一種測定ClO-的咔唑類熒光探針及其制備方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種測定ClO?的咔唑類熒光探針及其制備方法和應用。該熒光探針的制備方法：將咔唑、溴丁烷溶解于DMSO/KOH混合溶液中，攪拌加熱，生成9?丁基咔唑；以DMF為溶劑，POCl3與生成物反應，得到3?甲酰基?9?丁基咔唑；將其與3?吡啶乙腈混合在甲醇中，加入叔丁醇鉀，生成1?甲基?3?(9?丁基咔唑?3?氰乙烯基)吡啶；產物溶解在HCCl3中，加入CH3I，抽濾，干燥，得橘黃色固體產品即可。該探針對ClO?顯示了高的靈敏性和選擇性，在檢測ClO?離子時顯示出大的Stocks位移，并且檢測過程簡便、快速，檢測結果準確。通過結合激光共聚焦掃描顯微技術，還可獲取該新型熒光探針在活細胞內的熒光成像。
【專利說明】
一種測定c I 〇-的咔唑類熒光探針及其制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明涉及咔唑類熒光探針，具體涉及一種測定C1CT的咔唑類熒光探針及其制備 方法和應用。
【背景技術】
[0002] 次氯酸根離子是廣泛應用于我們生活中一種氧化劑，比如說我們常用的消毒液， 飲水消毒劑，家用漂白劑等等，其中都含有次氯酸。作為在生物體中一種重要的活性氧化 物，次氯酸或者次氯酸鹽在機體免疫防御各種微生物細菌以及各種炎癥發揮了舉足輕重的 作用。維持體內次氯酸在一定的生理濃度對于許多細胞的正常運作非常作要。然而過量的 次氯酸的濃度會導致機體組織細胞的損傷以及某些疾病，如：腎病綜合征，動脈粥樣硬化， 心血管疾病，癌癥等等疾病。準確檢測次氯酸根離子對有效診斷某些疾病顯得非常重要。在 目前已知的檢測鐵離子的方法中，由于熒光分析法有快速響應和高靈敏度的特點，熒光探 針被廣泛研究。
[0003] 近幾年來，人們開始關注設計合成對C1CT具有特異性響應的熒光探針，因此許多 檢測C1CT離子的熒光探針已被合成，但是與現有合成的熒光探針相比，大多存在一些制備 方法復雜、原料昂貴、合成探針抗干擾差、響應差、檢出限偏高等問題，因此提供一種制備廉 價、方便、檢測C1CT具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低的熒光探針及其方法具有重要的意 義。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于針對現有檢測C1CT的熒光探針存在的制備方法復雜、原料昂貴 等問題，提供一種成本低廉、制備簡單的測定C1CT的咔唑類熒光探針及其制備方法。
[0005] 本發明的另一目的在于提供一種快速、定量檢測C1CT的熒光檢測方法，而且這種 方法檢出限低、靈敏度高、選擇性好、廉價、方便。
[0006] 本發明提供的一種測定C1CT的咔唑類熒光探針，它是1-甲基-3-(9-丁基咔唑-3-氰乙烯基)吡啶碘化物，其結構式為：
[0008] 本發明提供的一種測定CKT的咔唑類熒光探針的制備方法，包括如下步驟：
[0009] 1)將咔唑、溴丁烷按等摩爾量溶解于DMS0/K0H混合溶液中，攪拌加熱，生成9-丁基 咔唑；
[0010] 2)以DMF為溶劑，P0C13與9-丁基咔唑按摩爾比3-5:1反應，得到3-甲酰基-9-丁基 咔唑；
[0011] 3)將等摩爾的3-甲酰基-9-丁基咔唑與3-吡啶乙腈混合在50 °C的甲醇中，加入叔 丁醇鉀在室溫下反應，生成1-甲基-3-(9-丁基咔唑-3-氰乙烯基)吡啶；
[0012] 4)將1-甲基-3-(9-丁基咔唑-3-氰乙烯基)啦啶溶解在HCC13中，加入CH 3I反應，抽 濾，干燥，得橘黃色固體產品即可；1 _甲基-3- (9-丁基咔唑-3-氰乙烯基)吡啶與CH31的摩爾 比為 1:50-60。
[0013]其合成路線如下：
[0015]步驟1)中攪拌加熱溫度為60-90°C ;
[0016] 步驟2)中反應溫度為60-90 °C，反應時間8-12h;
[0017] 步驟3)中室溫下反應時間4-6h;
[0018] 步驟4)中反應溫度50-70°C，優選60°C ;反應時間4-6h。
[0019] 本發明提供的一種熒光檢測C1(T的方法，其步驟為：
[0020] (1)用DMS0體系配制ImM的熒光探針儲備液；
[0021] (2)將1.6mL水和0.4mL乙醇以及20此熒光探針儲備液加入熒光比色皿中，在熒光 分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，440nm處的熒光強度逐漸增強；
[0022] (3)用1.34 X 10-2M的C10-溶液，將1.6mL水和0.4mL乙醇以及20yL熒光探針儲備液 加入熒光比色皿中，每次加入2此的C1CT進行熒光滴定實驗，共加55yL;以C1CT濃度為橫坐 標，以相對熒光強度(F-F〇)為縱坐標繪制圖，得到C1CT濃度的工作曲線，線性回歸方程為$_ F〇= 110.798c-9.207，c的單位為10_5M;通過線性擬合得到熒光探針最佳線性響應C10_的范 圍為:0-24.12X10- 5M，線性相關系數為R2 = 0.99819。
[0023]穩定性實驗證明熒光探針對C1(T的測定具有良好的光穩定性。
[0024]經實驗驗證，其它陰離子以及小分子不干擾體系對C1CT的測定。
[0025] 本發明的探針具有很好的細胞膜穿透性，可用于細胞內C1CT的檢測。
[0026] 與現有技術相比，本發明作為選擇性檢測C1CT的熒光探針有如下優點：1、本發明 的熒光探針制備方法只需一步完成，且反應條件簡單；2、本熒光探針用于C1CT的檢測可獲 得一個大的Stocks位移，反應靈敏且具有高度選擇性;3、檢測手段簡單，只需要借助熒光光 譜儀;4、本發明熒光探針可用于細胞內C1CT的檢測。
【附圖說明】：
[0027] 圖1實施例2熒光探針的C1(T熒光滴定圖
[0028] 圖2實施例3熒光探針的C1CT紫外滴定圖
[0029] 圖3實施例4熒光探針與各種共存物的熒光柱狀圖
[0030] 圖4實施例5熒光探針對C10_響應的工作曲線 [0031]圖5實施例6細胞成像圖
【具體實施方式】
[0032]實施例1測定C1CT的熒光探針的制備 [0033] (1)9-丁基咔唑的合成
[0034]在裝有磁力攪拌裝置、溫度計和回流冷凝管的100mL三頸燒瓶中加入8.35g (0.050mol)咔唑和60mL的二甲基亞砜，攪拌使其溶解后，迅速加入3.0g(0.054mol)氫氧化 鉀，加熱至90°C，攪拌下反應至固體全溶，繼續反應30min，冷卻，裝上恒壓滴液漏斗，待反應 液冷卻至38°C以下緩慢滴加5.5mL(0.051mol)溴丁烷。保持90°C下繼續攪拌反應4-6h.反應 完成后趁熱傾入于二倍體積的冰水中，靜置過夜，有白色沉淀析出。抽濾，用水洗滌濾餅2-3 次，除去無機物和二甲基亞砜，干燥得粗產物。所得粗產物用無水乙醇重結晶，得白色針狀 晶體6.7g，產率為59.8%。
[0035] (2)3-甲酰基-9-丁基咔唑的合成
[0036] 將2 ? 23g(0? Olmol)9_丁基咔唑在磁力攪拌下溶于7 ? 7mL DMF(0 ? lOmol)中，冰水浴 下將4.9mL(0.05mol)三氯氧磷滴加進去，升溫到90°C反應10h，冷卻到50°C左右將反應液倒 入2倍體積的碎冰中（預先加入50mL三氯甲烷），攪拌，分液，繼續用50mL三氯甲烷萃取兩次 (每次50mL)，合并有機層，水洗有機層一次，加入適量無水硫酸鎂干燥過夜，濾掉干燥劑后， 濃縮有機層到5-10mL，柱層析分離進行梯度洗脫(先Vzir?: 1:8,后Vzir?: 1: 4)，得產品0.788，產率31.1%。
[0037] (3)化合物[1](1_甲基-3-(9_ 丁基咔唑-3-氰乙烯基)啦啶）的合成
[0038] 將〇.75g(3mmol)3-甲酰基-9-丁基咔唑和0.32mL(3mmol)3-吡啶乙腈溶解在20mL 干燥的50°C左右的甲醇中，加入0.5g(4.5mmol)叔丁醇鉀。反應混合物于室溫下攪拌5h時， 反應完成后，抽濾，用少量甲醇洗滌濾餅兩次溶劑，干燥，得黃色固體產品0.57g，產率 54.3%〇
[0039] (4)化合物[2](1_甲基-3-(9_ 丁基咔唑-3-氰乙烯基)吡啶碘化物)的合成
[0040] 將0 ? 35g(lmmol)化合物[1 ]在磁力攪拌下溶解于15mL三氯甲烷中，加入3 ? 7mL (0.06mol) -碘甲烷，于60°C下攪拌反應5h時，反應完成后，抽濾，用少量三氯甲烷洗滌濾餅 兩次溶劑，干燥，將所得橘黃色固體進行柱層析分離(淋洗劑Vwf: 1:10)，得橘黃色 固體產品0.22g，產率43.8 %。
[0041 ] 熒光探針用1H NMR表征，結果如下：
[0042] Mffi(600MHz，DMS0-d6) :S9.412(s，lH)，8.987(d，J = 6.0Hz，lH)，8.858(d，J = 8.4Hz,lH) ,8.812(s,lH) ,8.529(s, 1H) ,8.257(q ,J = 9.0Hz , 2H) ,8.171 (d ,J = 7.8Hz , 1H), 7.888(d ,J = 9.0Hz,lH) ,7.736(d,J = 7.8Hz,lH) ,7.578(t,J = 7.2Hz,lH) ,7.348(t ,J = 7.2Hz,lH) ,4.497(m,J = 7.2Hz,5H),1.817(m,J = 7.2Hz,2H) ,1.342(m,J = 7.8Hz,2H), 0.908(t ,J = 7.2Hz,3H).
[0043] 13CMffi(150MHz，DMS0-d6):Sl49.82，144.66，143.03，141.10，142.63，135.31， 128.19,127.67,127.41,124.17,123.98,122.89,122.31,120.84,117.93,110.88,99.43， 48.85,42.90,31.18,20.22,14.19.
[0044] 實施例2熒光探針的C1(T熒光滴定
[0045] 在1.6mL水和0.4mL乙醇體系中加入20yL熒光探針儲備液進行C1CT熒光滴定實驗， 在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，440nm處的熒光強度逐漸增強。儀器參數:激 發波長和發射波長的狹縫寬度分別為2.5nm、5. Onm，電壓為600V，熒光探針溶液的最大激發 波長為Aex為370nm(見圖1)〇
[0046]實施例3熒光探針的C1CT紫外滴定
[0047]在1.6mL水和0.4mL乙醇體系中加入30yL熒光探針儲備液進行C1CT紫外滴定實驗， 在紫外分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，415nm處的紫外吸收強度逐漸減弱(見圖2)。
[0048]實施例4熒光探針與各種共存物的熒光柱狀圖
[0049] 在比色皿中加入1.6mL水和0.4mL乙醇以及20yL熒光探針儲備液，再分別加入其它 的共存物（F-，Cl-，Br-，I-，C032-，HC〇3-，N〇3-，S〇42-，AcO-，SCN-，S2O3 2-，HS〇3-，S032-，HS-，P〇43-， 出0 2,6511，078)，使其最終濃度為51111，隨即加入(：10'使其最終濃度為25\10^1，分別測其熒 光光譜，繪制不同陰離子對應440nm處的熒光強度的柱狀圖（見圖3)。
[0050] 經試驗證明，其它陰離子不干擾體系對C1CT的檢測。
[0051] 實施例5熒光探針對C1CT響應的的工作曲線
[0052] 用1.34X 10-2M的C10-溶液，將1.6mL水和0.4mL乙醇以及20yL熒光探針儲備液加入 熒光比色皿中，每次加入2yL的C1CT進行熒光滴定實驗，共加55yL;以C1CT濃度為橫坐標，以 相對熒光強度(F-F〇)為縱坐標繪制圖，得到C1CT濃度的工作曲線，線性回歸方程為:F-F〇 = 110.798c-9.207，c的單位為1(T5M;通過線性擬合得到熒光探針最佳線性響應C1(T的范圍 為:0-24.12X10- 5M，線性相關系數為R2 = 0.99819(見圖4)。
[0053]實施例6C1CT的細胞成像
[0054] 實驗之前用DMS0溶液體系配制ImM的熒光探針儲備液。取上述20此熒光探針儲備 液加入含有貼壁Hela細胞的培養基，置于37°C的5%C02培養箱中孵育35min后，用磷酸鹽緩 沖液(PBS，pH 7.4)輕輕清洗三次，以除去培養基中過量的未進入細胞的探針儲備液。將細 胞固定后在奧林巴斯ZEISS LSM 880激光共聚焦顯微鏡下，通過線性掃描進行熒光成像（10 倍物鏡，63倍油鏡）。分別用波長為405nm和488nm的激光激發，收集發射波段為425-500nm的 藍色熒光和500-600nm的黃色熒光。如圖5,探針在共聚焦熒光成像儀下顯示微弱的黃色熒 光以及藍色熒光，隨即加入5yL 1.34 X 1(T2M的C1CT，黃色熒光逐漸減弱，藍色熒光逐漸增 強。
【主權項】
1. 一種測定C1(T的巧挫類巧光探針，特征在于，它是1-甲基-3-(9-下基巧挫-3-氯乙締 基)化晚艦化物，其結構式為：2. 如權利要求1所述的一種測定C1CT的巧挫類巧光探針的制備方法，其特征在于，包括 如下步驟： 1)將巧挫、漠下燒按等摩爾量溶解于DMSO/KOH混合溶液中，攬拌加熱，生成9-下基巧 挫. 2似DMF為溶劑，P0C13與9-下基巧挫按摩爾比3-5:1反應，得到3-甲酯基-9-下基巧挫； 3) 將等摩爾的3-甲酯基-9-下基巧挫與3-化晚乙臘混合在50°C的甲醇中，加入叔下醇 鐘在室溫下反應，生成1-甲基-3-(9-下基巧挫-3-氯乙締基川比晚； 4) 將1-甲基-3-(9-下基巧挫-3-氯乙締基川比晚溶解在HCC13中，加入C出I反應，抽濾，干 燥，得橘黃色固體產品即可；1-甲基-3-(9-下基巧挫-3-氯乙締基川比晚與哪1的摩爾比為1 :50-60。3. 如權利要求2所述的一種測定C1CT的巧挫類巧光探針的制備方法，其特征在于，所述 的步驟1)中攬拌加熱溫度為60-90°C。4. 如權利要求2所述的一種測定C1CT的巧挫類巧光探針的制備方法，其特征在于，所述 的步驟2)中反應溫度為60-90°C，反應時間8-12h。5. 如權利要求2所述的一種測定C1CT的巧挫類巧光探針的制備方法，其特征在于，所述 的步驟3)中室溫下反應時間4-化。6. 如權利要求2所述的一種測定C1CT的巧挫類巧光探針的制備方法，其特征在于，所述 的步驟4)中反應溫度50-70°C，反應時間4-化。7. -種巧光檢測CIO-的方法，其特征在于，步驟為： (1) 用DMS0體系配制ImM的如權利要求1所述的巧光探針儲備液； (2) 將1.6mL水和0.4mL乙醇W及20化巧光探針儲備液加入巧光比色皿中，在巧光分光 光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，440nm處的巧光強度逐漸增強； (3) 用1.34X10-2M的Cl〇-溶液，將1.6mL水和0.4mL乙醇W及20化巧光探針儲備液加入 巧光比色皿中，每次加入化L的Cl〇-進行巧光滴定實驗，共加55化；WCl〇-濃度為橫坐標，W 相對巧光強度(F-Fo)為縱坐標繪制圖，得到CIO-濃度的工作曲線，線性回歸方程為:F-F〇 = 110.798c-9.207，c的單位為10-5M;通過線性擬合得到巧光探針最佳線性響應Cl〇-的范圍 為:0-24.12X10-5M，線性相關系數為R2 = 0.99819。
【文檔編號】G01N21/64GK105968094SQ201610371271
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月30日
【發明人】鈔建賓, 李志清, 張永斌
【申請人】山西大學