一種檢測npm1基因突變分型的試劑盒的制作方法

一種檢測npm1基因突變分型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測NPM1基因突變分型的試劑盒，包括RT?PCR反應液、引物探針混合液、RT?PCR反應酶系、DEPC H2O以及分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。由于本試劑盒應用一步法實時熒光PCR反應模式，并對特異性探針進行LNA修飾，能超敏快速檢測急性髓性白血病患者骨髓及外周血樣本中的NPM1基因12外顯子突變，最低檢出量為0.2ng，同時根據不同通道信號值可對A型、B型、D型突變進行分型，同時加入內標控制系統可檢測樣本提取效果，可廣泛應用于急性髓性白血病化療效果的預估。
【專利說明】
一種檢測NPM1基因突變分型的試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種檢測NPM1基因突變核酸的超敏分型試劑盒，特別是涉及一種利用 多重實時熒光聚合酶鏈式反應技術及鎖核酸修飾探針一管反應即可同時檢測NPM1基因突 變A型、B型、D型的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)是起源于造血干/祖細胞的 惡性克隆性血液疾病，以骨髓與外周血中原始和幼稚髓性細胞異常增生為主要特征，臨床 以低熱、代謝異常貧血、出血、感染和臟器的白血病細胞浸潤為主要特點。流行病學調查顯 示，AML是最常見的成人急性白血病，年發生率為3/100000左右。核仁磷酸蛋白 (nucleophosmin，NPM1)是位于核仁顆粒區的主要蛋白分子之一，定位于第5號染色體長臂 上(5q35)，廣泛地表達于各種類型的細胞。NPM1高表達于增殖活躍的細胞包括腫瘤細胞和 干細胞，在腫瘤形成過程中發揮重要作用。NPM1突變，目前已發現約50余種變異體，最常見 的類型為12號外顯子發生四個堿基的重復導致蛋白C端結構改變，最頻繁的為突變A，占 77%-80%病例，在野生型NPM1核苷酸序列的956~959位置上插入TCTG四個核苷酸重復構 成。此外，突變B、D分別占10%、5%，分別是在相同的基因位點插入CATG、CCTG四個核苷酸。
[0003] 根據美國國立綜合癌癥網絡(National Comprehensive Cancer Network)2016年 發補的NCCN臨床實踐指南：急性髓性白血病(2016. VI)中明確顯示NPM1突變是預后良好的 指標，并不能受益于異基因造血干細胞移植。因此對NPM1突變的檢測是明確AML病患是否進 行骨髓移植的重要決定因素。
[0004] 目前檢測NPM1突變的方法包括：Sanger測序法、CAPs法、RT-qPCR等。Sanger測序法 又稱一代測序法，應用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑(雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚 合酶延伸鏈所需要的3-OH基團，所以可被用作鏈終止試劑)通過聚合酶的引物延伸產生一 系列大小不同的分子后再進行分離的方法，是為核酸檢測的金標準，但其缺點也較為明確： 靈敏度低、操作繁瑣、容易污染。CAPs又稱限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應，基本原理 是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠 電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶，此 方法不需要成本較低且判讀簡單，但操作繁瑣且靈敏度低。RT-qPCR又稱一步法逆轉錄熒光 定量PCR法，將逆轉錄與熒光定量PCR通過溫度的調整達到一步完成的技術，操作過程閉管 進行，不會造成樣本污染，同時檢測靈敏度高，應用范圍廣，但檢測位點需明確突變類型。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種利用多重實時熒光聚合酶鏈式反應技術對NPM1基因 突變進行分型的高靈敏度試劑盒，利用本試劑盒可以準確檢測NPM1基因 A型、B型、D型突變。
[0006] 根據GenBank中的NPM1基因 A型、B型、D型突變基因序列，應用Primer Express3.0 軟件基因突變區設計特異性的引物及探針，并通過NCBI的BLAST功能對其特異性進行初步 鑒定。三條基因分型探針分別用FAM、TEXAS RED和CY5并加入了鎖核酸（Locked nucleic acid，LNA)修飾，增加了特異性及靈敏度，不同通道熒光標記可對檢測出的基因突變進行分 型，內標探針用HEX標記，可對樣本質量及提取效果進行監控。這些引物探針在含有耐熱DNA 聚合酶，逆轉錄酶、高質量脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)的RT-PCR反應酶系以及含有Mg2+等 成份的RT-PCR反應液中，通過熒光PCR儀實現體外核酸的循環擴增。
[0007] 本發明所涉及的試劑盒主要包括：1)RT-PCR反應液、引物探針混合液、RT-PCR反應 酶系、DEPC H20,陰性質控品、陽性質控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
[0008] 本發明的一個優選實施方案是引物探針混合液由NPM1基因特異性的正、反向引物 及特異性的突變分型探針組成，分型探針同時進行了 LNA修飾提高了靈敏度和特異性，NPM1 基因特異性的正向和反向引物的序列分別是5'-GGTGGTTCTCTTCCCAAAG-3'，5'_ CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3 ' ；突變A型特異性鎖核酸探針的序列是5 ' -CAAGATCTCTGT+CT +GGCAGTGG-3'，探針的5'和3'端分別結合有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQ1;突變B 型特異性鎖核酸探針的序列是5' -CAAGATCTCTGC+AT+GGCAGTGG-3'，探針的5 '和3'端分別結 合有熒光發生基團TEXASRED和熒光淬滅基團BHQ2;突變D型特異性鎖核酸探針的序列是5 '-CAAGATCTCTGC+CT+GGCAGTGG-3 '，探針的5'和3 '端分別結合有熒光發生基團CY5和熒光淬滅 基團B H Q 2 ;內標T B P基因特異性的正向和反向引物的序列分別是5'_ CTAAAGACCATTGCACTTCGT-3'，5'-ATCAGTGCCGTGGTTCGTG-3' ；內標ΤΒΡ基因特異性的探針序 列是5 ' -AATCCCAAGCGGTTTGCTGCGGTAA-3 '，探針的5'和3 '端分別結合有熒光發生基團HEX和 熒光淬滅基團BHQ1。（其中"+"表示對右側堿基進行LNA修飾）
[0009] 本發明的另一個優選實施方案是引物探針混合液中引物濃度為0.1~0.5ymol/L， 探針濃度為〇· 1~〇.25ymol/L。
[0010] 本發明的另一個優選實施方案是RT-PCR反應液由Tris-HCl(50mmol/L，pH8.0~ 8.8)、MgCl2(3 ~8mmol/L)、KCl(150 ~350mmol/L)組成。
[0011] 本發明的另一個優選實施方案是RT-PCR反應酶系由熱啟動Taq酶、逆轉錄酶、 dNTPs組成。熱啟動Taq酶、逆轉錄酶、dNTPs均可采用市售產品，如生工生物公司的產品，其 中每人份RT-PCR反應酶系中熱啟動Taq酶的用量為5~10U，逆轉錄酶用量為1.5~5U，dNTPs 用量為6~12mmol。
[0012] 本發明的一個優選實施方案是試劑盒提供了質控品，分別為陰性質控品和陽性質 控品。陰性質控品為滅菌純水，陽性質控品為人工合成的含有NPM1突變A型、B型、D型基因的 體外轉錄RNA。試劑盒中進行待檢標本檢測可同時進行兩種質控品的檢測，僅當陽性質控品 檢測時FAM、TEXAS RED、CY5、HEX通道熒光信號均呈陽性，陰性質控品檢測4個通道熒光信號 均呈陰性時，待檢標本的檢測結果才有效。
[0013] 本發明的一個優選實施方案是操作整個流程為使用核酸提取試劑盒提取全血或 骨髓樣本中的RNA;試劑盒PCR擴增的條件為:50°C 15分鐘，94°C 2分鐘；94°C 15秒，58°C 35秒，40個循環(退火時收集熒光信號）；PCR結果判斷通過各檢測通道Ct值確定，內標通道 的Ct值小于35的樣本的檢測結果視為有效，其他檢測通道Ct值小于37視為該通道檢測基因 突變型陽性。
[0014] 本發明的試劑盒擴增待檢標本由市售的熒光定量PCR儀自動完成，操作簡單，耗時 少，且最大限度地減少了污染的發生。準確檢測急性髓性白血病患者骨髓及外周血樣本中 的NPM1基因12外顯子突變，同時根據不同通道信號值可對A型、B型、D型突變進行分型，同時 加入內標控制系統可檢測樣本提取效果，可廣泛應用于急性髓性白血病化療效果的預估。
[0015] 本發明與現有技術相比優點為：①對NPM1突變進行分型檢測，可反映出樣本中 NPM1基因的突變具體型別，同時檢測靈敏度大大提升，可用于急性髓系白血病化療效果的 預估及微小殘留跟蹤;②分別針對NPM1基因 A型、B型、D型突變特異性序列設計專用引物、探 針，保證檢測的特異性和準確性，也具有較高通量，操作簡便、相對降低成本的優點;③一份 樣本同時對NPM1基因突變三種型別進行特異性檢測，檢測過程只需1.5h，相比一個樣本進 行3次檢測，大大減少了工作量，提高了檢測效率;相對于已有的核酸Sanger測序法，檢測所 需時間大大減少;④試劑采用陰陽性質控品作為質控，能夠對試劑的質量進行嚴格的把控； ⑤試劑采用RT-PCR反應液、引物探針混合液、RT-PCR反應酶系的大包裝設置，適合多種熒光 檢測設備，具有適用性更加廣泛的特點。
【附圖說明】
[0016] 圖1顯示NPM1基因 A型突變體外轉錄RNA的擴增曲線。圖中FAM通道的擴增曲線為S 型，說明試劑盒具有很好的線性相關性，且可以檢出〇. 2ng的濃度樣本。
[0017] 圖2顯示NPM1基因 B型突變體外轉錄RNA的擴增曲線。圖中TEXAS RED通道的擴增曲 線為S型，說明試劑盒具有很好的線性相關性，且可以檢出0.2ng的濃度樣本。
[0018] 圖3顯示NPM1基因 D型突變體外轉錄RNA的擴增曲線。圖中CY5通道的擴增曲線為S 型，說明試劑盒具有很好的線性相關性，且可以檢出〇. 2ng的濃度樣本。
[0019] 圖4顯示NPM1基因 A型突變樣本核酸的擴增曲線。圖中FAM和HEX通道的擴增曲線為 S型，TEXAS RED和CY5通道熒光信號均呈陰性。
[0020] 圖5顯示NPM1基因 B型突變樣本核酸的擴增曲線。圖中TEXAS RED和HEX通道的擴增 曲線為S型，FAM和CY5通道熒光信號均呈陰性。
[0021] 圖6顯示NPM1基因 D型突變樣本核酸的擴增曲線。圖中CY5和HEX通道的擴增曲線為 S型，FAM和TEXAS RED通道熒光信號均呈陰性。
[0022]圖7顯示試劑盒陰性質控品的擴增曲線。圖中沒有S型擴增曲線，說明FAM、TEXAS RED、CY5和HEX通道熒光信號均呈陰性。
[0023] 圖8顯示試劑盒陽性質控品的擴增曲線。圖中FAM、TEXAS RED、CY5和HEX通道的擴 增曲線為S型，說明該通道的熒光信號呈陽性。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。
[0025] 實施例1 NPM1基因突變分型的試劑盒的制備及其使用
[0026] 1、制備包括下列組成成分的試劑盒
[0027]引物探針混合液(25μ1/管）1管，RT-PCR反應液（125μ1/管），RT-PCR反應酶系（75μ 1/管）1管，陽性質控品（200μ1/管）1管，陰性質控品（200μ1/管）1管，DEPC Η20(2000μ1/管）1 管。
[0028] 2、樣本提取
[0029] 提取NPM1基因 A型突變的體外轉錄RNA，編號1號（0.2ng)、2號（2ng)、3號（20ng)、4 號（200ng)，NPMl基因 B型突變的體外轉錄RNA，編號5號（0.2ng)、6號（2ng)、7號（20ng)、8號 (2001^)，即11基因0型突變的體外轉錄8嫩，編號9號(0.21^)、10號（21^)、11號（20即）、12號 (200ng)，同時提取3例已經Sanger測序法確認的臨床樣本，編號13號(A型突變）、14號(B型 突變）、15號(D型突變），將以上15個樣本使用中山大學達安基因股份有限公司生產的核酸 提取試劑盒進行核酸提取。
[0030] 3、實時熒光定量PCR擴增及檢測 [0031] 3.1試劑準備：
[0032] 按比例取相應量的引物探針混合液ΙμL、RT-PCR反應液5μ1、RT-PCR反應酶系3μ1、 DEPC Η20 11μ1，充分混勻后備用。
[0033] 3.2 加樣：
[0034] 向PCR反應管中，分別加入陰、陽性質控品、樣本提取后核酸溶液5μ1，蓋緊管蓋，放 入儀器樣品槽。
[0035] 3.3 編輯(ABI Prism 7500熒光定量PCR儀）
[0036] 打開Setup窗口，按對應順序設置陰、陽性質控品和待測標本，并在Name欄中設置 樣品名稱。選中所有設置樣品孔，雙擊，選擇Add Detector，選擇Reporter為FAM和Quencher 為none，再選擇Reporter為HEX和Quencher為none ;再選擇Reporter為Texas Red和 Quencher為none ;然后選擇Reporter為Cy5和Quencher為none后關閉窗口。在Passive Reference中選擇(none)。打開instrument窗口設置循環條件:50°C 15分鐘，94°C 2分鐘； 94 °C 15秒，58 °C 35秒，40個循環。所有設置完成后保存文件，運行。
[0037] 3.4結果分析：
[0038]反應結束后保存檢測數據文件。在Results下打開Ampplot窗口。選擇分析的目的 樣品所在位置。將Base line數值改為start: 3，stop: 10，并打開manual設定Threshold: 1 · 5 ±100000。雙擊Rn坐標上數值打開Graph settings窗口，將Post Run Settings中Log改為 Linear，0K后打開Analysis preferences窗口，在Analysis菜單下選擇Analyze自動分析結 果。PCR結果判斷通過各檢測通道Ct值確定，內標通道的Ct值小于35的樣本的檢測結果視為 有效，其他檢測通道Ct值小于37視為該通道檢測基因突變型陽性。
[0039] 4、檢測結果
[0040] 對編號1、2、3號樣本，FAM通道有S型曲線，其他通道沒有曲線。對編號4、5、6號樣 本，TEXAS RED通道有S型曲線，其他通道沒有曲線。對編號7、8、9號樣本，CY5通道有S型曲 線，其他通道沒有曲線。對編號10號樣本，FAM、HEX通道有S型曲線，其他通道沒有曲線。對編 號11號樣本，TEXAS RED、HEX通道有S型曲線，其他通道沒有曲線。對編號12號樣本，CY5、HEX 通道有S型曲線，其他通道沒有曲線。本發明可以對NPM1基因突變進行分型，具有良好特異 性和較高的靈敏度，可以檢測低至〇. 2ng的樣本，證明本發明的方法是可行、準確、可靠的。
【主權項】
1. 一種檢測NPMl基因突變分型的試劑盒，包括：I )RT-PCR反應液、引物探針混合液、RT-PCR反應酶系、DEPC H20、陰性質控品、陽性質控品和2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的 包裝盒；其中引物探針混合液由NPMl突變A型、B型、D型基因特異性的引物、探針及內標組 成，分別如下： 1. NPM1基因特異性的正向和反向引物的序列分別是：5 ' -GGTGGTTCTCTTCCCAAAG-3 '和 5'-CTGTTACAGAAATGAAATAAGACG-3'； 2) 突變4型特異性鎖核酸探針的序列是5'-044641'(：1'〇^^+(^+66046166-3'，探針的5' 和3'端分別結合有熒光發生基團FAM和熒光淬滅基團BHQl; 3) 突變B型特異性鎖核酸探針的序列是5'-CAAGATCTCTGC+AT+GGCAGTGG-3'，探針的5' 和3'端分別結合有熒光發生基團TEXAS RED和熒光淬滅基團BHQ2; 4) 突變1)型特異性鎖核酸探針的序列是5'-(^4(^1'( ：1'(：1^〇(：1'+(^(^(^ (^-3'，探針的5' 和3 '端分別結合有熒光發生基團CY5和熒光淬滅基團BHQ2; 5) 內標TBP基因特異性的正向和反向引物的序列分別是5 ' -CTAAAGACCATTGCACTTCGT-3'，5'-ATCAGTGCCGTGGTTCGTG-3'； 6) 內標TBP基因特異性的探針序列是5 ' -AATCCCAAGCGGTTTGCTGCGGTAA-3 '，探針的5 '和 3 '端分別結合有熒光發生基團HEX和熒光淬滅基團BHQl。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于引物探針混合液中引物濃度均為0.1~ 0.5以111〇1/1，探針濃度均為0.1~0.25以111〇1/1。3. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于RT-PCR反應液由pH值為8.0~8.8的 50mmol/L Tris-HCl、3~8mmol/L MgCl2、150~350mmol/L KCl組成。4. 根據權利要求1所述的試劑盒，其中R T - P C R反應酶系由熱啟動T a q酶、逆轉錄酶、 dNTPs組成，特征在于每人份RT-PCR反應酶系中熱啟動Taq酶的用量為5~10U;逆轉錄酶用 量為 1.5 ~5U;dNTPs 為6 ~12mmol。5. 根據權利要求1的試劑盒，其特征在于陰性質控品為滅菌純水，陽性質控品為人工合 成的含有NPMl突變A型、B型、D型基因的體外轉錄RNA。6. 根據權利要求1的試劑盒，其特征還在于該試劑盒的使用包括以下步驟： 1) 樣本提取:使用核酸提取試劑盒提取全血或骨髓樣本中的RNA; 2. PCR擴增:條件為50 °C 15分鐘，94 °C 2分鐘;94 °C 15秒，58 °C 35秒，40個循環。 3) 檢測結果判定:PCR結果判斷通過各檢測通道Ct值確定，內標通道的Ct值小于35的樣 本的檢測結果視為有效，其他檢測通道Ct值小于37視為該通道檢測基因突變型陽性。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950775SQ201610549977
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月8日
【發明人】李明, 何皖平, 劉悅, 蔣析文, 高秀潔, 溫楚茵, 張文苑, 邱秋淳
【申請人】中山大學達安基因股份有限公司