的吸收和發射光譜測試
[0045]本發明采用的光譜測試濃度為10虛，測試溶劑為甲苯溶液，測發射光譜時，激發波 長為405nm。
[0046] Ir-alky 1 (7)的吸收與發射光譜如圖1和圖2所示。分析圖1和圖2可以得出，配合物 在紫外區250-380nm以及可見藍光區400-500nm均表現出了較強的吸收，特別是該配合物能 夠被可見光激發，因此在做細胞成像實驗時能夠大大減少激發光源對細胞的損傷。測量其 發射光譜時，先用氧氣與氮氣體積比不同的氣流往溶液中鼓氣10分鐘然后進行測試。由結 果可知其發射較寬，發射峰位于600nm，長波長的發射光使得在生物組織中的較大的穿透深 度，使之更適用于生物成像，并且隨著溶液中氧含量的減少，發射光的強度逐漸增強，證明 該配合物能夠應用于乏氧檢測的領域。
[0047] 實施例4:銥配合物Ir-alky 1 (7)的MTT細胞毒性實驗
[0048] 將消化后的細胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個/孔，在37°C，5%0)2的 條件下培養24小時。之后吸除不新鮮的培養液，再用不同濃度Ir-alkyl(7)(l、5、10、25、50y M)的細胞培養液繼續培養細胞24小時。然后再在每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續培養4小 時。最后吸除培養液，每孔加入150yL二甲基亞砜，搖床震蕩10分鐘后使用酶標儀測試 0D570〇
[0049] MTT細胞毒性實驗結果如圖3所示，在配合物的濃度增至50yM時，培養24小時后，細 胞存活率依然大于80%，證明該配合物具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像。
[0050] 實施例5:銥配合物Ir-alkyl(7)與商業溶酶體染料LysoGreen對活細胞溶酶體的 共染實驗
[00511本測試采用的細胞分別為A549細胞、HepG2細胞和Hela細胞。將消化后的細胞接種 在培養皿中，在37°C，5%⑶2的條件下培養24小時使之貼壁。用roS溶液洗去不新鮮的細胞 培養液后用Ir-alkyl (7) (5yM)的細胞培養液孵育細胞12小時。之后用含有LysoGreen (200nM)的細胞培養液繼續培養10分鐘后進行成像測試。
[0052] 配合物Ir-alkyl (7)與商業溶酶體染料LysoGreen的在A549細胞、HepG2細胞和 Hela細胞中共染成像圖如圖4、圖5和圖6所示。LysoGreen由488nm藍光激發，收集500-540nm 綠光發射，Ir-alky 1 (7)由488nm藍紫光激發，收集580-640nm紅光發射。將溶酶體染料的發 射區域與配合物Ir_alkyl(7)的發射區域向疊加，發現二者重合度高。由計算可得，在三種 細胞中的共染系數分別為〇.93、0.82和0.91，證明本發明的配合物1^11^1(7)能夠靶向活 細胞溶酶體，可用于活細胞溶酶體標記。
[0053] 實施例6:銥配合物Ir-alkyl (7)與商業溶酶體染料LysoGreen在Hela細胞中的抗 光漂白性試驗；
[0054]本測試采用的細胞Hela細胞。將消化后的細胞接種在培養皿中，在37°C，5%C02的 條件下培養24小時使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細胞培養液后分成兩組，一組細胞用 含有Ir-alkyl (7) (5yM)的細胞培養液孵育細胞12小時，另一組細胞用含有LysoGreen (200nM)的細胞培養液培養10分鐘，然后進行抗光漂白測試。
[0055] LysoGreen由488nm藍光激發，收集500-540nm綠光發射，Ir-alkyl(7)由488nm藍紫 光激發，收集580-640nm紅光發射。先收集光漂白前的共聚焦圖像，再在兩組細胞中分別選 定特定區域用強激光照射一秒鐘進行光漂白，之后收集共聚焦圖像。對比兩者光漂白前后 的圖像可知，點1位置在光漂白前后的發光強度變化遠小于點2位置的發光強度變化，由此 可證明Ir-alkyl (7)的抗光漂白性優于商業溶酶體染料LysoGreen的性能。
[0056] 實施例7:銥配合物Ir_alkyl(7)在Hela細胞中的PLIM和時間門成像。
[0057]本測試采用的細胞為Hela細胞。將消化后的細胞接種在培養皿中，在37°C，5%C02 的條件下培養24小時使之貼壁。用roS溶液洗去不新鮮的細胞培養液后用Ir-alkyl(7)(5y M)的細胞培養液孵育細胞12小時。然后用PBS溶液清洗三次后進行成像測試。
[0058] Ir-alkyl(7)由405nm藍紫光激發。由生成的PLIM圖像（圖8(a))圖可知，在細胞內 配合物靶向的溶酶體區域發光壽命體現了磷光發射長壽命特點。在時間門成像實驗中，分 別收集了延遲〇ns、20ns、50ns、100ns和200ns的信號，可以看到在扣除了背景熒光干擾之 后，細胞成像保持著良好的信噪比和分辨率（圖8(b~f))。證明Ir_alkyl(7)在生物成像方 面有很好的適用性。
[0059]以上詳細描述了本發明的較佳具體實施例。應當理解，本領域的普通技術無需創 造性勞動就可以根據本發明的構思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術領域中技術人員 依本發明的構思在現有技術的基礎上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術 方案，皆應在由本發明權利要求書所確定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物，包括C~N配體、金屬中屯、w及含有烷基鏈 的輔助配體，其特征在于:該銀配合物具有如下結構式：2. -種如權利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的制備方法，其特征 在于:該方法的合成路線如下：具體步驟:室溫下將化合物1與甲醇鋼溶液攬拌反應22小時，然后向反應液中加入氯化 錠反應6小時，反應結束后過濾掉未反應的氯化錠，將濾液旋干去除甲醇溶劑，得到淺黃色 粉末，之后用乙酸洗涂Ξ次，除去未反應的化合物1，再用乙醇-乙酸的混合溶劑重結晶，得 到白色固體化合物2;再將化合物2與乙酷乙酸乙醋在乙醇鋼催化條件下加熱回流24小時， 旋干除掉溶劑后將固體溶于適量去離子水中，調節pH值至4-5,水中會有大量白色固體析 出，過濾得該白色固體，并用水和乙酸洗涂Ξ次，得到白色固體化合物3;將化合物3、漠己燒 與K2C03溶于丙酬后在氮氣氛圍中60°C回流攬拌過夜，再將反應液用水和二氯甲燒萃取Ξ次 除去殘留的的K2C03，收集有機相，用無水Na2S〇4干燥后旋蒸除去有機溶劑，將得到的油狀混 合物用層析柱提純，得到黃色油狀液體化合物4;最后將化合物4和銀二氯橋在二氯甲燒與 甲醇的混合溶劑中，在氮氣氛圍下55°C回流攬拌過夜，反應完成后待反應溶液溫度降至室 溫，再向其中加入KPF6繼續攬拌2小時，之后旋蒸除掉有機溶劑，并將得到的固體用層析柱 提純，得到紅色粉末狀固體Ir-alkyl(l-7)。3. 根據權利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應用，其特征在于:該 憐光銀配合物應用于活細胞溶酶體的標記。4. 根據權利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應用，其特征在于:該 憐光銀配合物應用于細胞成像領域。5. 根據權利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應用，其特征在于:該 憐光銀配合物應用于生物標記領域。6. 根據權利要求1所述的具有溶酶體祀向功能的憐光銀配合物的應用，其特征在于:該 憐光銀配合物應用于乏氧檢測領域。
【文檔編號】C12N5/00GK105968143SQ201610293907
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月5日
【發明人】趙強, 黃維, 張璋, 劉淑娟, 許文娟, 呂雯
【申請人】南京郵電大學