用于同時檢測聚合酶鏈式反應溶液中的dna標靶擴增子的非電動化的光學復用
【專利摘要】本發明提供了一種復用聚合酶鏈式反應(PCR)DNA檢測系統以及一種用于在所述PCR系統內檢測DNA的方法。所述PCR DNA檢測系統包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機、熒光團?猝滅劑探針和成像室。所述熒光團?猝滅劑探針被選擇響應于由所述熒光團?猝滅劑探針所猝滅的對應于三種選定的原色和所述CCD相機的峰值通道響應的熒光團，使得所述熒光團的發射譜基本上匹配這三種選定的原色，并且所述熒光團的峰值發射譜對應于所述CCD相機的峰值RGB通道響應。DNA樣品和所述熒光團?猝滅劑探針位于所述成像室內。所述彩色CCD相機聚焦于所述成像室以便從所述DNA樣品和所述熒光團?猝滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標靶。
【專利說明】用于同時檢測聚合酶鏈式反應溶液中的DNA標靶擴増子的非 電動化的光學復用
[00011優先權聲明
[0002]本申請要求2013年10月14日提交的新加坡專利申請號201307650-0的優先權。
技術領域
[0003] 本發明涉及聚合酶鏈式反應(PCR)生物分析。具體來說，其涉及用于同時檢測PCR 溶液中的DNA標靶擴增子的非電動化的光學復用。
【背景技術】
[0004] 近三十年來，聚合酶鏈式反應(PCR)已經成為實驗室和臨床環境兩者中廣泛使用 的生物測定。隨后，實時PCR的出現實現了擴增步驟和檢測步驟這兩者的自動化。已經開發 了具有高通量和復用特征的多種臺式實時PCR裝置。最近還開發了覆蓋樣品制備、DNA提取、 PCR擴增和檢測的全自動系統。這些裝置能夠對細菌和病毒病原體的宿主進行快速、精確和 特異性的診斷。
[0005] 然而，在缺少中心化實驗室的發展中國家對于此類床旁(point-of-care，P0C)診 斷存在迫切但尚未滿足的需求。便攜性是PCR裝置的關鍵P0C特征并且將會影響用于此類系 統的光學模塊的設計。便攜式系統需要光學模塊(i)具有不可移動的組件，（ii)占據較小的 空間，（iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復用。
[0006] 針對中心化實驗室所設計的臺式PCR裝置通常使用可移動的光學組件，使得檢測 器(例如電荷耦合器件(CCD)、光電倍增管(PMT)、光電二極管)和激發光源可以使用x-y馬達 在96孔板或384孔板的不同區域上自動定位。臺式PCR裝置還使用電動化的激發、二向色性 和發射濾光輪以使特定光譜帶寬的多種探針的檢測實現自動化。
[0007] 然而，不存在X-y馬達則意味著光電檢測器具有與96孔板或384孔板一樣大的視 野。另外，激發光需要被大面積投射，并且因此每單位面積的光強度必須足夠高，高到可以 檢測熒光探針。這需要使用高功率鎢燈或汞燈，這與開發便攜式P〇C PCR裝置的目標產生了 偏離。隨著在紫外線(UV)和可見波長范圍兩者內的高功率(大于5瓦）、高亮度和緊湊型發光 二極管(LED)光源的出現，已經提出了一種對于常規光源的有效且由電池供電（大約12伏） 的替代物。
[0008] 此外，已經在非電動化的光學檢測系統的開發中實施了不同的策略。舉例來說，單 一藍色LED已被用于通過熒光共振能量傳遞(FRET)同時激發具有530nm、640nm和705nm的發 射波長的熒光共輒探針。然后通過三個對應的光電二極管，經由發射帶通濾光片和分束器 的級聯收集發射光譜。雖然這種光學方案比較便宜，但是由于傳輸損失，所發射信號的收集 效率被限定在約40-50 %。
[0009] -種常規的解決方案提議使用分光計來檢測和解析熒光共輒DNA探針的發射波 長。使用分光計的好處在于，其提供在復用PCR環境中很重要的極佳波長解析。然而，其缺乏 空間解析，并且這需要使用電動化的圓盤傳送帶在連接到分光計的光學纖維的直觀視圖中 依序定位DNA樣品。備選地，需要并入1維或2維掃描儀以實現空間解析。
[0010] 另一種常規的解決方案提出了基于CCD的熒光計以用于實時PCR。使用470nm LED 作為激發光源，但是代替將發射濾光片級聯起來，實施具有6個光學濾光片的旋轉盤以提供 在530腦、56〇]1111、61〇11111、64〇11111、67〇111]1和71〇111]1的6個焚光檢測通道。雖然解決了收集效率有 限的問題，但是由于需要使旋轉盤電動化，因此這種設計更為復雜。
[0011] 另一種常規的裝置利用緊湊型的模塊化筒體系統，其包括PCR反應室、熱循環模 塊、4個LED激發光和對應的用于檢測的光電二極管。然而，每一筒體僅處理一種患者樣品并 且成本較高。此外，集成筒體使復用范圍僅限于光學方面，而不是空間與光學復用的組合。
[0012] 另外的一種解決方案實施了實時PCR光學檢測系統，其并入有激光器、濾光塊、光 電檢測器和1X4纖維光學開關，使得可以從4個不同的反應部位獲得熒光信號。此類設計似 乎非常適合于便攜式PCR系統，借此存在4個部位的空間復用并且整個系統不具有任何可移 動的部件。然而，不存在光學復用，因為激光器產生特定波長的激發，并且二向色鏡和發射 濾光片兩者都具有帶通性質。
[0013]另一種系統利用使用巢式PCR的實時PCR裝置，借此擴增后的DNA樣品被遞送到多 孔芯片上以用于第二輪實時PCR擴增。用特異性引物對和SYBR綠色插入染料預加載每個孔， 以便使用不可移動的基于CCD的熒光成像系統檢測單一 DNA標靶。雖然這種系統提供高度的 空間復用，但是它僅具有單個光學通道以供檢測之用。
[0014]因此，需要一種便攜式系統，其光學模塊（i)具有不可移動的組件，（ii)占據較小 的空間，（iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復用。此 外，其它期望的特征和特點將根據隨后的【具體實施方式】和隨附權利要求書，結合本公開的 附圖和背景而變得顯而易見。
【發明內容】
[0015] 根據【具體實施方式】，提供了一種復用聚合酶鏈式反應(PCR)DNA檢測系統。所述PCR DNA檢測系統包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機、熒光團-猝滅劑探針和成像室。所述熒光 團-猝滅劑探針被選擇響應于由所述熒光團-猝滅劑探針所猝滅的對應于三種選定的原色 和所述CCD相機的峰值通道響應的熒光團，使得所述熒光團的發射譜基本上匹配這三種選 定的原色，并且所述熒光團的峰值發射譜對應于所述CCD相機的峰值RGB通道響應。DNA樣品 和所述熒光團-猝滅劑探針位于所述成像室內。所述彩色CCD相機聚焦于所述成像室以便從 所述DNA樣品和所述熒光團-猝滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標靶。
[0016] 根據另一個方面，提供了一種用于在包括CCD相機的系統中進行PCR檢測的方法。 所述方法包括用熒光團-猝滅劑探針光學復用最多三個標靶。所述熒光團-猝滅劑探針被選 擇響應于由所述熒光團-猝滅劑探針所猝滅的對應于三種選定的原色和所述CCD相機的峰 值通道響應的熒光團，使得所述熒光團的發射譜基本上匹配這三種選定的原色，并且所述 熒光團的峰值發射譜對應于所述CCD相機的峰值RGB通道響應。
【附圖說明】
[0017] 附圖用于說明各種實施方案并且用于解釋根據一個本發明的實施方案的各種原 則和優勢，在附圖中類似的參考數字是指遍及單獨視圖中的相同或功能類似的元件，并且 所述附圖連同以下【具體實施方式】一起并入說明書中并且形成說明書的部分。
[0018] 圖1示出了根據一個本發明的實施方案的聚合酶鏈式反應(PCR)系統。
[0019] 圖2示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統中的發光二極管(LED)光源。
[0020] 圖3示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統的激發光譜和發射光譜的圖 表。
[0021] 圖4示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統的彩色電荷耦合器件(CCD) 相機的紅色、綠色和藍色(RGB)多波段發射光譜和RGB響應的圖表。
[0022]圖5示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統的多波段濾光片的激發光譜 和發射光譜以及熒光團的激發光譜和發射光譜的圖表。
[0023]包括圖6A和6B的圖6示出了根據本發明的該實施方案的RGB熒光團，其中圖6A示出 了采取線性探針構型的RGB熒光團，并且圖6B示出了采取發夾探針構型的RGB熒光團。
[0024]包括圖7A、7B和7C的圖7示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統的光絕 緣體，其中圖7A是光絕緣體的前視平面示意圖，圖7B是光絕緣體的俯視平面示意圖，并且圖 7C示出了并入有該光絕緣體的圖1的PCR系統的光學系統。
[0025]包括圖8A、8B、8C、8D和8E的圖8根據本發明的該實施方案示出了亮黑表面的襯底 材料與鋁板襯底材料之間關于來自DNA探針的熒光讀出數的信噪比（SNR)的比較，其中圖8A 描繪了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中的FAM探針，圖8B描繪了被放置在鋁板上的多 孔DNA芯片中的FAM探針，圖8C描繪了被放置在亮黑表面和鋁板上的DNA芯片中的每個孔的 熒光讀出數的SNR的圖表，圖8D描繪了被放置在亮黑表面上的PCR反應管中的UV探針的連續 稀釋液，并且圖8E描繪了被放置在鋁板上的PCR反應管中的UV探針。
[0026]包括圖9A、9B、9C、9D和9E的圖9示出了常規實時PCR系統與根據本發明的該實施方 案的圖1的實時PCR系統的熒光讀出數之間的相關性，其中圖9A描繪了使用熒光素亞酰胺 (:1^111〇代8〇6；[11&111丨(1;^6)131111-!1111：(311；[1^8-(>)皿716探針（例如？4]\1-13現1探針）的3-磷酸甘油 醛脫氫酶(GAPDH)小鼠對照基因在35個循環之后的雙重實時PCR熒光讀出數，圖9B描繪了使 用FAM-BHQ1探針的GATOH小鼠對照基因在25個循環之后的重復實時PCR熒光讀出數，圖9C描 繪了與常規實時PCR系統的每個循環的類似讀出數相比，在使用圖1的實時PCR系統的情況 下，圖9A和9B的循環中的每個循環的雙重讀出數的PCR擴增結果的圖表，圖9D描繪了使用圖 9B的探針的圖1的實時PCR系統與常規PCR系統的歸一化熒光讀出數以及在25個循環后相關 聯的條形圖，并且圖9E描繪了使用圖9A的探針的兩個PCR系統的歸一化熒光讀出數以及在 35個循環后相關聯的條形圖。
[0027] 包括圖10A、10B、10C和10D的圖10示出了在使用常規PCR系統和根據本發明的該實 施方案的圖1的PCR系統的情況下，PCR溶液中的Cy3與Cy5熒光的解析，其中圖10A描繪的圖 表示出了利用常規PCR系統使用FAM共輒DNA探針、Cy3共輒DNA探針和Cy5共輒DNA探針的 GAPDHJ-肌動蛋白和B2M小鼠對照基因的三重實時PCR擴增，圖10B描繪了 FAM-GAPDH、Cy3- β-肌動蛋白和Cy5-B2M的終點單重擴增結果，圖10C描繪了終點雙重擴增結果，并且圖10D描 繪了圖10C的擴增結果的RGB散點圖。
[0028] 圖11示出了根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統中的光譜上不同的熒光團 的單重、雙重和三重混合物。
[0029] 包括圖12A和12B的圖12示出了使用FAM、Cy5和Alexa 405探針的GAPDH、B2M和β-肌 動蛋白小鼠對照基因的終點PCR擴增結果，其中圖12A描繪了FAM、Cy5和Alexa 405的單重反 應，并且圖 12B描繪了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應。
[0030] 圖13示出了利用根據本發明的該實施方案的圖1的PCR系統，用于將復用PCR溶液 解析成其熒光團分量的基于顏色的去卷積法。
[0031] 本領域的技術人員將了解，示出圖中的元件是為了簡單和清楚的目的，并且這些 元件不是必需按比例描繪的。舉例來說，圖解、框圖或流程圖中的一些元件的尺寸相比其它 元件可以放大，以便幫助加強對本發明的實施方案的理解。
【具體實施方式】
[0032]以下【具體實施方式】在本質上僅僅是示例性的，并且不旨在限制本發明或本發明的 應用和用途。此外，也不打算受本發明的先前背景或以下【具體實施方式】中所提出的任何理 論束縛。本發明的實施方案旨在呈現一種用于實時PCR的完全靜態的光學檢測系統，其提供 在缺少中心化實驗室的發展中國家供診斷之用的便攜式床旁(POC)PCR系統。便攜式實時 PCR系統有利地具有特征如下的光學模塊：（i)具有不可移動的組件，（ii)占據較小空間， (iii)由電池供電，（iv)具有充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復用。此外，所述 定時PCR系統是復用DNA檢測系統，其包括彩色電荷耦合器件(CCD)相機、熒光團-猝滅劑探 針和成像室。熒光團-猝滅劑探針被選擇響應于由熒光團-猝滅劑探針所猝滅的對應于三種 選定的原色和CCD相機的峰值通道響應的熒光團，使得熒光團的發射譜基本上匹配這三種 選定的原色，并且熒光團的峰值發射譜對應于CCD相機的峰值RGB通道響應。DNA樣品和熒光 團-猝滅劑探針位于成像室內，并且彩色CCD相機聚焦于成像室以便從DNA樣品和熒光團-猝 滅劑探針的熒光同時檢測最多三個標靶。
[0033]參考圖1，根據一個本發明的實施方案的PCR系統100包括彩色CCD相機102、完全多 波段激發濾光片104、完全多波段發射濾光片106、具有二向色鏡109的完全多波段二向色濾 光塊108、光源110、準直透鏡112和聚焦透鏡114、不透光的成像室116和計算機118。計算機 118通過纜線120例如火線纜線與彩色CCD相機102耦合，并且包括專用圖像處理軟件。光源 110是寬帶UV-可見(例如在380-700nm波長范圍內可見)光源，其可以使用汞燈或發光二極 管(LED)以光纖纜線實施。
[0034] 彩色(XD相機102覆蓋相當大的視野(例如大約15cmX 15cm)，而多波段濾光片104、 106、108能夠對來自成像室116中的熒光團標記DNA探針的三原色進行復用檢測。用相機102 捕獲熒光圖像。然后通過計算機118中的軟件對PCR反應中的像素實施基于顏色的去卷積， 以將來自兩個或更多個DNA標靶的混合物的熒光解析成其熒光團分量。
[0035]對熒光團進行選擇，使得其發射譜幾乎匹配三原色紅、綠和藍(RGB)。根據本發明 的該實施方案，DNA熒光探針可以選自Alexa 405、級聯藍（Cascade Blue)或太平洋藍 (Pacific Blue)以用于藍光發射譜，選自Alexa 488、熒光素亞酰胺(FAM)或異硫氰酸熒光 素(FITC)以用于綠光發射譜，以及選自德克薩斯紅(Texas Red)、Cy5或Alexa 647。優選地， 根據本發明的該實施方案的DNA熒光探針是Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅。非電動化 的光學復用是如下實施的：使用這些DNA熒光探針，利用UV-可見光源110相應地激發這些熒 光團，并經由火線纜線120,通過計算機118上的定制圖像分析軟件，利用完全三波段濾光裝 置(激發濾光片104、發射濾光片106和二向色濾光塊108)以及實時控制的RGB相機102來進 行檢測。
[0036] 光學系統100可以被廣泛地分成4個模塊：（i)UV_可見寬帶汞光源或LED光源110， (ii)激發濾光片104、發射濾光片106和二向色濾光片108(例如由Rochester，New York, U.S.A.的Semrock公司銷售的濾光片），其各自具有兼容的三波長帶，（iii)基于CCD的RGB相 機 102和透鏡 112(例如由Richmond,British Columbia,Canada的Point Grey Research公 司銷售的具有25mm聚焦透鏡的Grasshopper2牌基于CCD的RGB相機），和（iv)在計算機118上 執行的用于分析來自相機102的圖像的定制圖像分析軟件（例如使用由Natick， Massachusetts,U.S.A.的The Mathworks公司銷售/許可的Matlab Image Acquisition Toolbox所開發的軟件）。
[0037] 光源110可以使用萊光源(例如由Wetzlar,Germany的Leica Microsystems銷售的 EL6000汞燈）實施。圖2示出了一種替代性的光源配置200。在光源配置200中，使用UV LED 202與暖白光可見LED 204的組合作為光源110。額定功率大于5瓦的LED 202、204可以有利 地提供具有380-700nm的寬帶UV光譜的光學系統100。根據本發明的該實施方案，光源配置 200是便攜式的，因為其可以由12伏電池供電并且有利地配備有散熱器和微型風扇（例如5 伏的微型風扇）以用于有效散熱。
[0038]濾光塊108中的二向色鏡109反射來自UV LED 202的光，并且透射來自可見白色 LED 204的光，使得UV可見光束206入射到成像室116中的DNA樣品上，光束206是波長范圍為 390nm到700nm的UV-可見寬帶光束。凸透鏡208、210減小來自這兩個LED 202、204的光的發 散角，使得光可以有效地耦合入濾光塊108中。
[0039]多波段濾光片已經被用于熒光顯微術以及熒光原位雜交(FISH)應用中，但是在本 發明的該實施方案之前尚未在實時PCR環境中實施。多波段濾光片的使用產生了特定問題， 例如（i)難以從被雜交到PCR溶液中的對應DNA標靶上的兩個或更多個基于熒光的DNA探針 的均質混合物解析每一熒光團分量的相對熒光單位(RFU)，（ ii)CCD偏好500nm到550nm的光 譜帶寬，對于450nm以下和600nm以上的波長的靈敏度逐漸降低，（iii)由于單一激發帶寬而 導致可能激發兩個或更多個熒光團，這是因為所有熒光團都被同時激發并且對應的發射光 譜被同時收集，以及（iv)在兩個(或更多個)熒光團之間存在顯著的光譜重疊，使得這些熒 光團的混合物可能難以解析。
[0040]本發明的該實施方案解決并且有利地克服了這些問題。參考圖3,描繪了根據本發 明的該實施方案的PCR系統100的激發光譜和發射光譜的圖表300。沿X軸302對光波長繪圖， 并且沿y軸304對透射率百分比繪圖。寬帶UV-可見光在通過激發濾光片104之后產生透射光 譜306。這個光譜306也被稱為激發光譜306并且由二向色鏡109反射，因為其不與鏡子的透 射光譜308重疊。激發光譜306入射到成像室116中的DNA樣品上，并且目的熒光團將發射出 發射光譜310。發射光譜310將通過二向色鏡109透射到(XD相機102中，這是因為該CCD相機 被完全容納在鏡子109的透射光譜308中。因此，由用于激發、發射和二向色目的的兼容的三 波段濾光片104、106、108組成的多波段濾光裝置檢測1號波段312、2號波段314和3號波段 316中的每一個，這些波段312、314、316與目的特定熒光團匹配。根據本發明的該實施方案， 有利地選擇三波段濾光片104、106、108以將復用限定在用于最佳熒光團發射區分的三種顏 色，因為在更高階多波段濾光片中普遍存在的光譜重疊阻礙實時PCR系統中的熒光團分量 的精確解析。
[0041 ]此外，三波段濾光片的發射光譜310與RGB C⑶相機102中的紅色、綠色和藍色通道 的峰值光譜響應重疊，如圖4所示。圖表400示出了紅色、綠色和藍色(RGB)多波段發射光譜 310和CCD相機102的RGB響應。沿X軸402對光波長繪圖，并且沿y軸404對透射率百分比繪圖。 多波段發射光譜310的藍色312、綠色314和紅色316分量與彩色CCD相機102的藍色通道響應 406、綠色通道響應408和紅色通道響應410-起繪圖。可以從圖表400觀察到，藍色406、綠色 408和紅色410通道的峰值響應接近于多波段發射光譜310的藍色312、綠色314和紅色316分 量。藍色分量312主要與相機102的藍色通道響應406重疊，而綠色分量314主要與綠色通道 響應408重疊，并且紅色分量316主要與紅色通道響應410重疊。
[0042]因此，根據本發明的該實施方案，每一多波段分量312、314、316在光譜上是不同 的，并且選擇這三個熒光團共輒DNA探針以使得(a)熒光團的峰值發射譜對應于CCD相機的 峰值RGB通道響應和三波段發射濾光片的帶寬這兩者，和(b)熒光團的峰值激發譜對應于三 波段激發濾光片的帶寬。參考圖5,圖表500示出了多波段濾光片104、106、108的激發光譜 306和發射光譜310以及為了在PCR系統100中最佳運轉而選擇的熒光團的激發光譜506、 508、510和發射光譜516、518、520。沿1軸502對光波長繪圖，并且沿7軸504對透射率百分比 繪圖。
[0043]可以從圖表500看出，所選熒光團的激發光譜506、508、510不應彼此重疊，并且熒 光團的發射光譜516、518、520僅應彼此最小程度地重疊。此外，多波段濾光裝置104、106、 108的激發光譜306應對應于熒光團的峰值激發響應506、508、510，并且多波段濾光裝置 506、508、510的發射光譜310應覆蓋熒光團的峰值發射光譜值516、518、520。
[0044]根據本發明的該實施方案，所選熒光團優選是具有激發光譜506和發射光譜516的 Alexa 405-ProbelSeq.-Dabcyl探針、具有激發光譜508和發射光譜518的Alexa 488- Probe2Seq.-BHQl探針、和具有激發光譜510和發射光譜520的德克薩斯紅-Probe3Seq·- BHQ2探針。也符合本發明的該實施方案的標準并且可能潛在地使用的其它熒光團包括級聯 藍和太平洋藍(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Cy5和Alexa 647(代替德 克薩斯紅）。
[0045] 熒光團德克薩斯紅或Cy5、Alexa 488或FAM以及Alexa 405統稱為RGB熒光團，因為 它們響應于UV-可見寬帶光激發而分別發射紅色、綠色和藍色熒光。參考圖6,描繪了熒光團 德克薩斯紅或Cy5 602、612、Alexa 488或FAM 604、614以及Alexa 405 606、616。圖6A示出 了采取線性探針構型的RGB熒光團602、604、606，并且圖68示出了采取發夾探針構型的1?? 焚光團612、614、616。
[0046]焚光團的發射強度由比爾-朗伯定律(Beer-Lambert Law)如下定義：
[0047] Iem=k(i>Iex(l-e-ebc) (1)
[0048] 其中Iem是發射光的強度，k是幾何儀器因子，Φ是熒光量子產率，Iex是激發光的強 度，ε是摩爾消光系數，b是光程長度(光通過材料行進的距離），c是熒光團濃度。如果 0.05(其中b = lcm)，則等式1可以近似為等式2:
[0049] Iem=k<})Iexebc (2)
[0050] 假定Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅的消光系數分別是34,0001^011-^71, 000M-Vm-1和85，000M-Vm-1，那么所有三個熒光團都滿足等式2實現近似的ebc彡0.05要求， 因為PCR反應中的未猝滅的熒光團的最大濃度被固定在200nM。等式2可以用矩陣表示法如 下表示。
[0052] 等式3可以如下簡化：
[0057]如所屬領域的技術人員將了解，算法被分成訓練階段和測試階段，借此在訓練階 段期間通過實施非負矩陣分解(NMF)算法確定矩陣Q，并且其中所有三個矩陣的元都是非負 的。這是通過捕獲已知濃度Ctrain的單一熒光團溶液的熒光圖像來實現的，其中Itrain將代表 來自目的區域的η個RGB像素的矩陣。
[0058]在測試階段，如下確定矩陣C:
[0059] Ctest=ItestQ_1 (8)
[0060] 其中Itest代表新的一組η個RGB像素。
[0061] 包括圖7A、7B和7C的圖7示出了根據本發明的該實施方案的PCR系統100的光絕緣 體702。參考圖7A和7B，前視平面示意圖700和俯視平面示意圖710示出了圓錐形的光絕緣體 702。光絕緣體702的目的是用于防止雜散光漏入光學檢測系統中，如圖7C所示。圖7C示出了 PCR系統100的光學系統720,其并入有光絕緣體702。除了防止雜散光漏入光學檢測系統720 之外，圓錐形的絕緣體702還能夠使并入有相機102、多波段濾光塊108和光源110的光學系 統720直接安裝在它上面，例如經由C型安裝接口。
[0062]關于絕緣體702,襯底材料的選擇對于PCR系統100的運轉是至關重要的。關鍵的 是，絕緣體702的內表面增強而不是抑制來自PCR反應的熒光讀出數的信噪比（SNR)。包括圖 8A、8B、8C、8D和8E的圖8根據本發明的該實施方案示出了被放置在亮黑表面的襯底材料上 的加載有FAM探針的多孔DNA芯片與被放置在反射性鋁板襯底材料上的多孔DNA芯片的熒光 讀出數的SNR的比較。參考圖8A和8B，視圖800描繪了被放置在亮黑表面上的多孔DNA芯片中 的FAM探針，并且視圖810描繪了被放置在鋁板上的多孔DNA芯片中的類似FAM探針。圖8C描 繪了來自DNA芯片中的每個孔的熒光讀出數的SNR的圖表820，其中沿X軸822對孔數繪圖，并 且沿y軸對SNR繪圖。如從圖表820可以看出，對于每個孔來說，來自被放置在亮黑表面上的 DNA芯片中的多個孔的熒光讀出數的SNR 826高于來自被放置在鋁板上的DNA芯片中的多個 孔的熒光讀出數的SNR 828。
[0063]雖然鋁板襯底產生來自DNA芯片中的多個孔的熒光讀出數的較低SNR，但是鋁板的 反射率可能存在問題。舉例來說，鋁板在UV激發下反射藍光，從而抑制從UV探針DAPI樣品的 實際藍光發射，如圖8D和8E所示。圖8D描繪了被放置在亮黑表面上的PCR反應管832中的UV 探針的連續稀釋液的視圖830,并且圖8E描繪了被放置在鋁板上的PCR反應管842中的UV探 針的視圖840。因此，根據本發明的該實施方案，光絕緣體702是由黑色陽極化鋁制造的，以 便對鋁賦予亮黑修飾層，從而實現鋁材料的SNR降低同時沒有反射鋁的缺點。
[0064]包括圖9A、9B、9C、9D和9E的圖9示出了常規實時PCR系統與根據本發明的該實施方 案的實時PCR系統100的熒光讀出數之間的相關性。參考圖9A，視圖900描繪了在小鼠3-磷酸 甘油醛脫氫酶(GAPDH)特異性標靶擴增35個循環之后在兩個相同反應中測量的FAM熒光團 的終點熒光讀出數902、904。同樣地，在圖9B中，視圖910描繪了同樣在小鼠 GAPDH特異性標 靶擴增25個循環之后在兩個相同反應中測量的FAM熒光團的終點熒光讀出數912、914。
[0065] 圖9C描繪了在使用常規實時PCR系統和實時PCR系統100的情況下的對應PCR擴增 結果的圖表920,其中沿X軸922對循環數繪圖并且沿y軸924對相對熒光單位(RFU)繪圖。在 兩種情況下（25個循環930、932和35個循環926、928)，結果針對使用常規非便攜式實時PCR 系統的相同反應的終點RFU值進行比較。圖9D描繪了在25個循環后相關聯的PCR系統100的 歸一化熒光讀出數944、945和常規PCR系統的歸一化熒光讀出數946、947(沿y軸942繪圖）的 條形圖940,并且圖9E描繪了在35個循環后相關聯的PCR系統100的歸一化熒光讀出數954、 955和常規PCR系統的歸一化熒光讀出數956、957(沿y軸952繪圖）的條形圖950。因此，從圖9 可以看出，便攜式實時PCR系統100提供與非便攜式的常規PCR系統類似的檢測靈敏度。
[0066] 包括圖10A、10B、10C和10D的圖10示出了在使用常規PCR系統和根據本發明的該實 施方案的PCR系統100的情況下，PCR溶液中的Cy 3與Cy 5熒光的解析。參考圖10A，其中沿X軸 100 2對循環數繪圖并且沿y軸1004對RFU繪圖的圖表1000示出了利用常規PCR系統，使用Cy 3 共輒DNA探針1006、Cy 5共輒DNA探針1008和FAM共輒DNA探針1010的GAPDH、β-肌動蛋白和β-2 微球蛋白（Β2Μ)小鼠對照基因的三重實時PCR擴增結果。Cy3-i3-肌動蛋白1006的擴增似乎較 低，因為常規PCR系統沒有針對檢測Cy3而進行優化。
[0067] 參考圖10B和10C，視圖1020(圖10B)描繪了常規PCR系統中的FAM-GAPDH、Cy 3-β-肌 動蛋白和Cy5-B2M的終點單重擴增結果，并且視圖1030(圖10C)描繪了常規PCR系統中的雙 重溶液的終點雙重擴增結果，其中ProbeixProbe2y代表X份Probei和y份Probe2。從提出的光 學系統測量的Cy3-i3-肌動蛋白的單重擴增的終點熒光讀出數與FAM-GAH)H和Cy5-B2M是相 當的，如視圖1020所示。視圖1030中的雙重PCR反應突出了在解析FAMtyS1和FAMkyS2具有 類似顏色特征的Cy3和Cy5方面的難度，并且這在圖10D中被觀察到，其中三維RGB散點圖 1040 顯示 Cy3 1042 與 Cy5 1044 以及 FAMtyShiMe 與 FAMtyS1 1048 的顯著光譜重疊。
[0068]圖11描繪了視圖1100，其示出了根據本發明的該實施方案的PCR系統100中的在光 譜上不同的熒光團的單重、雙重和三重混合物，其中CxFyDz*別表示X份Cy3、y份FAM和z份 DAPI。視圖1100顯示PCR溶液中的單重、雙重和三重混合物的更寬光譜，其中'洋紅'、'青色' 和'黃色'分別指示Cy3與DAPI的混合物(CV)、FAM與DAPI的混合物(FV)以及Cy3與FAM的 混合物(CV)。等量的所有三個焚光團(CbV)產生'白色熒光'。
[0069] 考慮到Cy3與Cy5之間的光譜重疊，選擇焚光素亞酰胺Bull-Hutchings-Quayle One (FAM-BHQ1)、Cy5-BHQ2和A1 exa 405-Dabcy 1作為與PCR系統100-起使用的探針組，其中 Cy5優于Cy3，因為與Cy3相比，Cy5與FAM和Alexa 405的光譜分離是更好的。包括圖12A和12B 的圖12示出了使用所選FAM、Cy5和A1 exa 405探針的GATOH、B2M和β-肌動蛋白小鼠對照基因 的終點PCR擴增結果。參考圖12Α，視圖1200描繪了FAM、Cy5和Alexa 405的單重反應，并且參 考圖 12B，視圖 1220描繪了FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應。Alexa 405的背景焚光似乎高于FAM和Cy5的背景焚光。然而，Alexa 405的背景焚光可以通過實施 采用發夾探針構型616(圖6B)的Alexa 405來減少，使得Dabcyl可以更有效地猝滅非混雜態 下的熒光，因為其接近熒光團。
[0070] 接下來參考圖13,圖解1300描繪了利用根據本發明的該實施方案的PCR系統100將 復用PCR溶液解析成其熒光團分量的基于顏色的去卷積。使用以上等式1到8的基于顏色的 去卷積算法，將如視圖1310所示的FAM+Alexa 405、FAM+Cy5和Alexa 405+Cy5的雙重反應物 解析成Cy5、FAM和Alexa 405熒光團分量 1320、1330、1340。
[0071] 因此，可以看出，便攜式實時PCR系統100克服了現有技術系統的缺點并且提供特 征如下的系統：（i)具有不可移動的組件，（ii)占據較小空間，（iii)由電池供電，（iv)具有 充分的檢測靈敏度，和(v)提供適度的通量和復用。根據本發明的該實施方案的便攜式實時 PCR系統100包括光學系統，該光學系統并入有RGB彩色CCD相機102、完全多波段濾光系統 (包括濾光片104、106和具有二向色鏡109的濾光塊108)、RGB熒光探針、UV-可見光源110、不 透光的成像室116和能夠由計算機118執行的基于顏色的去卷積算法(等式1到8)。
[0072] PCR系統100的關鍵有利特征包括：（i)其是非電動化的，并且因此可以被并入需要 熒光讀出的床旁診斷設備中，（ii)其能夠經由去卷積程序在復用反應中對熒光團進行實時 和終點定量，和（iii)其允許光學復用最多3個標靶以及空間復用，因為裝置中的CCD相機和 聚焦透鏡保留空間信息。為了實現最佳性能，多波段濾光片104、106、108需要具有與所用的 熒光探針的光譜特性和RGB相機102的峰值光譜響應這兩者匹配的光譜特性。舉例來說，對 應于Alexa 405和德克薩斯紅探針的多波段濾光片104、106、108的激發帶寬和發射帶寬可 以被定制成更寬，因為與Alexa 488相比，對于這些探針來說，RGB相機102的CCD靈敏度通常 更差。在實驗室裝置中，UV-可見光源110理想地使用汞燈/氙燈來實施，但是對于便攜式戶 外裝置，如光源配置200中所示的組合了 UV與可見白光LED的緊湊型光源110將是優選的。 [0073]除了實時和終點PCR檢測之外，PCR系統100的使用可以延伸到其它應用領域，例如 DNA微陣列、基于熒光的酶聯免疫吸附分析(ELISA)和活的/死的染色系統。光學系統720可 以作為實施這些測定法中的一個或多個的集成裝置的部分而實現，或備選地，除了該光學 系統提供高度特異性的復用熒光讀出數以外，其可以是類似于凝膠成像裝置的獨立熒光讀 取器。
[0074]雖然系統100被設計成檢測Alexa 405、Alexa 488和德克薩斯紅熒光團，但是滿足 多波段濾光片和相機的必需光譜特性的其它熒光團也可以潛在地使用，例如級聯藍和太平 洋藍(代替Alexa 405)、FAM和FITC(代替Alexa 488)以及Alexa 647和Cy5(代替德克薩斯 紅）。探針可以采取線性或發夾構型(分別參見圖6A和6B)。此外，光學系統720也可以用于從 例如SYBR Green、DAPI和碘化丙啶等其它常用染料讀取熒光。
[0075]顏色去卷積已經在組織學上被傳統地用于從使用光學顯微鏡獲取的圖像解析基 于吸光度的染料，例如蘇木精、曙紅和DAB。在PCR系統100中，顏色去卷積針對熒光圖像被有 利地改寫，其中重點放在熒光發射與熒光團濃度之間的關系上，而不是常規PCR系統中的透 射光與染料濃度之間的關系上。包括等式1到8的去卷積算法是基于NMF方法，其明顯比許多 常規PCR系統所使用的標準線性去卷積方法更直觀，因為NMF在每一熒光團非負面地構成總 體熒光強度的約束下運轉。另外，與常規方法相比，NMF在檢測低熒光信號方面更有效。 [0076] NMF先前已被用于組織學圖像中的高達最大兩次染色的盲法顏色去卷積，但是根 據本發明的該實施方案，熒光圖像需要被去卷積成三個熒光團分量。因此，NMF去卷積算法 已經有利地經過修改，從而引入訓練階段和測試階段，借此在訓練階段中使用NMF以確定去 卷積矩陣(等式5到7)，此后在測試階段中使用矩陣對熒光團分量進行定量。與線性顏色去 卷積相比，NMF在算法上更為復雜并且是迭代的。然而，根據本發明的該實施方案的PCR系統 100中使用的NMF版本已經有利地經過修改，從而實現收斂并且最小化迭代次數。雖然在本 發明的前述【具體實施方式】中已經呈現了示例性實施方案，但是應了解存在大量的變化形 式。
[0077]應進一步了解，示例性實施方案僅是示例，并不旨在以任何方式限制本發明的范 圍、適用性、操作或配置。事實上，前述【具體實施方式】將向所屬領域的技術人員提供關于實 施本發明的示例性實施方案的便利的路線圖，應理解在示例性實施方案中描述的元件的功 能和配置以及操作方法可以進行各種改變而不會脫離如隨附權利要求書中所述的本發明 的范圍。
【主權項】
1. 一種復用聚合酶鏈式反應(PCR)DNA檢測系統，其包括： 彩色電荷耦合器件(CCD)相機； 熒光團-猝滅劑探針，所述熒光團-猝滅劑探針被選擇響應于由所述熒光團-猝滅劑探 針所猝滅的、對應于三種選定的原色和所述CCD相機的峰值通道響應的熒光團，使得所述熒 光團的發射譜基本上匹配所述三種選定的原色，并且所述熒光團的峰值發射譜對應于所述 C⑶相機的峰值RGB通道響應；以及 用于定位DNA樣品和所述熒光團-猝滅劑探針的成像室， 其中所述彩色CCD相機聚焦于所述成像室以便從所述DNA樣品和所述熒光團-猝滅劑探 針的熒光同時檢測最多三個標靶。2. 根據權利要求1所述的復用PCR DNA檢測系統，其進一步包括光學濾光裝置，所述光 學濾光裝置包括完全多波段激發、發射和二向色濾光片，所述熒光團-猝滅劑探針進一步被 選擇響應于對應于所述完全多波段濾光片的帶寬的所述熒光團的激發譜。3. 根據權利要求2所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述熒光團-猝滅劑探針被選擇 進一步響應于對應于所述完全多波段濾光片的帶寬的所述熒光團的發射譜。4. 根據權利要求2或權利要求3所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述完全多波段濾 光片包括三波段激發濾光片。5. 根據權利要求1至4中任一項所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述成像室是不透 光的成像室，所述系統進一步包括用于將激發光提供給所述成像室中的所述樣品和所述熒 光團-猝滅劑探針的光源。6. 根據權利要求5所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述光源包括由電池供電的光 源。7. 根據權利要求5或權利要求6所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述光源包括發射 在紫外到可見電磁光譜中的光的寬帶UV-可見光源。8. 根據權利要求7所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述寬帶UV-可見光源選自包括 汞光源、氙光源和LED光源的組。9. 根據權利要求5至8中任一項所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述光源包括光纖 光傳輸裝置，所述光纖光傳輸裝置用于對所述成像室中的所述樣品和所述熒光團-猝滅劑 探針提供所述激發光。10. 根據權利要求1至9中任一項所述的復用PCR DNA檢測系統，其進一步包括耦合至所 述CCD相機的計算裝置，所述計算裝置用于響應于將來自所述DNA樣品的熒光解析成其熒光 團分量而檢測所述成像室中的所述最多三個標靶，所述檢測是通過所述計算裝置對來自所 述成像室的未猝滅的熒光團激發發射的被所述CCD相機捕獲的圖像像素執行基于顏色的去 卷積方法來進行的。11. 根據權利要求10所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述基于顏色的去卷積方法包 括基于非負矩陣分解(NMF)的顏色去卷積方法。12. 根據權利要求10或權利要求11所述的復用PCR DNA檢測系統，其中所述基于顏色的 去卷積方法是響應于將所述系統用于使用預定標靶的復用PCR反應的多個訓練階段和測試 階段而導出的。13. -種用于在包括電荷耦合器件(CCD)相機的系統中的聚合酶鏈式反應(PCR)檢測的 方法，所述方法包括： 用熒光團-猝滅劑探針光學復用最多三個標靶，所述熒光團-猝滅劑探針被選擇響應于 由所述熒光團-猝滅劑探針所猝滅的、對應于三種選定的原色和所述CCD相機的峰值通道響 應的熒光團，使得所述熒光團的發射譜基本上匹配所述三種選定的原色，并且所述熒光團 的峰值發射譜對應于所述CCD相機的峰值RGB通道響應。14. 根據權利要求13所述的方法，其中所述系統進一步包括三波段激發濾光片，并且其 中光學復用所述最多三個標靶的步驟進一步包括通過所述熒光團-猝滅劑探針光學復用所 述最多三個標靶，所述熒光團-猝滅劑探針進一步被選擇響應于對應于所述三波段激發濾 光片的帶寬的所述熒光團的激發譜。15. 根據權利要求14所述的方法，其中光學復用所述最多三個標靶的步驟進一步包括 通過所述熒光團-猝滅劑探針光學復用所述最多三個標靶，所述熒光團-猝滅劑探針進一步 被選擇響應于也對應于所述三波段激發濾光片的帶寬的所述熒光團的發射譜。16. 根據權利要求13至15中任一項所述的方法，其中所述熒光團的所述峰值發射譜對 應于選自包括Alexa405、FAM和Cy5、Alexa 488和德克薩斯紅的組的發射譜。17. 根據權利要求13至16中任一項所述的方法，其進一步包括使用基于非負矩陣分解 (NMF)的顏色去卷積方法確定所述最多三個標靶的最多三個組成熒光團的步驟。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述基于NMF的顏色去卷積方法是響應于包括使 用預定標靶的復用PCR反應的多個訓練階段和測試階段而導出的。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960466SQ201480068082
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年10月14日
【發明人】應儀如, S·K·庫馬拉薩米
【申請人】新加坡科技研究局