依賴mert-lamp技術檢測糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的核苷酸序列的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一組用于MERT?LAMP擴增的引物序列，其中包括分別針對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的引物F3、B3、EFIP、BIP、LF和LB，在每個EFIP引物的5’端各標記有一個彼此不同的熒光基團，并在所述引物的其它位置標記有一熒光猝滅基團。本發明還公開了上述引物在糞腸球菌和金黃色葡萄球菌檢測中的應用。該應用實現了一步法多重恒溫檢測，操作簡便、特異性強、靈敏度高、檢測速度快。
【專利說明】
依賴MERT-LAMP技術檢測糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的核苷 酸序列
技術領域
[0001 ]本發明涉及MERT-LAMP技術（Multiple Endonuclease Restriction Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification)在細菌檢測中的應用，特別是在奠腸球菌和 金黃色葡萄球菌鑒別檢測中的應用，屬于分子生物學和微生物學領域。
【背景技術】
[0002] 奠腸球菌(Enterococcus faecalis;E.faecalis)是革蘭氏陽性，過氧化氫陰性球 菌，是人和動物腸道內主要菌群之一。該菌是內源性和外源性醫院感染的第二大病原菌，檢 出率僅次于大腸桿菌。在引起尿路感染的致病菌中，糞腸球菌感染居第2位;腹腔、盆腔感 染，糞腸球菌居第3位;敗血癥，糞腸球菌居第3位，病死率12.6 %~57 %。金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ; S . aureus)是人類的一種重要病原體，隸屬于葡萄球菌屬 (Staphylococcus aureus; S.aureus)。金黃色葡萄球菌在自然界中無處不在，空氣、水、灰 塵及人和動物的排泄物中都可找到。因此，該菌極易造成食品污染。此外，根據世界衛生組 織的報告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第二位，僅次于大腸桿菌。該菌是人類化膿感染 中最常見的病原菌，可引起局部化膿感染，也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血 癥、膿毒癥等全身感染。此外，這兩種病原體也是重癥加強護理病房最常見的病原菌，從而 受到全球衛生部門的高度關注，成為各國的重大公共衛生問題。因此，為了給予臨床病人準 確快速的治療，醫院感染的控制以及兩種病原體的流行病學調查，研發一個省時、省力和特 異性較高的檢測方法，能夠同時檢測和鑒定兩種病原體成為必要。
[0003] 目前對于糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的檢測主要依賴于傳統的分離培養和生化 鑒定，該方法耗時大約5到7天，包括增菌，選擇培養及后續的生化鑒定，該檢測過程耗時耗 力。此外，生化結果的判讀依賴于操作者的主觀判斷，從而導致結果重復差，易錯判。隨著核 酸檢測技術的快速發展，一些以PCR為基礎的檢測技術(如普通PCR技術，實時熒光PCR技術） 被用于糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的快速檢測，然而這些方法依賴于昂貴的熱循環儀器， 需要后續的電泳操作，昂貴的探針合成，以及熟練的操作人員。因此，以PCR為基礎的技術對 于一些落后的實驗室無法進行，限制了這些技術的廣泛運用。此外，已經建立的用于檢測糞 腸球菌和金黃色葡萄球菌的PCR方法和實時熒光定量PCR方法，其檢測靈敏度差，檢測過程 耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。
[0004] 環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是由日 本科學家Notomi等建立的一種新的核酸特異性擴增技術，具有特異性強、靈敏高、操作簡 單、產物易檢測等優點。該技術已被廣泛用于分子檢測領域。LAMP針對靶序列的6個特異部 位設計4條核心引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件(60~65°C)下催化 新鏈合成，從而使革巴序列高效擴增。4條核心引物之中2條為內引物，即FIP(Forward inner primer，FIP)和BIP(Backward inner primer，BIP) eFIP包含FIc和F2(F2c區域的互補序 列），即Y-Flc-F2;BIP包含Blc(Bl區域的互補序列）和B2，即5~Blc-B2。其余兩條核心引物 為外引物F3和B3。另外的兩條環引物(Loop primes，LF和LB)被增加到反應體系中加速LAMP 反應。LAMP反應可以特異、高效、快速的擴增目的DNA，在1小時之內使產物的量達到109個拷 貝。
[0005] LAMP擴增之后，其產物的檢測可以通過瓊脂糖電泳后染色觀察。較為簡便的方法 是直接在產物中加入SYBR Green染色，呈現綠色為陽性反應，橙紅色為陰性反應。也可以通 過擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷，液體渾濁，離心后有白色沉淀的為陽性反應， 無此現象的則為陰性反應。現在更為簡單的方法是在反應混合物中加入可視染料，陽性反 應管的顏色從淺灰色變為綠色，陰性反應管則保持原來的淺灰色。然而，這些方法都只能檢 測LAMP反應是否進行，不能識別針對某一靶序列的特異性擴增，導致LAMP技術只能檢測單 一目的序列，限制了 LAMP技術的運用。
[0006] 為了克服傳統LAMP方法技術瓶頸，本發明人設計一種新的MERT-LAMP(Multiple Endonuclease Restriction Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification)擴 增技術。MERT-LAMP擴增技術以LAMP反應為基礎，結合限制性內切酶酶切原理和熒光檢測， 從而實現一步法多重恒溫檢測。該方法操作簡便、特異性強、靈敏性高、檢測速度快，因此在 微生物檢測領域有廣泛的應用前景。
[0007] 本發明針對糞腸球菌的特異基因 Ε??027基因和金黃色葡萄球菌的特異基因 nuc分 別設計兩套MERT-LAMP擴增引物，旨在建立針對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌病原體的快速、 敏感和特異的核酸檢測體系。
【發明內容】
[0008] 基于上述目的，本發明首先提供了一組用于MERT-LAMP擴增的引物序列，其特征在 于，所述序列包括：SEQIDN0 :l所示的引物Ef-F3，SEQIDN0:2所示的引物Ef-B3，SEQID N0 :4所示的引物Ef-EFIP，SEQIDN0:5所示的引物Ef-BIP，SEQIDN0:6所示的引物Ef-LF， SEQ ID N0:7所示的引物Ef-LB;和/或
[0009] SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll 所示的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID 從)：14所示的引物5&11-1^，
[0010] 其中，在引物Ef-EFIP和引物Sau-EFIP的5'端各標記有一個彼此不同的熒光基團， 并在所述引物的其它位置標記有一熒光猝滅基團。
[0011] 優選地，所述序列還包括SEQIDN0:3所示的引物Ef-FIP，和/或SEQIDN0:10所 示的引物Sau-FIP，FIP的使用為了提供更多的EFIP結合位點，從而形成更多的酶切末端。
[0012] 在一個優選的技術方案中，引物Ef-EFIP標記的熒光基團為HEX，所述Sau-EFIP標 記的熒光基團為Cy 5。
[0013] 更為優選地，所述引物Ef-EFIP標記的熒光猝滅基團為BHQ-1，所述Sau-EFIP標記 的熒光猝滅基團為BHQ-2。
[0014]最為優選地，所述引物Ef-EFIP的熒光猝滅基團標記位置位于5 '端第13位堿基，所 述引物Sau-EFIP的熒光猝滅基團標記位置位于5'端第11位堿基。
[0015]本發明還提供了上述的序列在糞腸球菌和/或金黃色葡萄球菌檢測中的應用，所 述檢測采用MERT-LAMP擴增技術。
[0016] 優選地，所述MERT-LAMP擴增的反應溫度為61~63°C。
[0017]在一個優選的技術方案中，所述應用采用單一樣本檢測模式，所使用的引物為：
[0018] SEQ ID N0:1 所示的引物Ef-F3，SEQ ID N0:2所示的引物Ef-B3，SEQ ID N0:4所示 的引物Ef-EFIP，SEQIDN0:5所示的引物Ef-BIP，SEQIDN0:6所示的引物Ef-LF，SEQID NO :7所示的引物Ef-LB;或
[0019] SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll 所示的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID 從)：14所示的引物5&11-1^。
[0020] 優選地，所述序列還包括SEQ ID N0:3所示的引物Ef-FIP，或SEQ ID NO: 10所示的 引物 Sau-FIP。
[0021] 在另一個優選的技術方案中，所述應用采用多重樣本檢測模式，所使用的引物為： [0022] SEQ ID N0:1 所示的引物Ef-F3，SEQ ID N0:2所示的引物Ef-B3，SEQ ID N0:4所示 的引物Ef-EFIP，SEQIDN0:5所示的引物Ef-BIP，SEQIDN0:6所示的引物Ef-LF，SEQID NO :7所示的引物Ef-LB;和
[0023] SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll 所示的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID 從)：14所示的引物5&11-1^。
[0024] 優選地，所述序列還包括SEQ ID N0:3所示的引物Ef-FIP，和SEQ ID NO: 10所示的 引物 Sau-FIP。
[0025] 本發明應用上述引物通過MERT-LAMP能單獨分別檢測糞腸球菌和金黃色葡萄球 菌，而且也能一步同時準確的檢測和鑒別糞腸球菌和金黃色葡萄球菌，具有操作簡便、特異 性強、靈敏度高、檢測速度快的優點。檢測糞腸球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，且消 耗的最短檢測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分鐘。檢測 金黃色葡萄球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，且消耗的最短檢測時間大約為15分鐘， 檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分鐘。應用MERT-LAMP檢測多個靶序列時，其 檢測時間和檢測靈敏度與單序列檢測沒有質的變化，最短的檢測時間為15分鐘左右。本發 明應用上述引物通過MERT-LAMP能同時準確地檢測和鑒別糞腸球菌和金黃色葡萄球菌，對 27株糞腸球菌和12株金黃色葡萄球菌的檢測均為陽性，73株非糞腸球菌、非金黃色葡萄球 菌不出現陽性結果，顯示了良好的特異性。
【附圖說明】
[0026] 圖1 MERT-LAMP引物設計示意圖；
[0027] 圖2 MERT-LAMP引物的可行性驗證結果圖譜；
[0028]圖3 MERT-LAMP引物的最佳溫度測定圖譜；
[0029] 圖4 MERT-LAMP單一檢測敏感度測定圖譜；
[0030]圖5普通LAMP單一檢測敏感度測定圖譜；
[0031] 圖6多重MERT-LAMP多重檢測敏感度測定圖譜；
[0032] 圖7 MERT-LAMP方法的特異性評價圖譜。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的保護范圍構成任何限制。
[0034] 本發明的目的在于提供一種能夠應用細菌檢測，特別是恒溫技術的檢測序列，更 進一步提供MERT-LAMP擴增技術檢測糞腸球菌和金黃色葡萄球菌方法，以及應用于該方法 的試劑盒。
[0035] 根據奠腸球菌（E · faecalis)的特異基因 Ef0027(GenBank access ion 1198935)和 金黃色葡萄球（S.aureus)的特異性基因 nuc(GenBank accession EF529597)設計兩套分別 針對糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的MERT-LAMP擴增引物。Ε??027基因存在于所有的糞腸球 菌中，其特異性好，可以將糞腸球菌與其他密切相近的菌種和菌屬區分開。nuc基因存在于 所有的金黃色葡萄球菌中，其特異性好，可以將金黃色葡萄球菌與其他密切相近的菌種和 菌屬區分開。利用多序列比對軟件ClustalX 1.83和引物設計軟件Primer Premier 5.0設 計MERT-LAMP擴增引物，并將獲得的特異性引物在NCBI數據庫中進行序列比對分析，以排除 引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配，最終獲得優化后的兩套MERT-LAMP擴增引 物。引物設計的位置和方向見圖1，圖1A為針對糞腸球菌特異基因 Ε??027設計MERT-LAMP引 物。圖1B為針對金黃色葡萄球菌特異基因 nuc基因設計MERT-LAMP引物。序列見表1。
[0036] 表1. MERT-LAMP引物設計及修飾
[0039] Ef,糞腸球菌（E.faecalis);
[0040] Sau,金黃色葡萄球菌（S. aureus);
[0041 ] mer,寡聚體單元；
[0042] 拉，核苷酸·
[0043] 其中，Ef-EFIP(SEQIDN0.4)標記有熒光基團HEX(六氯-6-甲基熒光素）和淬滅基 團BHQ_l(Blackhole quencher 1，焚光淬滅劑1)，具體標記位置為：
[0044] HEX-TGCAATG-TGGCTT(BHQ-1)CATCCATTTGTTGAAAACTTTTCAAGCTATTACGCAACAGT
[0045] Sau-EFIP(SEQ ID N0.11)標記有熒光基團Cy5(Cy5熒光素）和淬滅基團fflQ-2 (Blackhole quencher 2,熒光淬滅劑2)，具體標記位置為：Cy5-TGCAATG-CGTT(fflQ2) TACCATTTTTCCATCAGCATAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACT
[0046] 本發明中所使用和涉及的試劑：
[0047] Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.，Tokyo,Japan)購于日本榮研公司。DNA提 取試劑盒（QIAamp DNA minikits;Qiagen,Hilden,Germany)購于德國Qiagen公司。qPCR反 應體系混合物（SYBR〇R Premix Ex Taq?I I, Takara Bio, Inc·, Otsu, Japan，dNTP 和緩沖 液)購于北京Takara生物科技有限公司。PCR反應體系混合物Mix(Taq DNA聚合酶，dNTP和緩 沖液)購于北京康為世紀生物科技有限公司。DL50DNA Marker和DL50DNA Marker購于寶生 物工程(大連)有限公司。其余試劑均為市售分型純產品。
[0048] 本發明實驗中使用和涉及的主要儀器：Loopamp實時濁度儀LA-320C(Eiken Chemical Co·,Ltd,Japan)購于日本榮研公司。實時焚光檢測儀為Rotor-Gene Q Real-Time System(Qiagen),德國Qiagen產品；電泳設備為北京君意東方電泳設備有限公司產 品；PCR儀為Sensoquest Labcycler,德國Sensoquest產品；凝膠成像系統為Bio-Rad Gel Dox XR,美國Bio-Rad產品。
[0049] 實驗過程，糞腸球菌和金黃色葡萄球菌及其他種類菌(菌株見表2)的基因組DNA的 提取如下步驟操作：
[0050] 細菌基因組的提取使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒（QIAamp DNA minikits; Qiagen，Hi lden，Germany)，按照說明書進行操作。利用紫外分光光度計測定基因組DNA的濃 度和純度，糞腸球菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA用GE緩沖液連續稀釋（從2.5ng，250pg， 25pg，2 · 5pg，250fg，25fg到2 · 5fg)。各種基因組DNA均少量分裝，-20°C保存備用。
[0051 ] 表2.細菌菌株信息
[0054] a U，未鑒定的血清型·
[0055] b ATCC，美國菌種保藏中心;I⑶C，中國疾病預防控制中心傳染病所.
[0056] 實施例 1. MERT-LAMP反應
[0057] 1. MERT-LAMP標準反應體系：引物EFIP和FIP的濃度各為20pmol，引物BIP的濃度 為40pmol或引物BIP、EBIP的濃度各為20pmol，引物F3和B3的濃度為5pmol，引物LF和BF的濃 度為20pmol，10mM的Betain，6mM的MgS(k，ImM的dNTP，2.5yL的 10 X Bst DNA聚合酶緩沖液， 8U的鏈置換DNA聚合酶，15U的DNA限制性內切酶，lyL的模板，補加去離子水至25μ1。整個反 應在焚光檢測儀（Rotor-Gene Q Real Time System，Qiagen)中進行，等溫擴增63~65°C lh，80°C5min終止反應。
[0058] 2.該技術的可行性驗證
[0059] 標準體系用于驗證MERT-LAMP引物的可行性，在標準體系條件下，加入一套MERT- LAMP引物和對應的DNA模板，通過可視顏色變化法、電泳檢測法和熒光檢測方法證實MERT-LAMP技術可行。
[0060] 可視顏色變化法:MERT-LAMP在合成DNA的同時還產生大量的焦磷酸根離子，該離 子能夠奪取與鈣黃綠素結合的錳離子，使鈣黃綠素恢復游離狀態而發熒光。該發光混合物 能夠與反應中產生的鎂離子結合，使熒光得到增強。可以通過熒光目視檢測顏色變化判讀 結果，陽性反應管從淺灰色變為綠色，陰性反應保持淺灰色不變，見圖2A和圖2B。
[0061 ]圖2A和圖2B為可視熒光染料法分析MERT-LAMP產物。陽性結果呈現綠色，陰性結果 保持顏色不變，呈現淺灰色。圖2A為針對糞腸球菌的檢測，圖2B為針對金黃色葡萄球菌的檢 測。
[0062]電泳檢測法：由于MERT-LAMP反應與LAMP反應相似，其產物也是一系列反向重復的 靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現不同 大小區帶組成的階梯式圖譜，可以根據片段大小進行判定，見圖2C和2D。
[0063]圖2C和圖2D為電泳檢測分析MERT-LAMP產物。陽性結果呈現特異的階梯條帶，陰性 結果不出現任何的電泳條帶。圖2C為針對糞腸球菌的檢測，圖2D為針對金黃色葡萄球菌的 檢測。
[0064]實時熒光檢測法:標準體系條件下，在反應管中加入一套引物和對應的模板，酶切 后產生的熒光通過熒光檢測器接收，得到穩定的熒光曲線，結果參見圖4。
[0065] 3. MERT-LAMP技術的最佳反應溫度測定
[0066]在標準體系條件下，加入糞腸球菌，金黃色葡萄球菌MERT-LAMP引物和糞腸球菌及 金黃色葡萄球菌的DNA模板，其模板濃度為250pgAU。反應在恒溫條件下進行(60~67°C)， 結果運用實時濁度儀進行檢測，在不同的溫度下得到兩組不同的動態曲線圖，見圖3A和圖 3B。圖3A和圖3B中，應用實時濁度法測定兩套引物的最佳擴增溫度。圖3A:針對糞腸球菌特 異基因 Ε??027設計MERT-LAMP引物的溫度檢測，A1-A8代表該套引物在60~67°C條件下的實 時濁度擴增。圖3B:針對金黃色葡萄球菌特異基因 nuc設計MERT-LAMP引物的溫度檢測，BIBS 代表該套引物在 60 ~ 67°C 條件下的實時濁度擴增。 61 ~ 63°C 被推薦作為 MERT-LAMP 技術 的最佳反應溫度。
[0067] 4. MERT-LAMP檢測單一樣本的靈敏度
[0068]在標準體系條件下，倍比稀釋基因組模板DAN( 2 · 5ng，250pg，25pg，2 · 5pg，250fg， 25fg到2.5fg/微升），1微升各濃度模板加入反應體系中，通過實時熒光檢測，得到穩定的熒 光檢測圖形，見圖4。其中，圖4A:MERT-LAMP技術單獨對糞腸球菌的敏感度檢測，結果通過實 時熒光分析。圖4B:MERT-LAMP技術單獨對金黃色葡萄球菌的敏感度檢測，結果通過實時熒 光分析。
[0069] MERT-LAMP檢測單一靶序列，對糞腸球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，且消耗 的最短檢測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分鐘。當反應 體系中基因組模板量降低至250fg以下時，MERT-LAMP反應不出現陽性擴增，見圖4A。
[0070] MERT-LAMP檢測單一靶序列，對金黃色葡萄球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管， 且消耗的最短檢測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分鐘。 當反應體系中基因組模板量降低至250fg以下時，MERT-LAMP反應不出現陽性擴增，見圖4B。
[0071] 5. MERT-LAMP檢測特異性評價：
[0072]以常見的致病菌及條件致病菌DNA (糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌、 霍亂弧菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、單增李斯特菌、伊氏李斯特菌、蠟樣芽胞桿菌、腸致病性 大腸桿菌、腸產毒性大腸桿菌、腸侵襲性大腸桿菌等)為模板評價MERT-LAMP反應體系的特 異性，菌株信息見表2 JERT-LAMP擴增技術能同時準確的檢測和鑒別糞腸球菌和金黃色葡 萄菌，非糞腸球菌，非金黃色葡萄球菌不出現陽性結果，說明MERT-LAMP方法的特異性良好， 見圖7。圖7A，檢測信號1-4來自于糞腸球菌基因組模板擴增(Hex通道）。圖7B，信號5-9來自 于金黃色葡萄球菌基因組模板擴增(Cy5通道）。反應10-35為非金黃色葡萄球菌、非糞腸球 菌，反應36為陰性控制。結果表明，MERT-LAMP能夠正確的檢測靶序列，并通過熒光信號將不 同靶序列鑒別開。
[0073] 實施例2. MERT-LAMP多重反應
[0074] 1. MERT-LAMP的反應體系如下：
[0075] 引物Ef-EFIP和FIP的濃度各為12.5pmol，引物Ef-BIP的濃度為25pmol,引物Ef-LF 和Ef-LB的濃度為 12.5pmol，引物Ef-F3和Ef-B3的濃度為lOpmol;引物Sau-EFIP、Sau-FIP的 濃度各為20pmol，引物Sau-BIP的濃度為40pmol，引物Sau-LF和Sau-LB的濃度為20pmol，弓丨 物5&1143和5&11-83的濃度為1(^111〇1 ;1〇1111的86七3丨11，6111]\1的]\%5〇4，1111]\1的(1犯13，12.5以1^的10\ Bst DNA聚合酶緩沖液，8U的鏈置換DNA聚合酶，15U的DNA限制性內切酶，lyL的模板，補加去 離子水至25μ1。整個反應在焚光檢測儀（Rotor-Gene Q Real Time System，Qiagen)中進 行，等溫擴增63~65°(：111，801€51^11終止反應。
[0076] 2. MERT-LAMP的多重檢測能力驗證
[0077] 為了得到穩定的多重熒光檢測圖形，對標準體系進行優化適應多重檢測，建立多 重檢測體系。在多重反應混合物中同時加入兩套引物及對應的模板（倍比稀釋模板DAN 2 · 5ng，250pg，25pg，2 · 5pg，250fg，25fg和2 · 5fg/微升，1 微升各濃度模板加入多重MERT-LAMP反應體系中）。通過熒光檢測器檢測，得到穩定的多重熒光檢測圖，見圖6。其中，圖6A檢 測信號來自于糞腸球菌基因組模板擴增(Hex通道）。圖6B信號來自于金黃色葡萄球菌基因 組模板擴增(Cy5通道KMERT-LAMP反應體系能夠同時進行糞腸球菌和金黃色葡萄球菌的檢 測，證明了MERT-LAMP技術的多重檢測能力，應用MERT-LAMP檢測多個靶序列時，其檢測時間 和檢測靈敏度與單序列檢測沒有質的變化，最短的檢測時間為15分鐘左右。
[0078] 3. MERT-LAMP靈敏度驗證
[0079] 多重MERT-LAMP同時檢測多個靶序列時，糞腸球菌的檢測下限為250fg DNA/反應 管，且消耗的最短檢測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分 鐘。當反應體系中基因組模板量降低至250fg以下時，MERT-LAMP反應不出現陽性擴增，見圖 6A。金黃色葡萄球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，且消耗的最短檢測時間大約為15分 鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約35分鐘。當反應體系中基因組模板量降低至 250fg以下時，MERT-LAMP反應不出現陽性擴增，見圖6B。
[0080] 對照實施例1. LAMP標準反應體系，
[00811 LAMP的反應體系如下：引物FIP的濃度各為40pmol，引物BIP的濃度為40pmol，引物 F3和B3的濃度為5pmol，引物LF和BF的濃度為20pmol，10mM的Betain，6mM的MgS04，lmM的 dNTP，2.5yL的10 X Bst DNA聚合酶緩沖液，8U的鏈置換DNA聚合酶，15U的DNA限制性內切酶， lyL的模板，補加去離子水至25μ1。整個反應在焚光檢測儀（Rotor-Gene Q Real Time System，Qiagen)中進行，等溫擴增61~63 °C lh，80 °C 5min終止反應。
[0082]在標準LAMP體系條件下，倍比稀釋模板DAN(2 · 5ng，250pg，25pg，2 · 5pg，250fg， 25fg和2.5fg/微升），1微升各濃度模板加入反應體系中，通過實時濁度檢測，得到穩定的實 時濁度檢測圖形，見圖5。其中，圖5A為LAMP技術單獨對糞腸球菌的敏感度檢測，結果通過實 時濁度分析。圖5B為LAMP技術單獨對金黃色葡萄球菌的敏感度檢測，結果通過實時濁度分 析。
[0083] LAMP檢測單一靶序列，奠腸球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，消耗的最短檢 測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約30分鐘。當反應體系中基 因組模板量降低至250fg以下時，LAMP反應不出現陽性擴增，見圖5A。
[0084] LAMP檢測單一靶序列，金黃色葡萄球菌的檢測下限為250fg DNA/反應管，消耗的 最短檢測時間大約為15分鐘，檢測最低檢測限水平的DNA也僅僅消耗大約30分鐘。當反應體 系中基因組模板量降低至250fg以下時，LAMP反應不出現陽性擴增，見圖5B。
[0085] 對照實施例2. Real-time RCR方法反應體系
[0088] 其中，上游引物序列為SEQ ID No.l/SEQ ID No.8(Ef-F3/SauF3)，下游引物序列 為SEQ ID N0:2/SEQ ID No.9(Ef-B3/SauB3)。
[0089] 在實時熒光定量PCR儀上擴增并測定結果：
[0091 ]在焚光檢測儀（Rotor-Gene Q Real Time System，Qiagen)中進行Real-time反 應，擴增結束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數據，確定該反應的CUcycle threshold)值。
[0092]在標準的qPCR反應條件下，倍比稀釋模板DAN(2 · 5ng，250pg，25pg，2 · 5pg，250fg， 25fg和2.5fg/微升），1微升各濃度模板加入qPCR反應體系中，通過實時熒光檢測，得到穩定 的實時熒光檢測圖形，見表3WPCR檢測單一靶序列，糞腸球菌的檢測下限為2.5pg DNA/反 應管，當反應體系中基因組模板量降低至2.5pg以下時，qPCR反應不出現陽性擴增，見表3。 qPCR檢測單一靶序列，金黃色葡萄球菌的檢測下限為2.5pg DNA/反應管，當反應體系中基 因組模板量降低至2.5pg以下時，qPCR反應不出現陽性擴增，見表3。
[0093] 普通RCR反應體系：
[0097]反應結束后，去10μ1 PCR產物在2.5 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，并在凝膠成像系 統上觀察分析結果。
[0098]在標準的PCR反應條件下，倍比稀釋模板DAN(2 · 5ng，250pg，25pg，2 · 5pg，250fg， 25fg和2.5fg/微升），1微升各濃度模板加入PCR反應體系中，PCR檢測單一靶序列，糞腸球菌 的檢測下限為25pg DNA/反應管，當反應體系中基因組模板量降低至25pg以下時，PCR反應 不出現陽性擴增，見表3^CR檢測單一靶序列，金黃色葡萄球菌的檢測下限為25pg DNA/反 應管，當反應體系中基因組模板量降低至25pg以下時，PCR反應不出現陽性擴增，見表3。 [0099]表3.幾種方法的敏感度比較 [0100]
[0101] a MERT-LAMP,multiple endonuclease restriction real-time loop-mediated i so therma 1 amplification(實時多重環介導恒溫擴增）；LAMP , loop-mediated isothermal amplification(環介導恒溫擴增）；qPCR,quantitative real-time PCR(定量 PCR方法）.
[0102] b檢出限：LoD(limit of detection)。
【主權項】
1. 一組用于MERT-LAMP擴增的引物序列，其特征在于，所述序列包括:SEQ ID N0:1所示 的引物Ef-F3, SEQ ID NO: 2所示的引物Ef-B3, SEQ ID NO:4所示的引物Ef-EFIP，SEQ ID NO:5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID NO:6所示的引物Ef-LF，SEQ ID NO:7所示的引物Ef-LB; 和/或 SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll所示 的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO: 14所示的引物Sau-LB， 其中，在引物Ef-EFIP和引物Sau-EFIP的5 '端各標記有一個彼此不同的熒光基團，并在 所述引物的其它位置標記有一熒光猝滅基團。2. 根據權利要求1所述的序列，其特征在于，所述序列還包括SEQ ID N0:3所示的引物 Ef-FIP，和/或SEQ ID從)：10所示的引物5&11-卩1?。3. 根據權利要求1所述的序列，其特征在于，引物Ef-EFIP標記的熒光基團為HEX，所述 Sau-EFIP標記的熒光基團為Cy 5。4. 根據權利要求3所述的序列，其特征在于，所述引物Ef-EFIP標記的熒光猝滅基團為 BHQ-I，所述Sau-EFIP標記的熒光猝滅基團為BHQ-2。5. 根據權利要求4所述的序列，其特征在于，所述引物Ef-EFIP的熒光猝滅基團標記位 置位于5'端第13位堿基，所述引物Sau-EFIP的熒光猝滅基團標記位置位于5'端第11位堿 基。6. 根據權利要求1-5中任一所述的序列在糞腸球菌和/或金黃色葡萄球菌檢測中的應 用，所述檢測采用MERT-LAMP擴增技術。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述MERT-LAMP擴增的反應溫度為61~63 cC。8. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用采用單一樣本檢測模式，所使用 的引物為： SEQ ID N0:1所示的引物Ef-F3，SEQ ID N0:2所示的引物Ef-B3，SEQ ID N0:4所示的引 物Ef-EFIP，SEQ ID N0:5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID N0:6所示的引物Ef-LF，SEQ ID N0:7 所示的引物Ef-LB;或 SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll所示 的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO: 14所示的引物Sau-LB。9. 根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述序列還包括SEQ ID N0:3所示的引物 Ef-FIP，或SEQ ID從)：10所示的引物5&11-卩1?。10. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用采用多重樣本檢測模式，所使用 的引物為： SEQ ID N0:1所示的引物Ef-F3，SEQ ID N0:2所示的引物Ef-B3，SEQ ID N0:4所示的引 物Ef-EFIP，SEQ ID N0:5所示的引物Ef-BIP，SEQ ID N0:6所示的引物Ef-LF，SEQ ID N0:7 所示的引物Ef-LB;和 SEQIDN0:8所示的引物Sau-F3，SEQIDN0:9所示的引物Sau-B3，SEQIDN0 :ll所示 的引物Sau-EFIP，SEQIDN0:12所示的引物Sau-BIP，SEQIDN0:13所示的引物Sau-LF，SEQ ID NO: 14所示的引物Sau-LB。11.根據權利要求10所述的應用，其特征在于，所述序列還包括SEQ ID N0:3所示的引 物Ef-FIP，和SEQ ID從)：10所示的引物5&11-卩1?。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950778SQ201610576270
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月20日
【發明人】葉長蕓, 王毅, 王艷
【申請人】中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所