異甘草素衍生物及其用圖

異甘草素衍生物及其用圖
【專利摘要】本發明公開了一種異甘草素衍生物及其用途，所述的異甘草素本體結構為：其中，R1為H、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種，R2為H、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種。所述化合物可以用于治療心房纖維性顫動，能夠有效地抑制患者的鉀通道功能并且副作用小。
【專利說明】
異甘草素衍生物及其用途
技術領域
[0001] 本發明涉及一種化合物，尤其涉及一種異甘草素衍生物，還涉及異甘草素及其衍 生物作為鉀通道抑制劑的用途。
【背景技術】
[0002] 心房纖維性顫動(Arial行131'；[1131:;[011，簡稱房顫)是臨床實踐中老年人群最常見 的心律失常并且是最重要的可引起中風的獨立風險因素之一。中風是一個重大的公眾健康 問題，因為這種急性病常會造成永久性神經疾病和死亡。研究表明，心房顫動可使中風的幾 率增長5倍，15%至20%的中風都與心房顫動有關并且心房顫動造成的中風會使患者臥床 不起的幾率增長2.2倍。另外，心房顫動是造成住院和死亡的一大因素，美國和歐盟分別有 大約250萬和450萬人受到這種疾病的困擾。據Atrial Fibrillation Foundation估計，未 來20年里心房顫動患者的人數將會翻倍。如果沒有進行適當的治療，心房顫動引起的中風 和充血性心力衰竭等嚴重并發癥，是當前威脅老年人群生命健康的重要病癥之一。因此，開 發治療房顫的特效藥已迫在眉睫，成為當前世界醫藥學界的研究熱點之一。
[0003] 目前臨床用于治療房顫的藥物較多，包括胺碘酮、索他洛爾、普羅帕酮等，其中大 多數為鈉通道或鈣通道的阻滯劑。但這些藥物由于不是選擇性地作用于心房，常會引起一 些嚴重的不良反應。尤其值得注意的是，由于這些藥物對心室也有作用，可引起致命性心室 纖顫。另外，手術消融或電復律治療可終止房顫，但只適于極少數病人，大多數病人仍需要 藥物治療。因此，發展高度選擇性新型抗房顫藥是國際醫藥界當前重大研究課題之一。國際 上醫藥巨頭正試圖尋找新型的抗房顫藥物，2009年美國食品藥品管理局(FDA)已批準賽諾 菲-安萬特公司決奈達隆片(dronedarone，Multaq)用于既往有心房顫動和心房撲動病史的 患者維持正常心臟節律的治療，但該藥不是針對心房房顫的特異性抑制劑，會對嚴重心力 衰竭的患者增加致命不良反應的風險，此外在臨床研究中常見的不良反應有腹瀉、惡心、嘔 吐、疲勞、乏力等。因此，發展高選擇性、副作用少的新型房顫新藥仍是當前治療心律失常的 重中之重。
[0004] 近年來的研究發現一種生物電流，叫做IKur，這種心肌復極化電流只存在于人心 房肌，而在人心室肌并不存在，其離子通道的分子基礎是Kvl. 5鉀通道。Kvl. 5鉀通道是Kvl 鉀通道的一個亞型，Kv通道由a和0亞單位組成，4個相同的Kva亞單位共同組裝成同源四聚 體，形成通道復合物的孔區及電壓敏感區，而每一亞單位主要包含3部分：由6個跨膜蛋白分 子節段(S1~S6)構成通道的主體部分，N-末端和C-末端。Kvl.5鉀通道是一種大量表達于人 類心房組織上的電壓門控性鉀通道，研究表明特異性針對Kvl. 5鉀通道的抑制劑可延長心 房肌不應期，拮抗心房纖顫，而對心室電活動無影響。所以，Kvl.5鉀通道被認為是發展新型 抗心房顫動藥物的關鍵靶點。跨國制藥公司試圖合成并篩選這類藥物，但目前還沒有這類 藥物上市。

【發明內容】

[0005] 本發明為了克服上述現有技術存在的缺點提出，其所解決的技術問題是提供一種 異甘草素衍生物及其用途，所述異甘草素、衍生物及其它們之間的任意混合物能夠治療心 房顫動，有效的抑制患者的鉀通道功能且副作用小。
[0006] 本發明為解決上述技術問題而采用的技術方案是：提供一種異甘草素衍生物，所 述異甘草素本體的結構式為：
[0008] 其中，
[0009] 辦為11、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種，
[0010] 辦為11、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種。
[0011] 上述的異甘草素衍生物，其中，所述異甘草素或其衍生物是從植物中分離獲取或 通過化學合成得到。
[0012] 上述的異甘草素衍生物，其中，所述異甘草素的衍生物為：
[0015] 本發明為解決上述技術問題而采用的另一技術方案是提供一種上述異甘草素及 其衍生物在治療心房顫動中的應用，其中，向患者給藥有效量的所述異甘草素或其衍生物。
[0016] 本發明對比現有技術有如下的有益效果:本發明提供的異甘草素及其衍生物和應 用，能夠有效抑制患者鉀通道的活性，可以用于治療心房顫動等心律失常疾病，對當前治療 心房顫動提供了高選擇性、副作用少的新型藥品。
【附圖說明】
[0017]圖1 (a)-(C)為異甘草素(1)對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流W的影響； [0018]圖2(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-1對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0019] 圖3(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-2對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0020] 圖4(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-3對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0021] 圖5(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-4對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0022]圖6(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-5對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0023]圖7(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-6對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0024]圖8(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-7對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0025]圖9(a)-(c)為異甘草素衍生物WZ-8對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0026]圖10(a)_(c)為異甘草素衍生物WZ-9對人類心房肌細胞HEK293的鉀通道生物電流 Ilto的影響；
[0027]圖11(&)、（13)為異甘草素及其衍生物(12-1~12-9)在30處濃度下對人類心房肌細 胞HEK293的鉀通道生物電流IKur的抑制率柱狀圖。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步的描述。
[0029] 本發明提供的異甘草素及其衍生物，可以由藥學上可接受的賦形劑和預定量的異 甘草素或其藥學活性的衍生物一起制劑形成（每種活性成分，其質量百分比含量控制為 10%-100%范圍），所述異甘草素或其衍生物的含量應能有效地抑制患者的鉀通道功能。賦 形劑的選擇，以及賦形劑與本發明活性化合物之間的設計，這部分不屬于本發明技術方案 的任務，皆采用本領域公知常識）。
[0030] 本發明提供的化合物以及由本發明化合物獲得的制劑可用于治療心房顫動。
[0031 ]所述異甘草素及衍生物結構如下：
[0033]其中，
[0034]辦為11、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種，
[0035]辦為11、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-丁烯基、正丁酰基、異丁烷基中的一種。
[0036]其中優選的取代類型結構如下：
[0038]所述異甘草素及衍生物的制備方法如下：
[0039] 實施例1
[0040]本實施例提供了異甘草素（1)的制備方法，具體如下：
[0041 ] a)對羥基苯甲醛的羥基保護
[0042] 將0 ? 2440g(2mmol)的對羥基苯甲醛和0 ? 0346g(0 ? 2mmol)對甲苯磺酸吡啶鹽加入 至lj50mL圓底燒瓶中，加入20mL二氯甲烷，室溫攪拌下緩慢滴加0.38mL(3. Ommol )3，4-二氫吡 喃，滴畢后使反應在室溫(20~25°C)下攪拌3h。用飽和氯化鈉水溶液萃取3次，有機相用無 水硫酸鈉干燥后，減壓過濾，蒸除溶劑得到油狀產物，便是純度較高的羥基保護后的對羥基 苯甲醛。
[0043] b)2,4_二羥基苯乙酮的羥基保護
[0044] 將0.3040g(2mmol)2，4_二羥基苯乙酬和0.0173g(0. lmmol)對甲苯橫酸吡啶鹽加 入到50mL圓底燒瓶中，加入20mL二氯甲烷，室溫攪拌下緩慢滴加0.38mL(3. Ommol)3，4-二氫 吡喃，滴畢后在室溫下反應3h，加入飽和氯化鈉水溶液萃取3次，有機相用無水硫酸鈉干燥 后，減壓過濾，蒸除溶劑得到油狀產物，便是純度較高的保護后的2,4_二羥基苯乙酮。
[0045] c)羥醛縮合反應
[0046] 將通過上述步驟得到的羥基保護后的對羥基苯甲醛和羥基保護后的2,4_二羥基 苯乙酮溶于25mL甲醇中，室溫攪拌均勻，然后加入40mg K0H的水溶液（l-2mL)，400mg Ba (0H)2 ? 8H20，在60°C的油浴條件下攪拌反應，反應的時間和溫度可根據TLC的檢測結果來決 定。待反應結束時，蒸除溶劑，加入二氯甲烷和水進行萃取3次，減壓蒸除有機相溶劑后得到 反應混合物。
[0047] d)脫去羥基保護基
[0048] 將上述得到的反應混合物溶于甲醇（15mL)中，室溫攪拌均勻，加入鹽酸水溶液（1: 10)2mL，室溫攪拌，TLC跟蹤反應情況，當完全脫掉吡喃保護基時，將溶劑旋干，再用二氯甲 烷和水進行反復萃取，通常3次為最佳，減壓蒸除有機相，得到異甘草素的粗產物，再通過硅 膠柱色譜進行純化，流動相選用石油醚-丙酮體系，得到異甘草素的純物質，碘缸顯色為綠 色，硫酸顯色為黃色，TLC薄層板上為黃色圓點，黃色粉末狀，產率50 %。
[0049] 異甘草素理化數據:黃色粉末，分子式為C15H12〇4，ESI-MS m/z : 257[M+H] +，易溶于 甲醇，在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0050] iH-NMRGOOMHz.CDsODMzeJSdH.dJ:〗.^?，^' )，6.40(lH，dd，J = 2.4Hz，J = 2AEz,E~5/ ) ,7.95(lH,d,J = 8.9Hz,H-6/ ), 7.59( 1H, d, J= 15.4Hz ,H-a), 7.77( 1H, J = 15.4Hz，H-0)，7.60(2H，d，J = 8.5Hz，H-2，H-6)，6.83(2H，d，J = 8.9Hz，H-3，H-5)，13C-匪R GooMHz.cDsODNdM.TCc-i' hiee.Mc-〗' hios.sccxy hioiuc-s')， 133.4(C-6/)，193.5(C=0)，118.4C-a)，145.6(C-P)，127.9(C-l)，131.8(C-2)，114.7(C-3),161.6(C-4),114.7(C-5),131.8(C-6)〇 [0051 ] 實施例2
[0052]本實施例提供了 WZ-1、WZ-2、WZ_3異甘草素衍生物的制備方法：
[0053] a)在圓底燒瓶內，加入lmmol的對羥基苯甲醛，20mL丙酮溶解，攪拌均勾，加入 3.0mmol的碳酸鉀，在室溫攪拌下加入l.Oequiv鹵代烷（分別為溴甲基環丙烷、1-溴-3-甲 基-2-丁烯、溴代異丁烷）的丙酮溶液5mL，然后使反應體系在65°C的油浴溫度下回流反應， 反應的時間和溫度可以根據TLC檢測來進行調整，為使反應進行的更加徹底，可在反應中間 補加0.5e qUiv的碳酸鉀，反應結束后進行后期處理，首先減壓過濾反應液，減壓蒸除濾液中 的丙酮溶劑，然后將得到的混合物溶于甲醇中，溶解即可，加入適量的飽和碳酸鉀的水溶液 10mL，室溫攪拌30min，通過碳酸鉀與未反應的4-羥基發生酸堿反應成鹽，再用二氯甲烷和 飽和氯化鈉水溶液萃取進入水相，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳， 可較好的除去未參加反應的反應底物，有機相用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑后得到 純度較高的醚化產物。
[OOM] b)將2mmol的2,4-二羥基苯乙酮和0. lmmol的對甲苯磺酸吡啶鹽加入到50mL圓底 燒瓶中，加入20mL二氯甲烷，室溫攪拌(懸濁液），緩慢滴0.38mL(3. Ommo 1) 3，4-二氫吡喃（用 3mL二氯甲烷稀釋），滴畢后在室溫下反應，反應的時間和進度由TLC跟蹤檢測，待到反應產 物不再增加，底物不再減少，對反應混合物進行后期處理。首先將反應體系中的溶劑減壓蒸 除，然后在粗產物中加入適量甲醇，溶解即可，然后加入飽和碳酸鉀水溶液10mL進行震蕩， 震蕩的時間和次數可根據TLC點板確定，通過碳酸鉀與未保護的2,4_二羥基苯乙酮的4-羥 基發生酸堿反應成鹽，再通過二氯甲烷和飽和氯化鈉水溶液萃取進入水相，可根據有機相 顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，可較好的除去未參加反應的2，4_二羥基苯乙酮， 有機相用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑，得到純度較高的保護后的2,4_二羥基苯乙酮， 粉色塊狀。
[0055] c)在圓底燒瓶里加入l.Oequiv對羥基苯甲醛的醚化衍生物，l.Oequiv羥基保護后 的2，4-二羥基苯乙酮，20mL甲醇溶解，室溫攪拌均勻，然后加入NaOH的水溶液(20 % )2mL，在 60°C的油浴溫度下反應，反應的時間和溫度由TLC檢測調整，反應結束后，首先減壓旋除甲 醇，然后用二氯甲烷和水萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，目的 是除去NaOH，然后減壓旋干有機相，得到的粗產物。
[0056] d)將上述得到的反應混合物溶于甲醇（15mL)中，加入鹽酸水溶液（1:10) 2mL，室溫 攪拌，TLC確定反應時間，溫度，當完全脫掉吡喃保護基時，將甲醇旋干，再用二氯甲烷和水 進行反復萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，減壓蒸除有機相溶 劑，得到粗產物，再通過硅膠柱色譜進行純化，一般選擇石油醚-丙酮體系，或者二氯甲烷-甲醇體系，純化后得到的目標化合物均為黃色粉末。產率分別為18%，44%，45%。
[0057] WZ-1理化數據:黃色粉末，分子式為C19H18〇4，ESI-MS m/z : 311 [M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0058] 1H-NMR(400MHz,Pyr)8：6.80(lH,d,J = 8.0Hz,H-5/ ) .e.QOdH.s.H-S7 ) ,7.08(2H, d,J = 7.9Hz,H-3,H-5),7.72(2H,d,J = 8.8Hz,H-2,H-6),7.92(lH,d,J=15.3Hz,H-a) ,8.19 (2H,t ,J = 8.2Hz,H-6/ ,H-0), 3.83(2H ,J = 6.9Hz .H-l77) ,0.56(2H, J = 7.5Hz ^-37/) ,0.34 (2H，J = 4.8Hz，H-4〃），13C-MMR(400MHz，Pyr)S:114.5(C-l /)，168.0(C-2/)，104.5(C-3/)， )，192.7(C = 0)，119.4(C-a)，144.8(C-P)，128.5 (C-1)，131.5(C-2，C-6)，115.9(C-3，C-5)，162.2(C-4)，73.4(C-1〃），11.1(C-2〃），3.9(C-3〃，C-4〃）.
[0059] WZ-2理化數據:黃色粉末，分子式為C2QH2Q〇4，ESI-MS m/z : 363[M+k] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0060] 1H-Mffi(400MHz，Pyr)S:6.71(lH，d，J = 8.9Hz，H-5/)，7.59(lH，s，H-3/)，7.23(2H， dd，J = 5.7Hz，H-3，H-5)，7.80(2H，d，J = 8.5Hz，H-2，H-6)，7.87(lH，d，J= 15.3Hz，H-a)， 8.10(2H,d,J = 8.9Hz,H-6/ ), 8.21 (1H, d ,J= 15.3Hz , H-0), 5.27(2H, dd, J = 2.1Hz , J = 2.1Hz，H-l〃），4.07((lH，t，J = 2.9Hz，H-2〃），1.90(6H，s，H-4〃，H-5〃），13C-NMR(400MHz，Pyr) 8：114：.2(C-1, ),164.2(C-2/ ),109.8(C-3/ ),163.9(C-4/ ),117.5(C-5/ ),131.9(C-6/ ), 193.2(C=0),118.1(C-a),145.8(C-P),127.1(C-l),132.1(C-2,C-6),117.5(C-3,C-5), 162.8(C-4)，65.7(C-l〃），115.2(C-3〃），18.2(C-4〃），25.7(C-5〃）
[0061 ] WZ-3理化數據:黃色粉末，分子式為C19H2Q〇4，ESI-MS m/z : 313[M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0062] MMR(400MHz，Pyr)S:6.79(lH，d，J = 9.3Hz，H-5/)，6.91(lH，d，J=1.9Hz，H-37 ) ,7.07(2H,m,H-3,H-5),7.81(2H,d,J = 8.5Hz,H-2,H-6),7.94(lH,d,J=15.3Hz,H-a), 8.19(2H,m,H-6/ ,H-0), 3.71 (2H, t ,J = 8.2Hz .H-l77), 2.02( () ,0.96(6H, s .H-S77, hies.Kc-〗' )， 109.6(C-5/),133.5(C-6/),192.7(C=0),119.4(C-a),144.8(C-P),128.5(C-l),130.6(C-2，C-6)，115.9(C-3，C-5)，162.4(C-4)，75.1(C-l〃），28.9(C-2〃），19.6(C-3〃，C-4〃）。
[0063] 實施例3
[0064]本實施例提供了 WZ-4、WZ_5異甘草素衍生物的制備方法：
[0065] a)在圓底燒瓶內，加入lmmol的2,4_二羥基苯乙酮，20mL丙酮溶解，攪拌均勻，加入 3.0mmol的碳酸鉀，在室溫攪拌下加入l.Oequiv鹵代烷(分別為溴代異丁烷、溴甲基環丙烷） 的丙酮溶液5mL，然后使反應體系在65°C的油浴溫度下回流反應，反應的時間和溫度可以根 據TLC來進行調整，為使反應進行的更加徹底，可在反應中間補加0.5e qUiv的碳酸鉀，反應 結束后進行后期處理，首先減壓過濾反應液，減壓蒸除濾液中的丙酮溶劑，然后將得到的混 合物溶于甲醇中，溶解即可，加入適量的飽和碳酸鉀的水溶液10mL，室溫攪拌，反應時間可 根據TLC點板確定，通過碳酸鉀與未反應的4-羥基發生酸堿反應成鹽，再用二氯甲烷和飽和 氯化鈉水溶液萃取進入水相，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，可較 好的除去未參加反應的反應底物，有機相用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑后得到純度 較高的醚化產物。
[0066 ] b)將2mmo 1的對羥基苯甲醛和0.2mmo 1對甲苯磺酸P比啶鹽加入到5 OmL圓底燒瓶中， 加入20mL二氯甲烷，室溫攪拌（懸濁液），緩慢滴加0.38mL(3. Ommo 1)3，4-二氫吡喃（用3mL 二氯甲烷稀釋），滴畢后使反應在室溫(20-25 °C)下攪拌。反應的時間進度由TLC跟蹤檢測。 等到反應產物不再增加，底物不再減少，對反應混合物進行后期處理，首先將體系中的溶劑 減壓蒸除，在粗產物中加入適量甲醇，溶解即可，然后加入飽和碳酸鉀水溶液10mL進行震 蕩，震蕩的時間和次數可根據TLC點板確定，通過碳酸鉀與對羥基苯甲醛的未保護的的羥基 發生酸堿反應成鹽，再通過二氯甲烷和飽和氯化鈉水溶液萃取，進入水相，可根據有機相顏 色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，可較好的除去未反應的對羥基苯甲醛，有機相用無 水硫酸鈉干燥后，減壓過濾，蒸除溶劑得到油狀產物，便是純度較高的羥基保護后的對羥基 苯甲醛，淺黃色油狀物。
[0067] c)在圓底燒瓶里加入（1.0equiv)2,4-二羥基苯乙酮的醚化衍生物，（1 .Oequiv)輕 基保護后的對羥基苯甲醛，20mL甲醇溶解，室溫攪拌均勻，然后加入NaOH的水溶液（20%) 2mL，在60°C的油浴溫度下反應，反應的時間和溫度由TLC檢測調整，反應結束后，首先減壓 旋除甲醇，然后用二氯甲烷和水萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最 佳，目的是除去NaOH，然后減壓旋干有機相，得到的粗產物。
[0068] d)將上述得到的反應混合物溶于甲醇（15mL)中，加入鹽酸水溶液（1:10) 2mL，室溫 攪拌，TLC確定反應時間，溫度，當完全脫掉吡喃保護基時，將甲醇旋干，再用二氯甲烷和水 進行反復萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，減壓蒸除有機相溶 劑，得到粗產物，再通過硅膠柱色譜進行純化，一般選擇石油醚-丙酮體系，或者二氯甲烷-甲醇體系，純化后得到的目標化合物均為黃色粉末。產率分別為40%，15%。
[0069] WZ-4理化數據:黃色粉末，分子式為C19H2Q〇4，ESI-MS m/z : 313[M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0070] 1H-NMR(500MHz,Pyr)8：6.75(lH,dd ,J = 2.5Hz ,J = 2.5Hz,H-57 ), 6.84( 1H, d ,J = 2.5Hz,H-3/ ) ,7.28(2H,m,H-3,H-5) ,7.85(2H,d,J = 8.5Hz,H-2,H-6) ,7.95(lH,d,J = 15.0Hz,H-a),8.28(2H,m,H-6/ ,H-0), 3.80(2H,d ,J = 6.5Hz .H-l77), 2.07( ), 1.01 (6H，s，H-3〃，H-4〃），13C-匪R(500MHz，Pyr)S: lM.WC-l'))， lee.SCC^7 ) .lOS.SCC-S7 ) ,132.4(C-6/ ) ,192.7(C = 0), 117.8(c-a) ,145.5(C-P) ,126.7 (C-l),131.7(C-2,C-6),117.1(C-3,C-5),162.2(C-4),74.9(C-l //),28.5(C-2//),19.2(C-3〃，C-4〃）.
[0071] WZ-5理化數據:黃色粉末，分子式為C19H18〇4，ESI-MS m/z : 311 [M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0072] 1H-NMR(500MHz,Pyr)8：6.74(lH,dd ,J = 2.5Hz ,J = 2.5Hz,H-57 ), 6.83( 1H, d ,J = 2.5Hz,H-3/ ) ,7.08(2H,d,J = 7.9Hz,H-3,H-5),7.72(2H,d,J = 8.8Hz,H-2,H-6),7.92(lH, d，J=15.3Hz，H-a)，8.19(2H，t，J = 8.2Hz，H-6/，H-0)，3.83(2H，J = 6.9Hz，H-l〃），O.56(2H， J = 7.5Hz，H-3〃），0.34(2H，J = 4.8Hz，H-4〃），13C-MMR(500MHz，Pyr)S:114.9(C-l /)，167.4 (C-27 ),102.4(C-3/ ),166.1(C-4/ ),108.3(C-5/ ),132.4(C-6/ ),192.7(C = 0),117.8(C-a),145.5(C-P),126.7(C-l),131.7(C-2,C-6),117.1(C-3,C-5),162.2(C-4),73.3(C-l //), 10.6(C-2〃），3.6(C-3〃，C-4〃）.
[0073] 實施例4
[0074]本實施例提供了WZ-6異甘草素衍生物的制備方法：
[0075]在50mL圓底燒瓶里加入0.5mmol異甘草素粉末，15mL四氫呋喃溶解，室溫攪拌均 勻，然后緩慢滴加〇. 5mmol的正丁酰氯的四氫呋喃溶液5mL，根據TLC點板情況來跟蹤反應進 行情況，當目標產物不再增多，進行后期處理，首先減壓蒸除溶劑，二氯甲烷和水進行萃取， 萃取三次為最佳，有機相減壓旋干，然后用硅膠柱色譜純化，流動相選用石油醚-丙酮體系， 得到目標產物，黃色粉末。產率40 %。
[0076] WZ-6理化數據:黃色粉末，分子式為C19H18〇5，ESI-MS m/z : 327[M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0077] iH-NMRGOOMHz.CDsODMi.SMlH，!!!，^')，6.71(2H，m，H-3，H-5)，7.64(4H， m,H-2,H-6,H-a),7.85(lH,d,J=15.0Hz,H-P),8.13(lH,m,H-6 / ),2.57-1.01(7H,m,H-n-butyD^c-NMRGooMHz.CDsODMdig.TCc-V hiee.Uc-〗' hiw.Ucxy hiesjcc-f )， lH.SCC-S7 ) ,132.8(C-6/ ), 194.8(C = 0), 118.3(C-a), 147.6(C-0), 132.5(C-2, C-6), 117.3(C-3,C-5),158.3(C-4),14.1-37.2(C-n-butyl).
[0078] 實施例5
[0079]本實施例提供了 WZ-7異甘草衍生物的制備方法：
[0080] a) (2mmol)2,4-二羥基苯乙酮和（0 ? lmmol)對甲苯磺酸吡啶鹽加入到50mL圓底燒 瓶中，20mL二氯甲烷，室溫攪拌均勻(懸濁液），緩慢滴加0 ? 38mL(3 ? Ommol)3，4-二氫吡喃（用 3mL二氯甲烷稀釋），滴畢后在室溫下反應，反應的時間和進度由TLC跟蹤檢測結果進行調 整，待到反應產物不再增加，底物不再減少，對反應混合物進行后期處理。首先將反應體系 中的溶劑減壓蒸除，然后在粗產物中加入適量甲醇，溶解即可，然后加入飽和碳酸鉀水溶液 10mL進行震蕩，震蕩的時間和次數可根據TLC點板的結果來確定，通過碳酸鉀與未保護的2， 4-二羥基苯乙酮的4-羥基發生酸堿反應成鹽，二氯甲烷和飽和氯化鈉水溶液萃取進入水 相，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，可較好的除去未參加反應的2， 4-二羥基苯乙酮，有機相用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑，得到純度較高的保護后的2， 4-二羥基苯乙酮，粉色塊狀，產率53%。
[0081] b)對羥基苯甲醛的甲基化反應 [0082] (1)重氮甲烷乙醚溶液制備方法
[0083]在一裝有攪拌、回流冷凝器，連接接收瓶的100毫升三口瓶中加人3.0克氫氧化鈉 溶于3.2毫升水，0.4克TEBA，6毫升氯仿，攪拌下加入4毫升乙醚。加熱至回流，滴加6.4毫升 50%水合聯胺。加完后繼續反應40分鐘。接收瓶中加入6毫升乙醚，反應過程中不斷有黃色 氣體被吸收，所得重氮甲烷乙醚溶液備用。
[0084] (2)在100毫升圓底瓶中加入200mg對羥基苯甲醛，30mL四氫咲喃，室溫下加入6毫 升自制重氮甲烷乙醚溶液，室溫攪拌3小時，反應結束減壓濃縮后加入15毫升水，濾取固體， 水洗，干燥得甲基化的對羥基苯甲醛，經柱層析純化。
[0085] c)在圓底燒瓶里加入羥基保護后的2,4-二羥基苯乙酮和l.Oequiv的對甲氧基苯 甲醛，20mL乙醇溶解，加入20 % K0H的水溶液2mL，在60 °C油浴下攪拌反應，反應所需的時間 和溫度根據TLC點板的結果來調整，然后進行后期處理，首先旋干乙醇，然后用二氯甲烷和 水萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，目的是除去KOH，減壓蒸出 有機相溶劑后得到反應混合物。
[0086] d)將上述得到的反應混合物溶于甲醇中，加入2mL的鹽酸水溶液，室溫攪拌，當完 全脫掉吡喃保護基時，將反應液旋干，再用二氯甲烷和水進行萃取，可根據有機相顏色來確 定萃取的次數，通常3次為最佳，減壓蒸除有機相溶劑得到粗產物，通過硅膠柱色譜進行純 化，流動相選用石油醚-丙酮體系，得到目標化合物，黃色粉末，產率90 %。
[0087] WZ-7理化數據:黃色粉末，分子式為&此4〇4，ESI-MS m/z : 271 [M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0088] 37 ) ,6.83(2H,d,J = 8.6Hz,H-3,H-5) ,7.79(2H,d,J = 8.6Hz,H-2,H-6) ,7.93(1H,J = 15.3Hz,H-a),8.19(2H,m,H-P,H-6/),3.70(3H,s,H-0Me),13C-NMR(400MHz,Pyr)8：114.5(C-l 7 ),168.0(C-2/ ),104.0(C-3/ ),167.3(C-4/ ),109.0(C-5/ ),133.5(C-6/ ),192.7(C = 0), 119.5(C-a),144.7(C-P),128.7(C-1),131.5(C-2,C-6),115.4(C-3,C-5),162.7(C-4), 55.9(C-0Me).
[0089] 實施例6
[0090] 本實施例提供了WZ-8異甘草素衍生物的制備方法：
[0091 ] a)將2mmol2,4-二羥基苯乙酮和0. lmmol對甲苯磺酸吡啶鹽加入到50mL圓底燒瓶 中，加入20mL二氯甲烷，室溫攪拌(懸濁液），緩慢滴加0.38mL(3 . Ommol)3，4-二氫吡喃（用 3mL二氯甲烷稀釋），滴畢后在室溫下反應，反應的時間和進度由TLC跟蹤檢測，待到反應產 物不再增加，底物不再減少，對反應混合物進行后期處理。首先將反應體系中的溶劑減壓蒸 除，然后在粗產物中加入適量甲醇，溶解即可，然后加入飽和碳酸鉀水溶液10mL進行震蕩， 震蕩的時間和次數可根據TLC點板確定，通過碳酸鉀與未保護的2,4_二羥基苯乙酮的4-羥 基發生酸堿反應成鹽，再通過二氯甲烷和飽和氯化鈉水溶液萃取進入水相，可根據有機相 顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，可較好的除去未參加反應的2，4_二羥基苯乙酮， 有機相用無水硫酸鈉干燥后，減壓蒸除溶劑，得到純度較高的保護后的2,4_二羥基苯乙酮， 粉色塊狀。
[0092] b)將上述得到的保護后的2,4_二羥基苯乙酮和l.Oequiv的二甲氨基苯甲醛溶于 甲醇中，室溫攪拌均勾，加入NaOH的水溶液(20% )2mL，然后在65°C的油浴條件下反應。反應 時間和溫度可根據TLC點板情況適當調整，待反應結束時，旋除甲醇，加入二氯甲烷和水進 行萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，目的是除去NaOH，有機相減 壓旋干，得到反應混合物.
[0093] c)將上述得到的反應混合物溶于甲醇（15mL)中，加入鹽酸水溶液（1:10)2mL，室溫 攪拌，TLC確定反應時間，溫度，當完全脫掉吡喃保護基時，將甲醇旋干，再用二氯甲烷和水 進行反復萃取，可根據有機相顏色來確定萃取的次數，通常3次為最佳，減壓蒸除有機相溶 劑，得到粗產物，再通過硅膠柱色譜進行純化，一般選擇石油醚-丙酮體系，或者二氯甲烷-甲醇體系，純化后得到的目標化合物均為黃色粉末。產率(32% )。
[0094] WZ-8理化數據:黃色粉末，分子式為CnHnOs，ESI-MS m/z : 284[M+H] +，易溶于甲醇， 在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0095] ^-NMRC 400MHz, Pyr)8： 6. TeCSH.m.H-S7 ,H-3 ,H-5) ,6.90( lH,d ,J = 2.2Hz .H-S7 ), 7.88(1H ,J= 15.2Hz, H-a), 7.77(2H,d,J = 8.7Hz,H-2,H-6) ,8.28(2H,d ,J= 15.2Hz ,H-0), S.lSCC-e7),2.81(6H,s,H-Me),13C-NMR(400MHz,Pyr)8：114.7(C-l / ),167.9(C-27),104.5 (C-37),166.9(C-4 /),109.4(C-5/ ),133.2(C-6/ ),192.7(C = 0),115.9(C-a),146.1(C-P), 131.6(C-2,C-6),112.8(C-3,C-5),153.0(C-4),40.2(C-Me).
[0096] 實施例7
[0097]本實施例提供了WZ-9異甘草素衍生物的制備方法：
[0098] a)在圓底燒瓶內，加入2mmol的對氨基苯乙酮，20mL PEG-400,室溫攪拌均勻，依次 加入0.02mmol的DBU，2mmol的對甲苯磺酰氯，室溫下反應，TLC跟蹤反應進行情況，反應結束 后進行后期處理，首先用二氯甲烷和水萃取，PEG-400進入水相，反復萃取，以便較好的除去 PEG-400，然后旋干有機相，得到的粗產物溶于適量甲醇中，溶解即可，加入鹽酸水溶液（1: 10)5mL，室溫攪拌，目的是通過鹽酸與對氨基苯乙酮發生酸堿反應成鹽，30min后，用二氯甲 燒和水進行萃取，萃取二次為最佳，鹽進入水相，可較好的除去未參加反應的對氨基苯乙 酮，減壓蒸除有機相溶劑，得到純凈度較高的對甲苯磺酰氨苯乙酮。
[0099] b)羥醛縮合反應:將上述得到的對氨基苯乙酮的磺酰胺衍生物溶于25mL甲醇中， 再加入l.Oequiv的對羥基苯甲醛的甲醇溶液5mL，室溫下攪拌均勻，加入催化劑量的H2S04 (1〇〇此），然后升高溫度到60°C油浴，根據TLC結果來調整反應的時間和溫度，當反應結束 后，先旋干甲醇溶劑，然后用二氯甲烷和水萃取，萃取三次為最佳，有機相減壓蒸除溶劑，硅 膠柱色譜進行純化，選擇石油醚-丙酮體系，得到目標產物，黃色粉末，產率25 %。
[0100] WZ-9的理化數據:黃色粉末，分子式為C22H19〇4N，ESI-MS m/z:394[M+H]+，易溶于甲 醇，在254nm波長下有吸收，其核磁共振氫譜，碳譜數據如下：
[0101] a，H-3〃，H-5〃），8?11(3H，m，H-0，H-6'，H-2' )，8?26(2H，d，J = 8?7Hz，H-2〃，H-6〃），13C-NMR (400MHz,Pyr)8：124.0(0-17),131.7(C-27 .C-67),119.7(C-37 .C-S7),144.5(C-47),188.8 (C=0),119.5(C-a),145.3(C-P),131.l(C-2,C-6),117.5(C-3,C-5),162.3(C-4),138.6
[0102]對以上制取的異甘草素及其衍生物進行生物活性試驗，首先制備人類心肌細胞， 在患者同意的基礎上，從進行了冠狀動脈旁路移植術的患者（56.1±4.7歲）得到的人類右 心房樣本中分離出心房細胞。所有患者沒有室上性心律失常，并且心房在手術時很正常。在 切除后，迅速將樣本浸入充氧的、普通無Ca 2+離子溶液。酶解分離心房心肌細胞。首先，切碎 心房組織，并且用100%氧氣通過無Ca2+的臺式溶液，連續起泡并攪拌15min(新配溶液中 5min-次），然后在含有150-200U/mL膠原酶、0.2mg/mL的蛋白酶和lmg/mL牛血清白蛋白的 類似溶液中培養50min。然后，在相同組分但不含蛋白酶新配酶溶液中再培養該組塊。在顯 微鏡下監測分離細胞的質量和數量。當細胞產量接近最佳時，將該組塊懸浮于一種包含 10mMKCl、120mM K-谷氨酸、10mM KH2P04、1.8mM MgS04、10mM牛磺酸、10mM HEPES、0.5mM EGTA、20mM葡萄糖、10mM甘露醇，PH用K0H調節為7.3的高K+離子培養基中，并且用移液管輕 輕地吹。使用前將分離出的肌細胞在培養基中室溫下保存至少1小時。
[0103]其次培養細胞系，將所建立的穩定表達Kvl .5鉀通道的HEK293細胞系單獨保存在 補充了 10%胎牛血清并且含有400yg/mL G418的達爾伯克改良的伊格爾培養基(Dulbecco' s modified eagle medium)中。
[0104]然后進行數據采集，將少量含有分離細胞的溶液移入固定在反向顯微鏡載物臺上 的開口灌注室（lmL)中。待肌細胞附著在容器底部5-10min后，用臺式溶液以2-3mL/min的流 速灌流(在此僅使用有清晰的交叉條紋的靜止桿狀細胞）。電流記錄在室溫(21-22°C)下進 行，動作電位在36 °C下進行記錄。
[0105]最后，進行數據統計和分析，藥物對IKur電流的抑制效果采用抑制率表示，其計算 公式如下：
[0106] E=l-Idrug/lcon
[0107] 這里1_是對照條件下的峰電流，Idrug是給藥條件下的峰電流。藥物的量效關系曲 線采用Hi 11方程進行擬合：
[0109]式中，E表示藥物濃度為C時對電流抑制的百分比，￡_\是電流的最大抑制率，1(：50代 表藥物的半數抑制濃度，h為Hi 11系數。
[0110] 數值結果用means 土 SEM表示。采用Sigmaplot( SPSS, Chicago)軟件進行非線性曲 線擬合。統計比較用Student's t test分析，p〈0.05被認為是有顯著的統計學差異。
[0111]利用上述實驗方法對異甘草素及部分衍生物進行了抗Kvl. 5鉀通道活性評價。在 30yM濃度下，被檢化合物均對Kvl.5鉀通道電流IKur具有顯著抑制活性，試驗結果見附圖說 明，抑制率見下表，其中1代表異甘草素。
[0114] 通過上述試驗表明，異甘草素及其衍生物對Kvl.5鉀通道具有顯著的抑制活性，說 明這些化合物具有治療心房顫動等心律失常疾病的良好效果。
[0115] 雖然本發明已以較佳實施例揭示如上，然其并非用以限定本發明，任何本領域技 術人員，在不脫離本發明的精神和范圍內，當可作些許的修改和完善，因此本發明的保護范 圍當以權利要求書所界定的為準。
【主權項】
1. 一種異甘草素衍生物，所述的異甘草素，其本體結構為：其中，扣為H、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-下締基、正下酷基、異下烷基中的一種，R2為 H、甲基、環丙烷甲基、3-甲基-2-下締基、正下酷基、異下烷基中的一種。2. 根據權利要求1所述的異甘草素衍生物，其特征在于，所述異甘草素或其衍生物是從 植物中分離獲取或通過化學合成得到。3. 根據權利要求1所述的異甘草素衍生物，其特征在于，所述異甘草素的衍生物為：,- Q4. 權利要求1至3中任一項所述的化合物在治療屯、房纖維性顫動中的應用，其特征在 于，向患者給藥有效量的所述異甘草素或其衍生物。
【文檔編號】C07C225/22GK105967992SQ201610373519
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年5月31日
【發明人】王紅兵, 王卓
【申請人】同濟大學