一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，所述試劑盒含有Atg5、Atg7、BECN1、LC3、ALP、OC、CollengeΙ和OPG的引物對。本發明檢測靈敏度高，經過本發明試劑盒的檢測，驗證在成骨分化過程中自噬水平的變化，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
【專利說明】
一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發明屬于骨質疏松癥領域，特別涉及一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 骨的生長和發育與成骨細胞的功能密切相關。成骨細胞通過分泌大量的骨膠原和 骨基質，以及一些重要的細胞因子和酶類啟動骨形成過程，并通過這一系列因素與破骨細 胞調節相偶聯，控制破骨細胞的生成、成熟和活化，使骨形成和骨吸收處于動態平衡中。骨 形成和骨吸收失偶聯導致的骨量減少及骨微細結構退變是骨質疏松癥的主要病理特征。骨 質疏松所引起的骨折，以及骨折相關并發癥給社會和家庭造成極大的經濟負擔。目前對于 骨質疏松癥的治療藥物種類繁多，但療效不完全或存在難以克服的藥物不良反應，國內外 學者都在不斷努力尋找抗骨質疏松癥治療的新途徑。
[0003] 細胞自噬是近年來研究的熱點，早期研究認為自噬是細胞對應激環境的一種適應 性反應，隨著對自噬研究的深入，自噬在很多方面的作用逐漸被認識，它可以通過及時清除 損傷的線粒體減少自由基的釋放，減輕氧化應激反應損傷。有研究證實條件性敲除小鼠成 骨細胞自噬基因 Atg7，骨組織中的氧化應激水平升高，成骨細胞自噬的水平受到限制，成骨 細胞活力明顯下降，呈現骨質疏松樣的改變。除此之外，自噬還在許多疾病的發生發展過程 中發揮著重要的作用，自噬與腫瘤、免疫和衰老等密切相關。細胞自噬功能障礙與神經退行 性疾病包括阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病的發生密切相關。在骨髓間充質干細胞中， 自噬對其成骨或成脂分化似乎有一定的調節作用。然而，自噬在骨質疏松癥中的具體作用 機制目前尚不清楚。
[0004] TFEB是自噬的關鍵轉錄調控因子，它能直接結合到目標自噬基因啟動子區域的目 標位點并促進他們的表達，這些目標基因包括:UVRAGWIPI、MAP1LC3B、SQSTM1、VPS11、VPS18 和ATG9B。除此之外，TFEB還被證實是溶酶體產生最主要的調節因子，TFEB控制多種溶酶體 相關蛋白的表達，包括溶酶體水解酶、溶酶體膜蛋白，以及自噬相關基因。TFEB直接結合到 位于不同的溶酶體基因的啟動子區域，協調溶酶體的表達，導致溶酶體蛋白表達的顯著升 高。而自噬與溶酶體的功能密切相關。TFEB是MiTF/TFE家族成員，都有helix-loop-helix亮 氨酸拉鏈結構。MITF主要在生黑色素細胞、破骨細胞、肥大細胞、巨噬細胞、NK細胞、B細胞以 及心肌細胞中表達，TFEC的表達主要局限在骨髓起源細胞，而TFE3和TFEB則普遍存在于多 種細胞類型。既往的研究表明TFEB與破骨細胞的分化與功能密切相關，而在成骨細胞中的 作用尚無研究。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是提供一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，該試劑盒 檢測靈敏度高，經過本發明試劑盒的檢測，驗證在成骨分化過程中自噬水平的變化，為臨床 上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
[0006] 本發明的一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，所述試劑盒含有下列引物對：
[0023] 所述試劑盒還包括DNA提取試劑和PCR緩沖液。
[0024] 所述試劑盒的PCR反應條件為:95 °C 30s，95 °C 10s，60 °C 30s，共40個循環。
[0025] 所述試劑盒的PCR反應結束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察 并確認條帶位置。
[0026] 抽提組織總RNA后先進行逆轉錄再使用試劑盒。
[0027] 有益效果
[0028] 本發明檢測靈敏度高，經過本發明試劑盒的檢測，驗證在成骨分化過程中自噬水 平的變化，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
【附圖說明】
[0029] 圖1A-D分別為成骨細胞早期分化過程中，成骨分化標志基因隨誘導天數增加的變 化情況；
[0030] 圖2A-D分別為自噬特異性的自噬相關基因在成骨誘導不同天數時的變化；
[0031 ] 實驗數據用均數土標準誤表示，*P〈0 · 05，**Ρ〈0 · 01，***P〈0 · 001。
【具體實施方式】
[0032] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0033] 實施例1
[0034] 1.總RNA的分離和提取
[0035] 1)棄去細胞培養液，用PBS(lx)沖洗三遍，六孔培養板每孔加入lml Trizol，裂解5 分鐘左右之后，用lml的移液槍吹打板底，使貼壁細胞懸浮于Trizol中，收集Trizol細胞懸 液至1.5ml的EP管中，置于-80°C冰箱中保存或直接進行分離抽提；
[0036] 2)lml Trizol中加入200ul的氯仿，蓋緊EP管的蓋子，將EP管顛倒混勻15次，至液 體混濁后室溫靜置15分鐘；
[0037] 3)隨后將靜置后的EP管放于低溫離心機中，4°C，12000rpm，離心15分鐘。小心取出 EP管，可見EP管中溶液出現分層，下層為紅色苯酚-氯仿溶液中含有DNA;薄薄的中間白色層 含有蛋白質;上層是水溶液，RNA即溶解在上層水溶液中，約占整個溶液體積的60%。離心期 間，準備一套新的EP管，每管加入500ul異丙醇，標記好管子后，關閉超凈臺的前窗，打開紫 外燈；
[0038] 4)小心取出離心好的EP管，用小容量的移液槍小心吸取上清無色水相至剛才新標 記的EP管中，按0.5ml異丙醇/lml Trizol加入異丙醇，加完一個EP管要關好蓋子，以免RNA 被外界的RNA酶降解，將EP管顛倒混勻15次，使RNA充分與異丙醇混勻；
[0039] 5)將混勻后的EP管放于低溫離心機中，4°C，12000rpm，離心15分鐘。小心取出EP 管，可見白色的RNA沉淀貼附在管壁一側；
[0040] 6)去掉上清液，按lml/lmlTrizol加入由DEPC水新配制的75%酒精，輕輕震蕩EP 管，盡量使RNA沉淀漂起，與酒精充分接觸；
[0041 ] 7)再次離心，4°C，9000rpm，5分鐘，使RNA白色沉淀沉于管底；
[0042] 8)去掉上清液，重復上面的步驟，再次用75%的酒精洗滌一次RNA;
[0043] 9)再次離心，4°C，9000rpm，5分鐘，使RNA白色沉淀沉于管底；
[0044] 10)棄上清，室溫干燥RNA沉淀，并根據沉淀的大小，用10_30ul RNase-free水溶解 RNA樣品后，用RNA濃度測定儀測定提取的RNA的濃度，把提取好的RNA樣品置于-80°C冰箱中 保存，或直接進行RT-PCR逆轉錄。本試驗所用物品均需要經過DEPC水處理。
[0045] 2.用ΝΑΝΟ測定RNA濃度
[0046] 1)雙擊桌面Nano軟件的圖標打開軟件；
[0047] 2)選擇檢測功能，選擇Nuc 1 eic Acid，并對檢測樣品命名，以方便在電腦中查找和 儲存；
[0048] 3)選擇對應樣品測試類型為:RNA，抬起儀器上臂，加樣品緩沖液1.5ul到儀器的下 基座上，加樣完畢后，放下儀器上臂，點擊軟件左上角的Blank圖標，大約5秒后，開始測試；
[0049] 4)待樣品緩沖液測試完畢后，抬起上臂，用無塵紙把上下基座擦拭干凈，擦拭完 后，先把樣品和緩沖液充分混勻，然后用移液槍分別取等量的上述提取好的RNA樣品，并把 樣品依次加到儀器的基座上，并且點擊Measure鍵進行檢測；
[0050] 5)待樣品測試完后，抬起上臂，用無塵紙清潔上下基座，然后加純水3ul至儀器的 下基座上并放下上臂，靜止3分鐘后用無塵紙擦去；
[0051 ] 6)把用儀器測出的RNA濃度值、260/280和260/230的值分別記錄下來，以備后面實 驗中使用。
[0052] 3.逆轉錄
[0053] 1)根據計算的RNA濃度，取lug RNA，用RNase-free水調節體積至5ul，其中含 lulPrimer，70°C預熱10分鐘使RNA鏈解聚后，迅速放于冰上；
[0054] 2)每 15ul反應體系中加入2ug RNA(5ul)，lul反轉錄酶，0.5ul RNasin，lul dNTP Mixture (lOmM)，4ul Reverse Transcription 5x buffer,4ul MgCl2(25mM)，最后用 Nuclease-free水補齊至15ul后，混勾；
[0055] 3)逆轉錄PCR，按如下條件設置操作程序:25°C，5分鐘-42°C，60分鐘-70°C，15分 鐘-4°C，f orever，將逆轉錄所得到的cDNA放于-20°C冰箱中保存，或直接用于Real-time PCR檢測。
[0056] 4.Real-time PCR
[0057]根據反轉的cDNA的質量，將反轉錄得到的cDNA稀釋合適的倍數，反應體系lOul為： (ddH2〇，lul) + (SYBR Green，5ul) + (primer F，lul，primer 1?，1111) + (〇0嫩，2111)。反應條件 為:95°C，30sec; (95°C，10sec;60°C，30sec) X40cycles，各檢測基因引物序列如下所示：
[0074] 5.結果
[0075] (1)成骨細胞系MC3T3-E1成骨誘導分化的結果
[0076]取成骨細胞系MC3T3-E1細胞，以2X105/ml的密度接種于6孔板，待細胞生長融合 至約80%時加入成骨細胞誘導液進行成骨誘導培養。在誘導的0天、2天、5天和7天四個時間 點分別提取細胞的RNA，通過RT-PCR檢測三個組別之間成骨分化標志基因的表達情況，并同 時在2天、5天、7天時進行堿性磷酸酶染色。RT-PCR的結果顯示，在成骨細胞系MC3T3-E1細胞 誘導分化過程中，成骨分化標志基因0(：、〇)11^1^、(^6的表達水平隨誘導天數增加呈增高 趨勢(圖1A-D)。
[0077] (2)成骨細胞分化過程中自噬相關基因的變化
[0078]自噬是一個復雜的生理過程，在自噬現象的背后涉及到約三十多個自噬相關的基 因，其中我們選擇了4個特異性比較高的自噬相關基因做RT-PCR分析：LC3、Atg5、Atg7、 Beclin-1，他們均是參與自噬體形成和調控的重要基因，通過調控自噬使機體更好的適應 外界的應激變化。由圖2可以看出在成骨細胞成骨分化的過程中，自噬的特異性基因 LC3、 Atg5和Atg7均表達出不同程度的上調趨勢，而Beclin-Ι在成骨誘導第7天的時候出現下調 趨勢，但是總體的趨勢還是上調的。
[0079]本實施例在MC3T3-E1細胞成骨分化模型中發現成骨細胞分化和自噬的相關關系， 通過試劑盒分析了在成骨分化過程中自噬水平的變化，驗證了這一結論并探討自噬在骨質 疏松癥發生中的可能的作用機制。
【主權項】
1. 一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒含有下列引物對： Atg5 F:5 '-TGTGCTTCGAGATGTGTGGTT-3 '； R:3 '-GTCAAATAGCTGACTCTTGGCAA-5 '； Atg7 F:5 '-CCTGCACAACACCAACACAC-3 '； R:3 '-CACCTGACTTTATGGCTTCCC-5 '； BECNl F:5 '-ACCGGGTCACCATCCAGGAA-3 '； R:3 '-GAAGCTATTAGCACTTTCTGT-5 '； LC3 F:5 '-CTTCTTCCTCCTGGTGAATGG-3 '； R:3 '-ATTGCTGTCCCGAATGTCTC-5 '； ALP F:5，-CCAAAAACTCAACACCAACG-3，； R:3 '-TCCATCTCCAGCCGTGTCT-5 '； OC F:5，-TGCAGACCTAGCAGACACCAT-3，； R:3，-ACTCAGAGTCGCTGGGCTTT-5，； Collenge I F:5'-TGTCCCAACCCCCAAAAA-3'； R:3 '-ATGACTTCTGCGTCTGGTGAT-5 '； OPG F:5 '-CTTCGTGCCTTGATGGA-3 '； R:3 '-TGTAGGGTGAAAGGGTT-5 '。2. 根據權利要求1所述的一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 還包括DNA提取試劑和PCR緩沖液。3. 根據權利要求1所述的一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 的 PCR 反應條件為:95 °C 30s，95 °C IOs，60 °C 30s，共 40 個循環。4. 根據權利要求3所述的一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 的PCR反應結束后1.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠染色，紫外燈下觀察并確認條帶位置。5. 根據權利要求1所述的一種成骨細胞分化基因檢測試劑盒，其特征在于:抽提組織總 RNA后先進行逆轉錄再使用試劑盒。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950769SQ201610527657
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】寧光, 趙紅燕, 趙點點, 孫立昊, 陶蓓, 劉建民
【申請人】上海市內分泌代謝病研究所, 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院