以pex13作為診斷膽管癌的基因標(biāo)志物的制作方法

以pex13作為診斷膽管癌的基因標(biāo)志物的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于膽管癌早期診斷的分子標(biāo)志物?PEX13基因及其表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明利用QPCR和Western blot方法證明PEX13基因在膽管癌組織和正常膽管組織中存在差異表達(dá)，可以作為早期診斷膽管癌的指標(biāo)。另外，本發(fā)明還公開(kāi)了PEX13基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為膽管癌治療的靶標(biāo)，用于指導(dǎo)新藥的研發(fā)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
以PEX13作為診斷膽管癌的基因標(biāo)志物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及人PEX13基因在膽管癌診斷、治療中的用 途。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因表達(dá)譜（expression profile)指的是生物體在某一狀態(tài)下相對(duì)于一個(gè)參照 物的基因表達(dá)的整體狀況，即生物整體性基因表達(dá)差異，具有一定的特征性和代表性。其主 要目的是通過(guò)這種表型數(shù)據(jù)來(lái)揭示基因在某一特定生物學(xué)狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系進(jìn)而 揭示某些生命現(xiàn)象的本質(zhì)。
[0003] 膽管癌惡性程度高，預(yù)后極差。手術(shù)是膽管癌的有效治療手段，但術(shù)后5年生存率 不高。膽管癌約占胃腸道惡性腫瘤的3%，在全球范圍內(nèi)發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)。膽管癌發(fā) 病的平均年齡約為50歲，男性發(fā)病率約為女性的1.5倍。早期預(yù)防、早期發(fā)現(xiàn)、早期治療是提 高人膽管癌手術(shù)根治率和5年生存率的關(guān)鍵。
[0004] 膽管癌的診斷依賴(lài)于臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和影像學(xué)檢查的結(jié)合，最終確診以病 理學(xué)或細(xì)胞學(xué)為"金標(biāo)準(zhǔn)"。但當(dāng)患者出現(xiàn)臨床癥狀，或影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，患者大多已 是進(jìn)展期腫瘤，手術(shù)切除率和根治率低，目前針對(duì)人膽管癌，仍然缺乏一種特異的和敏感的 診斷方法。
[0005] 本申請(qǐng)從轉(zhuǎn)錄組水平尋找腫瘤組織與正常組織之間的基因表達(dá)模式差異。希望通 過(guò)對(duì)差異基因表達(dá)的研究來(lái)推斷基因與基因間的相互關(guān)系，細(xì)胞癌變過(guò)程中基因"開(kāi)啟"或 "關(guān)閉"的機(jī)制;揭示基因與膽管癌的發(fā)生和發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系。總之，本申請(qǐng)旨在為尋找癌變 過(guò)程中可能涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路、闡明膽管癌癌變機(jī)理、發(fā)現(xiàn)用于預(yù)防和早期檢測(cè)的候選 分子標(biāo)志物以及基因治療的可能靶點(diǎn)提供新的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于膽管癌早期診斷的 分子標(biāo)志物。使用基因標(biāo)志物來(lái)診斷膽管癌具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾 病早期就能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷膽管癌的工具中的應(yīng)用。
[0009] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)PEX13基因 mRNA水平的產(chǎn)品、和/ 或檢測(cè)PEX13蛋白水平的產(chǎn)品。
[0010] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 測(cè)、原位雜交或芯片檢測(cè)PEX13基因及其表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)水平以診斷膽管癌的產(chǎn)品。
[0011] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增PEX13基因的引 物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增PEX13基因的引物;所述 用免疫檢測(cè)診斷膽管癌的產(chǎn)品包括:與PEX13蛋白特異性結(jié)合的抗體;所述用原位雜交診斷 膽管癌的產(chǎn)品包括:與PEX13基因的核酸序列雜交的探針;所述用芯片診斷膽管癌的產(chǎn)品包 括:蛋白芯片和基因芯片;其中，蛋白芯片包括與PEX13蛋白特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包 括與PEX13基因的核酸序列雜交的探針。
[0012]所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增PEX13基因的引 物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。
[0013]所述檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的產(chǎn)品可以是檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的試劑、也可以是包含 所述試劑的試劑盒、芯片、試紙等，也可以是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0014] 所述診斷膽管癌的工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)；高 通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷膽管癌的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì)一個(gè)人的 基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過(guò)對(duì)比疾病患者和正常人群的基因表達(dá)譜， 容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知PEX13基因的異常與膽 管癌相關(guān)也屬于PEX13基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種診斷膽管癌的工具，所述工具包括檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的試 劑;所述試劑包括檢測(cè)PEX13基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)PEX13蛋白的抗體。
[0016] 所述工具包括但不限于芯片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0017] 其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片;所述基因芯片包括固相載體以及固定 在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測(cè)PEX13基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) PEX13基因的寡核苷酸探針;所述蛋白質(zhì)芯片包括固相載體以及固定在固相載體的PEX13蛋 白的特異性抗體;所述基因芯片可用于檢測(cè)包括PEX13基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與膽管 癌相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)芯片可用于檢測(cè)包括PEX13蛋白在內(nèi)的多個(gè)蛋 白質(zhì)(例如與膽管癌相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過(guò)將多個(gè)與膽管癌的標(biāo)志物同時(shí)檢 測(cè)，可大大提高膽管癌診斷的準(zhǔn)確率。
[0018] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒;所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)PEX13基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑;所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括PEX13蛋白的 特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或芯片 方法檢測(cè)PEX13基因表達(dá)水平過(guò)程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)PEX13基因的 引物和/或探針。根據(jù)PEX13基因的核苷酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可以用于檢測(cè)PEX13基因表 達(dá)水平的引物和探針。
[0019] 所述試紙包括檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的試劑。
[0020] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的試劑。
[0021] 與PEX13基因的核酸序列雜交的探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其它 衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒(méi)有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結(jié)合， 任何長(zhǎng)度都可以。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述探針的 長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針長(zhǎng)度對(duì)雜 交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最長(zhǎng)一般不超 過(guò)30個(gè)堿基對(duì)，與目的核苷酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度以15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探針自身互補(bǔ)序 列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，以免影響雜交效率。
[0022]進(jìn)一步，所述PEX 13蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述PEX 13蛋 白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾（例如，，嵌合抗體、scFv、 Fab、F(ab'）2、FV等。只要所述片段能夠保留與PEX13蛋白的結(jié)合能力即可。用于蛋白質(zhì)水平 的抗體的制備時(shí)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來(lái)制備所述抗體。 [0023]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述檢測(cè)PEX13基因 mRNA的引物包括SEQIDN0.3和 SEQ ID N0.4所示的引物對(duì)。
[0024]本發(fā)明還提供了 PEX13基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療膽管癌的藥物 中的應(yīng)用。
[0025] 所述促進(jìn)劑包括促進(jìn)PEX13基因表達(dá)的試劑和促進(jìn)PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑;所 述促進(jìn)PEX13基因表達(dá)的試劑包括促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的試劑、促進(jìn)基因翻譯的試劑、促進(jìn)PEX13 蛋白含量的試劑;所述促進(jìn)PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括促進(jìn)PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性 的試劑、促進(jìn)PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物功能的試劑。
[0026] 具體地，所述促進(jìn)PEX13基因表達(dá)的試劑包括:含有PEX13基因的試劑、攜帶PEX13 基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有PEX13蛋白質(zhì)的試劑。
[0027]本發(fā)明的促進(jìn)劑一方面可以用于補(bǔ)充內(nèi)源性的PEX13蛋白的缺失或不足，通過(guò)提 高TOX13蛋白的表達(dá)，從而治療因 TOX13蛋白缺乏導(dǎo)致的膽管癌。另一方面可以用于促進(jìn) PEX13蛋白的活性或者功能，從而治療膽管癌。
[0028] 本發(fā)明所述攜帶基因的載體是本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體、包括質(zhì)粒、 粘粒、噬菌體、病毒等。
[0029] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的 例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物 細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CH0細(xì)胞、C0S細(xì)胞等。
[0030] 本發(fā)明還提供了一種用于治療膽管癌的藥物組合物，所述藥物組合物包括上面所 述的PEX13基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑。
[0031] 進(jìn)一步，本發(fā)明的藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體，載體，這類(lèi)載體包括(但并不 限于）：稀釋劑、賦形劑如水等、填充劑如淀粉、蔗糖等;粘合劑如纖維素衍生物、藻酸鹽、明 膠和聚乙烯吡咯烷酮;濕潤(rùn)劑如甘油；崩解劑如瓊脂、碳酸鈣和碳酸氫鈉;吸收促進(jìn)劑季銨 化合物;表面活性劑如十六烷醇;吸附載體如高嶺土和皂粘土;潤(rùn)滑劑如滑石粉、硬脂酸鈣 和鎂、聚乙二醇等。
[0032] 本發(fā)明的藥物導(dǎo)入組織或者細(xì)胞的方式可以分為體外或者體內(nèi)的方式。體外方式 包括將含有PEX13基因的藥物或者含有PEX13蛋白質(zhì)的藥物導(dǎo)入細(xì)胞中，再將細(xì)胞移植或回 輸?shù)襟w內(nèi)。體內(nèi)方式包括直接將含有PEX13基因的藥物或者含有PEX13蛋白質(zhì)的藥物注入體 內(nèi)組織中。
[0033] 本發(fā)明的藥物還可與其他治療膽管癌的藥物聯(lián)用，多種藥物聯(lián)合使用可以大大提 到治療的成功率。
[0034] 在本發(fā)明的上下文中，"PEX13基因"包括PEX13基因以及PEX13基因的任何功能等 同物的多核苷酸。PEX13基因包括與目前國(guó)際公共核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)GeneBank中PEX13基因 (NC_000002.12)DNA序列具有70%以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0035] 優(yōu)選地，PEX 13基因的編碼序列包括以下任--種DNA分子：
[0036] (1)序列表中SEQ ID N0· 1所不的DNA序列；
[0037] (2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列；
[0038] (3)與（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、優(yōu)選地，90%以上同源性，且編碼相同功 能蛋白質(zhì)的DNA分子。
[0039]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述PEX13基因的編碼序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0040] 在本發(fā)明的上下文中，PEX13基因表達(dá)產(chǎn)物包括PEX13蛋白以及PEX13蛋白的部分 肽。所述PEX13蛋白的部分肽含有與膽管癌相關(guān)的功能域。
[0041 ] "PEX13蛋白"包括PEX13蛋白以及PEX13蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物 包括PEX13蛋白保守性變異蛋白質(zhì)、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變 體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與PEX13的DNA雜交的DNA所編碼的蛋白質(zhì)。
[0042]優(yōu)選地，PEX13蛋白是具有下列氣基酸序列的蛋白質(zhì)：
[0043] (1)由序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0044] (2)將SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID N0.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白質(zhì)。取代、缺失或者添加的氨基酸的個(gè)數(shù)通常為1-50個(gè)，較佳地1-30 個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)。
[0045] (3)與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又稱(chēng)為序列同一性）， 更優(yōu)選地，與SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列至少約90%至95%的同源性，常為96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列構(gòu)成的多肽。
[0046]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述PEX13蛋白是具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序 列的蛋白質(zhì)。
[0047]通常，已知的是，一個(gè)蛋白質(zhì)中一個(gè)或多個(gè)氨基酸的修飾不會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能。 本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)可改變單個(gè)氨基酸或小百分比的氨基酸或?qū)Π被嵝蛄械膫€(gè)別添加、 缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質(zhì)的改變產(chǎn)生具有相似功能的蛋白質(zhì)。提供功能相 似的氨基酸的保守替換表是本領(lǐng)域公知的。
[0048]通過(guò)添加一個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸殘基修飾的蛋白質(zhì)的例子是PEX13蛋白的融合 蛋白。對(duì)于與PEX13蛋白融合的肽或者蛋白質(zhì)沒(méi)有限制，只要所得的融合蛋白保留PEX13蛋 白的生物學(xué)活性即可。
[0049]本發(fā)明的PEX13蛋白也包括對(duì)SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要 經(jīng)過(guò)修飾的蛋白質(zhì)仍然能夠保留PEX13蛋白的生物學(xué)活性即可。在此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)中突變 的氨基酸數(shù)目通常是10個(gè)或者更少，例如6個(gè)或者更少，例如3個(gè)或者更少。
[0050] 在本發(fā)明的上下文中，"診斷膽管癌"既包括判斷受試者是否已經(jīng)患有膽管癌、也 包括判斷受試者是否存在患有膽管癌的風(fēng)險(xiǎn)。
[0051] 在本發(fā)明的上下文中，"治療膽管癌"從疾病的狀態(tài)變化來(lái)分，可以包括疾病的緩 解、疾病的完全治愈，還包括對(duì)于疾病治療效果的評(píng)價(jià)。
[0052]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0053]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 TOX13基因表達(dá)與膽管癌相關(guān)，通過(guò)檢測(cè)受試者膽管組織中 PEX13的表達(dá)，可以判斷受試者是否患有膽管癌、或者判斷受試者是否存在患有膽管癌的風(fēng) 險(xiǎn)，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0054]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-PEX13基因，相比傳統(tǒng)的檢測(cè)手段，基因診斷 更及時(shí)、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)膽管癌的早期診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0055]圖1顯示利用QPCR檢測(cè)PEX13基因在膽管癌組織中的表達(dá)情況；
[0056] 圖2顯示利用Western blot方法檢測(cè)PEX13基因在膽管癌組織中的表達(dá)情況；
[0057]圖3顯示利用QPCR檢測(cè)PEX13基因在膽管癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況；
[0058]圖4顯示利用Western blot方法檢測(cè)PEX13基因在膽管癌細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)情況； [0059] 圖5顯示PEX13基因表達(dá)對(duì)膽管癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
[0060]具體的實(shí)施方式
[0061]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本 發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件，例如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0062]實(shí)施例1篩選與膽管癌相關(guān)的基因標(biāo)志物 [0063] 1.1樣品收集
[0064]各收集10例正常膽管組織和膽管癌組織樣本。上述樣本為膽管癌患者的手術(shù)切除 標(biāo)本，上述所有標(biāo)本的取得均通過(guò)組織倫理委員會(huì)的同意。
[0065] 1.2RNA樣品的制備及質(zhì)量分析
[0066] 1 · 2 · 1RNA樣品的制備
[0067] ①先在研缽中加入液氮，再將組織剪成小塊在液氮中磨成粉末，用液氮預(yù)冷的藥 匙取50~100mg組織粉末加入已盛有l(wèi)ml的Trizol液的EP管中（注意組織粉末總體積不能超 過(guò)所用Trizol體積的10% )，充分混合均勾。
[0068]②室溫放置5min，然后加入200μ1的氯仿，蓋緊EP管并劇烈搖蕩15秒鐘。
[0069] ③12000rpm離心10min，取上層水相于一新的ΕΡ管中（千萬(wàn)不要將中間的沉淀層和 下層液混入，否則重新離心分離），加入500μ1異丙醇，溫和顛倒混勻。室溫放置10min， 12000rpm離心 1 Omin。
[0070] @小心地棄去上清液，加入11111的75%乙醇，禍旋混勾，4°〇下12000印1]1離心5111；[11。 重復(fù)操作一次。
[0071] ⑤棄去上清液(盡量將殘余液體除去），室溫或真空干燥5~10min(注意不要干燥 過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度）。用30μ1 DEPC處理過(guò)的水將RNA溶解，必要時(shí)可55°C~60°C 水浴1 Omin ANA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70 %乙醇并保存于-70 °C。
[0072] 1.2.2RNA樣品的質(zhì)量分析(NanoDroplOOO分光光度計(jì)）
[0073] NanoDroplOOO分光光度計(jì)檢測(cè)RNA樣品，RNA-seq測(cè)序的樣品要求:0D260/0D280為 1·8_2·2 〇
[0074] 3、基因芯片雜交及掃描
[0075] 總RNA經(jīng)線性化擴(kuò)增后，cy3-UTP標(biāo)記，熒光標(biāo)記后的cRNAs采用RNEASY Mini Kit 純化，用Amhion的RNA Fragmentation Reagents對(duì)標(biāo)記好的cRNAs進(jìn)行片段化處理。采用美 國(guó)Agilent公司的人全基因表達(dá)譜芯片(4x44K基因），在芯片雜交爐中65°C雜交17h，然后洗 脫、染色，最后用Agilent DNA MicroarrayScanner掃描儀掃描。
[0076] 4、芯片數(shù)據(jù)處理與分析
[0077] 雜交后的芯片經(jīng)芯片掃描儀讀取數(shù)據(jù)點(diǎn)后，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入分析軟件，對(duì)于兩組比值 的自然對(duì)數(shù)絕對(duì)值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達(dá)基因。
[0078] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0079]采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，P〈 0.05差異有顯著性意義。
[0080] 6、結(jié)果
[0081] 芯片結(jié)果顯示，PEX13基因在膽管癌組織中的表達(dá)量顯著低于正常的膽管組織。
[0082] 實(shí)施例2 QPCR測(cè)序驗(yàn)證PEX13基因的差異表達(dá)
[0083] 1、根據(jù)芯片的檢測(cè)結(jié)果選擇PEX13基因進(jìn)行大樣本QPCR驗(yàn)證。按照實(shí)施例1中的樣 本收集方式選擇膽管癌組織和正常膽管組織各50例。
[0084] 2、RNA提取步驟同實(shí)施例1。
[0085] 3、逆轉(zhuǎn)錄:使用TAKARA公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行操作。具體步驟如下：
[0086] (1)取總RNA 2yg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，加入01igo(dT)2yl，充分混勻。70°C水浴5分鐘后立 即冰浴2-3分鐘。
[0087] (2)構(gòu)建25μ1反應(yīng)體系，其中包括5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，補(bǔ)無(wú)核酶水至預(yù)期體積。
[0088] (3) 42 °C水浴60分鐘后，95 °C水浴5分鐘以滅活M-MLV。
[0089] (4)-2(TC 儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0090] 4、QPCR 擴(kuò)增
[0091] (1)引物設(shè)計(jì)
[0092] 根據(jù)Genbank中PEX13基因和GAroH基因的編碼序列設(shè)計(jì)QPCR擴(kuò)增引物，由上海生 工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。具體引物序列如下：
[0093] PEX13 基因：
[0094] 正向引物為5'-GTTATCCTTGGTGGTCCTT-3'（SEQ ID N0.3);
[0095] 反向引物為5'-GTTGATGCTGTCTGTTACTTC-3'（SEQ ID N0.4)。
[0096] GAPDH 基因：
[0097] 正向引物為5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0098] 反向引物為5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.6)。
[0099] (2)按照表1配制PCR反應(yīng)體系：
[0100] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購(gòu)自Invitrogen公司。
[0101] 表1 PCR反應(yīng)體系
[0103] (3汗0?反應(yīng)條件：951€511^11，（95°(：158,6〇1€6〇8)*45個(gè)循環(huán)。以5￥81?6代611作為熒 光標(biāo)記物，在Light Cycler焚光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過(guò)融解曲線分析和電泳確定 目的條帶，△△ CT法進(jìn)行相對(duì)定量。
[0104] 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0105]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0106] 6、結(jié)果
[0107]結(jié)果如圖1所示，與正常膽管組織相比，PEX13基因在膽管癌組織中的表達(dá)下調(diào)，差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)，同芯片結(jié)果一致。
[0108]實(shí)施例3在蛋白水平上檢測(cè)PEX13基因的差異表達(dá) [0109] 1、提取組織總蛋白
[0110] 按照EpiQuik組織/細(xì)胞總蛋白提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白提取的操作。
[0111] 2、Western blot檢測(cè)
[0112] 將提取的蛋白定量進(jìn)行SDS-PAGE電泳，之后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、 顯色。
[0113] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0114] 將蛋白條帶的灰度值使用Image J軟件進(jìn)行分析，以β-actin為內(nèi)參，將目的白條 帶的灰度值進(jìn)行歸一化處理。結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示，采用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義。
[0115] 4、結(jié)果
[0116]結(jié)果如圖2所示，與正常膽管組織相比，膽管癌組織中PEX13蛋白含量降低，差異具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.〇5)。
[0117] 實(shí)施例4 PEX13基因表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
[0118] UPEX13基因表達(dá)載體的構(gòu)建
[0119] 根據(jù)PEX13基因的編碼序列（如SEQ ID NO. 1所示）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。從成人胎腦的 cDNA文庫(kù)（clontech公司，貨號(hào)：638831)中擴(kuò)增全長(zhǎng)的PEX13基因的編碼序列，將上述cDNA 序列插入真核細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3.1中，連接獲得的重組載體pcDNA3.1-PEX13用于后續(xù)實(shí) 驗(yàn)。
[0120] 2、細(xì)胞培養(yǎng):人膽管癌細(xì)胞株QBC939,以含10%小牛血清的DMEM(高糖)培養(yǎng)基在 37°C、5 % C02、相對(duì)濕度為90 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25 %胰蛋白酶常規(guī) 消化傳代。
[0121] 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0122] 將膽管癌細(xì)胞按1 X 104/孔接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37°C、5%C02培養(yǎng)箱中細(xì) 胞培養(yǎng)24h，轉(zhuǎn)染按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000(購(gòu)自于Invitrogen公司）的說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分 為對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1)和實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PEX13)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的工作濃度是0.5yg/ ml 〇
[0123] 4、利用QPCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的效果。
[0124] 4.1提取細(xì)胞總RNA
[0125]米用TRIzol Reagent(Invitrogen Cat.No. 15596-018)總RNA提取試劑，按說(shuō)明書(shū) 提供方法提取QBC939細(xì)胞的總RNA。具體方法為：取細(xì)胞，用濃度為0.01M的roS沖洗3次，加 入適量TRIzol試劑，室溫放置5min裂解細(xì)胞，吹打均勻后以lmL/管分裝至1.5mL Eppendorf 管中。每管加入0.2mL氯仿，劇烈震蕩15s，室溫放置2_3min，4°C、12000r/min離心15min，將 上層水相移至干凈Eppendorf管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕混勾，室溫放置lOmin，4°C、 750〇1'/111；[11離心10111；[11。棄上清，75%乙醇洗滌1?熟沉淀，75001'/111；[11離心5111；[11，室溫干燥1?祖沉 淀，5-10min后溶于適量DEPC水。質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA樣本的完整 性，應(yīng)用Bio-Photometer對(duì)提取的RNA進(jìn)行定量測(cè)定。
[0126] 4.2逆轉(zhuǎn)錄
[0127] 步驟同實(shí)施例2。
[0128] 4.3QPCR
[0129] 步驟同實(shí)施例2。
[0130] 4.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0131]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，兩組之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具 有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0132] 5、Western 檢測(cè)
[0133] 具體步驟同實(shí)施例3。
[0134] 6、結(jié)果
[0135] 如圖3所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-TOX13的細(xì)胞中 PEX13的mRNA水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈0.05);如圖4所示，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空 載體的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染PCDNA3.1-PEX13的細(xì)胞中PEX13的蛋白水平顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義(P〈〇.〇5)。
[0136] 實(shí)施例5 PEX13基因?qū)δ懝馨┘?xì)胞增殖的影響
[0137] 1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染:按照實(shí)施例4的方法對(duì)膽管癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0138] 2、轉(zhuǎn)染24小時(shí)后加入3H-TdR(lyCi/孔），再培養(yǎng)24小時(shí)，收集細(xì)胞，加液體閃爍液， β計(jì)數(shù)儀檢測(cè)cpm值。
[0139] 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0140]實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來(lái)完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差的方式來(lái)表示， 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的，組間差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P〈0.05時(shí)具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義。
[0141] 4、結(jié)果
[0142] 結(jié)果如圖5顯示，與pcDNA3.1空載體組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PEX13的細(xì)胞增殖變慢 了，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P〈〇.05)。
[0143] 上述實(shí)施例的說(shuō)明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測(cè)PEXl3基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷膽管癌的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括:通過(guò)RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、 免疫檢測(cè)、原位雜交芯片或高通量測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)PEX13基因表達(dá)以診斷膽管癌的產(chǎn)品。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用RT-PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括 一對(duì)特異擴(kuò)增PEX13基因的引物;所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異 擴(kuò)增PEX13基因的引物;所述用免疫檢測(cè)診斷膽管癌的產(chǎn)品包括:與PEX13蛋白特異性結(jié)合 的抗體;所述用原位雜交診斷膽管癌的產(chǎn)品包括:與PEX13基因的核酸序列雜交的探針;所 述用芯片診斷膽管癌的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與PEX13蛋白 特異性結(jié)合的抗體，基因芯片包括與PEX13基因的核酸序列雜交的探針。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷膽管癌的產(chǎn)品至 少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增PEX13基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示。5. -種診斷膽管癌的工具，其特征在于，所述工具包括檢測(cè)PEX13基因表達(dá)的試劑;所 述試劑包括檢測(cè)PEX13基因 mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)PEX13蛋白的抗體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的工具，其特征在于，所述檢測(cè)I3EXl3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物對(duì)。 7. PEX13基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的促進(jìn)劑在制備治療膽管癌的藥物中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述促進(jìn)PEX13基因表達(dá)的試劑、促進(jìn) PEXl 3基因表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性的試劑、促進(jìn)PEXl 3基因表達(dá)產(chǎn)物活性的試劑、促進(jìn)PEXl 3基因表 達(dá)產(chǎn)物功能的試劑。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，促進(jìn)PEX13基因表達(dá)的試劑包括含有PEX13 基因的試劑、攜帶PEXl 3基因的載體或宿主細(xì)胞所形成的試劑、含有PEXl 3蛋白質(zhì)的試劑。10. -種用于治療膽管癌的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括7-9中任一 項(xiàng)所述的促進(jìn)劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/574GK105950752SQ201610416482
【公開(kāi)日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年6月13日
【發(fā)明人】鄧放
【申請(qǐng)人】北華大學(xué)