用于結直腸癌早期診斷的無創甲基化定量檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及疾病相關DNA檢測技術領域，更具體地，涉及結直腸癌受試者早期血漿DNA中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因的特定區域甲基化實時定量檢測試劑盒。所述定量檢測試劑盒是通過PCR引物及Taqman探針來完成檢測的。
【專利說明】
用于結直腸癌早期診斷的無創甲基化定量檢測試劑盒
技術領域
[0001]本發明涉及疾病相關DNA檢測技術領域，更具體地，涉及結直腸癌受試者早期血漿 DNA中rRNA_pseudogene，HECTDl和ZNF843基因的特定區域甲基化實時定量檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 結直腸癌是世界上第三大惡性腫瘤，近年來中國結腸癌發病率由7%激增到13%。 結直腸癌發病與生活方式、遺傳、大腸腺瘤等關系密切，且發病年齡趨老年化。結直腸癌早 期癥狀不明顯，僅感不適、消化不良、大便潛血等。目前的血腫瘤標記物如癌胚抗原檢測，有 助于腫瘤的診斷。此外，結腸鏡檢查可以檢查結腸和直腸腸腔，并在檢查過程中進行活檢和 治療。盡管活體組織檢查對結直腸癌的早期癌變和息肉癌變的確診有決定性意義，但其侵 入性的操作限制了在人群中進行結直腸癌的早發普查。此外，脫落細胞學檢查盡管準確性 高，但其取材繁瑣，且不易獲得滿意的標本，臨床應用較少。
[0003] DNA甲基化是一種表觀遺傳學修飾，大量研究表明DNA甲基化的異常變化可引起基 因組染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因 表達。因此，表觀遺傳學改變在腫瘤形成和發展過程中發揮著重要作用。近年來研究表明， DNA異常甲基化狀態與結直腸癌的發生發展密切相關，同時也有多個基因的異常高甲基化 在結直腸癌中頻繁發生。因此，DNA異常甲基化有望作為結直腸癌早期診斷的生物標志物。 循環DNA是指腫瘤細胞在增殖、轉移和凋亡過程中不斷釋放進入血漿或血清中的游離DNA。 研究人員在多種惡性腫瘤患者的血清或血漿中發現了甲基化的游離DNA。熒光定量PCR是通 過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，能實時監控反應過程，并 結合相應的軟件進行產物分析的PCR技術。該方法較其他傳統甲基化檢測方法在時間上大 幅縮減，同時，可以對極微量的DNA基因水平上的改變進行檢測和定量，解決血漿中DNA含量 少、丟失率尚、DNA降解、帶有致癌污染物等缺陷，使腫瘤抑制基因啟動子的尚甲基化在癌癥 患者的血漿中檢測出來。因此，實時定量檢測腫瘤患者中血漿游離DNA的表觀遺傳變化對腫 瘤的早期診斷、療效評估、發生機制等研究具有重要意義，更加適合醫院或科研院所操作。
[0004] 目前，對血漿游離DNA中基因的異常甲基化檢測已成為腫瘤分子診斷學中無創診 斷的一個新的研究熱點。本項目開發計劃采用分析早期結直腸癌患者血漿或血清中游離 DNA的核糖體RNA假基因 （rRNA pseudogene)、HECT結構域泛素蛋白鏈接酶1(HECT domain containing E3ubiquitin protein 1 igase 1，HECTD1)和鋅指蛋白843(zinc finger protein 843，ZNF843)基因啟動子區的甲基化程度，結合現代的生物信息技術和統計學原 理，提供操作簡便、靈敏度高、周期短、檢結果穩定可靠的甲基化定量檢測方法，同時為患者 的治療隨訪和預后提供科學依據。
[0005] rRNA pseudogene是一類與編碼基因高度相似但不能表達功能蛋白質的細胞內非 編碼基因。過去的研究認為假基因是沒有功能的DNA片段，然而隨著分子生物學技術的發 展，人們從測序數據中發現在腫瘤轉錄組中有大量假基因表達，這些假基因的表達不僅具 有癌癥特異性，還具有組織特異性。因此，越來越多的證據表明，假基因在人類癌癥等疾病 方面扮演著重要的角色。而該基因的甲基化水平異常可能影響基因的轉錄表達，從而促進 了腫瘤的發生發展。HECTD1基因表達在胚胎發育過程中起重要作用。且有研究表明，在人類 神經管缺陷中，HECTD1基因是一個候選的易感基因。而其表觀遺傳學方面在國內外的研究 中仍是空白。ZNF843是鋅指蛋白家族的成員之一。目前被報道的部分鋅指蛋白家族成員基 因啟動子區甲基化水平與腫瘤發生發展密切相關。如肝細胞癌中ZNF331基因啟動子區高甲 基化高達80%，提示該基因啟動子甲基化可作為臨床對肝癌早期診斷的候選指標。
[0006] 目前，國內外還沒有公開任何關于在結直腸癌中用實時熒光定量PCR檢測rRNA pSeud〇gen e、HECTDl和ZNF843基因啟動子區甲基化程度的檢測試劑盒相關研究報道。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的之一是提供一種用于結直腸癌早期診斷的無創甲基化定量檢測試 劑盒;其通過實時熒光定量PCR檢測受試者血漿或血清樣本中游離DNA的rRNA_p Seud〇gene， HECTD1和/或ZNF843基因啟動子區甲基化修飾變化，來輔助判斷結直腸癌的易感性或發病。 [0008]在本發明的一個實施方案中，所述定量檢測試劑盒是通過PCR引物及Taqman探針 來完成檢測的，其包含檢測rRNA_pseudogene基因啟動子區甲基化修飾變化的核苷酸序列； 所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如下：
[0018]在本發明的另一個實施方案中，所述定量檢測試劑盒還包含檢測HECTD1基因啟動 子區甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如 下：
[0046]在本發明的又一個實施方案中，所述定量檢測試劑盒還包含檢測ZNF843基因啟動 子區甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如 下：
[0074]在本發明中，上述核苷酸序列分別針對不同目的基因進行檢測。在優選的實施方 案中，所述定量檢測試劑盒包含用于檢測rRNA_pseudogene，HECTDl和/或ZNF843基因啟動 子區甲基化修飾變化的核苷酸序列中各一組核苷酸序列。例如，包括但不限于，所述試劑盒 中包含的核苷酸序列由組1、組4和組13組成;或者所述試劑盒中包含的核苷酸序列由組2、 組6和組20組成。
[0075]在本發明進一步地實施方案中，所述試劑盒包含用于檢測ACTB基因甲基化程度的 核苷酸序列，具體如下：
[0079] 在本發明的實施方案中，所述定量檢測試劑盒還包含如下組分：2XG〇ldStar TaqMan Mixture、陽性對照和陰性對照。進一步地，所述陽性對照可以為Qiagen EpiTect methylated DNA;所述陰性對照為Qiagen EpiTect unmethylated DNA。
[0080] 本領域公知，ACTB基因作為參照基因廣泛應用于DNA甲基化檢測中。
[0081] 在本發明中，所述試劑盒的檢測方法如下：20μ1的熒光定量PCR反應體系的組成 為：2XGoldstar TaqMan Mixture lO.Oul;上、下游引物各 1·0μ1(5μΜ);探針 1·0μ1(2μΜ); Η20 5. ΟμL，DNA樣本模板2. ΟμL。熒光定量PCR反應條件如下：（1 )95°C預變性lOmin; (2)95°C 變性15s，60 °C復性45s，共45個循環，期間連續采集熒光信號；（3)40°C維持。每例標本設三 個復孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和Qiagen EpiTect unmethylated DNA作為陽 性、陰性對照，水為空白對照。
[0082]在本發明中，所述DNA樣本可以來源于任何生物樣品；更優選地，所述待測DNA選自 細胞、組織(包括石蠟包埋組織）、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便、及其他分泌物。
[0083] 在本發明中，核苷酸序列中"C/T"是指該位置堿基選自C或T中一種堿基，"A/G"是 指該位置堿基選自A或G中的一種堿基。
[0084] 本發明的目的之二是提供上述試劑盒在制備用于結直腸癌早期診斷試劑中的應 用。
[0085] 本發明通過熒光定量PCR技術檢測人體血漿或血清中是否存在大腸癌早期目標基 因啟動子區甲基化修飾變化，設計巧妙，解決血漿中DNA含量少、丟失率高、帶有致癌污染物 等缺陷，相對傳統結直腸癌檢測技術具有發現早，靈敏度高，周期短等顯著優點，檢測結果 穩定可靠。該目標基因是由rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843所組成。
【附圖說明】
[0086] 圖1是MethyLight熒光定量rRNA pseudogene基因的PCR擴增曲線（組1-組3);
[0087] 圖2是MethyLight熒光定量HECTD1基因的PCR擴增曲線（組4-組12);
[0088] 圖3是MethyLight熒光定量ZNF843基因的PCR擴增曲線（組13-組21);
[0089] 圖4是MethyLight熒光定量ACTB基因的PCR擴增曲線(組22)。
【具體實施方式】
[0090]下面將結合附圖進一步的詳細說明本發明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本 發明要求保護的技術方案的舉例說明，并非對這些技術方案的任何限制。本發明的保護范 圍以所附權利要求書記載的內容為準。
[0091]需要指出的是，下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規條 件，分子克隆實驗指南（Sambrook J，et al.2008.Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd Ed.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0092] 實施例1
[0093] 1、研究對象和樣本的收集
[0094]本研究收集了來自寧波市醫院的100例結直腸癌患者和100例健康人，所有患者均 經病理確診。用含EDTA-K2的5ml帶蓋無菌塑料抗凝管抽取人外周靜脈血2ml，室溫狀態下放 置48小時內以3000rpm離心10min，收集血衆;再次以12000rpm離心10min，獲得無血細胞成 分的血漿，以1.5ml的離心管以每管200μ1分裝，-80°C保存，用于日后血漿標本全基因組DNA 提取。所有研究對象都簽署知情同意書。
[0095] 2、血漿全基因組DNA的提取
[0096] 取血衆200μ1，使用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit提取游 離DNA，提取過程嚴格按說明書進行。再通過NanoDrop2000超微量分光光度計(美國，Thermo Fisher Scientific)檢測所得DNA的純度和濃度備用。
[0097] 3、甲基化修飾
[0098] 米用EZ DNA Methylation Gold? Kit甲基化轉化試劑盒（Zymo research，美國）， 嚴格按照試劑盒說明步驟進行操作。經此步后，DNA序列中未甲基化的胞嘧啶(C)轉變為尿 嘧啶(U)。
[0099] 4、MethyLight 實時熒光定量 PCR
[0100] 20μ1 的熒光定量PCR反應體系的組成為：2XGoldstar TaqMan Mixture 10·0μ1; 上、下游引物各1.0μ1 (5μΜ);探針1.0μ1 (2μΜ) ;Η20 5.0μ1，樣本模板2.0μ1。熒光定量PCR反 應條件如下：（l)95°c預變性10min;(2)95°C變性15s，60°C復性45s，共45個循環，期間連續 采集熒光信號；（3)40°C維持。每例標本設三個復孔，Qiagen EpiTect methylated DNA和 Qiagen EpiTect unmethylated DNA作為陽性、陰性對照，水為空白對照。
[0101 ]本實施例中，采用的引物及Taqman探針序列如下：
[0102] rRNA_pseudogene 基因甲基化檢測：
[0106] HECTD1基因甲基化檢測：
[0118] 5、數據計算
[0119] Roche LightCycler 480熒光定量PCR儀的計算過程是首先通過ACTB參照基因來 對目的基因進行相對定量，然后再用陽性對照DNA的相對定量對實驗樣品值進一步作歸一 化處理，通過以下換算得到甲基化百分比參數(PMR):
[0120] PMR=(GENEsample/REFsample)/(GENEPositive/REFPositive) X 100%
[0121] 其中，GENE為目的基因，REF為參照基因，sample為實驗樣本，positive為甲基化陽 性對照DNA。PMR值越高，代表甲基化水平越高;PMR值越低，代表甲基化水平越低。
[0122] 6、結果
[0123] 本次實驗采用SPSS 18.0對數據進行整理分析，Me thyLight結果運用兩獨立樣本t 檢驗進行統計學處理。我們發現用161±71^8111:法發現：在結直腸癌患者血衆0麻中11?財_ pseudogene和HECTD1基因啟動子區的甲基化率低于健康人，且差異有統計學意義(P值均小 于0.05，見表1)，ZNF843基因啟動子區的甲基化率均高于健康人，且差異有統計學意義(P值 均小于0.05,見表1)。
[0124] MethyLight法檢測rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843啟動子區甲基化，用于診斷 結直腸癌的敏感性分別為98.3%，96.7%，90%，特異性分別為96.7%，95.0%，91.7%。三 者聯合檢測直結腸癌的靈敏度為100 %，特異性為100 %，診斷準確率為1。
[0125] 本發明試劑盒可用于實時定量檢測直結腸癌患者血清DNA中rRNA_pseudogene， HECTD1和ZNF843基因啟動子區甲基化程度，具有以下顯著特點：（1)操作簡便，周期短。該試 劑盒可同時測定60個樣本，大大縮短檢測時間，適合醫院或研究所大規模推廣應用。（2)穩 定性。該試劑盒在-20°C溫度下可保存12個月，其靈敏度和特異度都沒有下降。
[0126] 表1MethyLight方法中rRNA_pseudogene，HECTD1和ZNF843基因啟動子區甲基化水 平在病例組與對照組間的比較
[0128]注:N表示樣本個數，P值小于0.05，具有統計學意義。
[0129] 實施例2rRNA_pseudogene基因啟動子區甲基化修飾變化靈敏度檢測
[0130] 取實施例1中的結腸癌患者血漿樣本(PMR=8.3% );按照實施例1的方法進行血漿 全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對待測DNA樣 本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1: 25、1:50、1:100、1: 200、1:400、1:600、1:800，然后 按照實施例1的檢測方法分別采用組1至組3列出的引物及探針序列對稀釋的待測DNA樣本 進行檢測，直至熒光檢測中在45個循環內沒有出現PCR擴增曲線，以可以出現擴增曲線及可 以計算CT值的樣本作為最低檢測限。
[0131] 結果表明，組1至組3列出的引物及探針序列在待測DNA樣本稀釋800倍的情況下仍 然可以檢測rRNA_pSeUd 〇gene基因甲基化程度。在本測試中，組3的上游引物為5'-CGGGAGTCGCAGGGAAGGGG-3, 。
[0132] 還需要指出的是，針對組3列出的引物及探針序列，本發明也進行了相關測試，并 取得了類似結果，其中，組3的上游引物序列如下：
[0137] 實施例3HECTD1基因啟動子區甲基化修飾變化靈敏度檢測
[0138] 取實施例1中的結腸癌患者血漿樣本(PMR= 12.6 % );按照實施例1的方法進行血 漿全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對待測DNA 樣本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800，然 后按照實施例1的檢測方法分別采用組4至組12列出的引物及探針序列對稀釋的待測DNA樣 本進行檢測，直至熒光檢測中在45個循環內沒有出現PCR擴增曲線，以可以出現擴增曲線及 可以計算CT值的樣本作為最低檢測限。
[0139] 結果表明，組4至組12列出的引物及探針序列在待測DNA樣本稀釋600倍的情況下 仍然可以檢測HECTD1基因甲基化程度。
[0140] 本測試中，組7的下游引物為5'-六了六六六六00^六六六0^了0^0：-3'；
[0141] 組8的下游引物為5'-厶0^厶0：0：1'7^11'0：0：-3'；
[0142] 組 12的上游引物為 5 ' -TTGAATGCGTGTGAAATAAAGTT-3 '
[0143] 另外，在組7、8和12的其他測試中，也取得類似的技術效果，具體來說，
[0144] 組7的下游引物為5'-6丁厶厶厶厶〇0^厶厶厶0^0^0：-3'；
[0145] 組8的下游引物為5'-60^厶0：0：1'7^11'0：0：-3'；
[0146] 組 12的上游引物為5'-TTGAATGTGTGTGAAATAAAGTT-3' ；
[0147] 這些序列也取得極佳的測試效果。
[0148] 實施例4ZNF843基因啟動子區甲基化修飾變化靈敏度檢測
[0149] 取實施例1中的結腸癌患者血漿樣本(PMR= 10.2% );按照實施例1的方法進行血 漿全基因組DNA提取以及甲基化修飾獲得待測DNA樣本(DNA濃度50ngAU);然后對待測DNA 樣本用PBS緩沖液稀釋;稀釋比例分別為1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:600、1:800，然 后按照實施例1的檢測方法分別采用組13至組21列出的引物及探針序列對稀釋的待測DNA 樣本進行檢測，直至熒光檢測中在45個循環內沒有出現PCR擴增曲線，以可以出現擴增曲線 及可以計算CT值的樣本作為最低檢測限。
[0150] 結果表明，組13至組21列出的引物及探針序列在待測DNA樣本稀釋600倍的情況下 仍然可以檢測ZNF843基因甲基化程度。
[0151] 在本測試中，組17的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ； 下游引物：5 ' -CCAACAATACTAACTACAACACACC-3 ' ；
[0152] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0153] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5 '-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3 '
[0154] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0155] 組21的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -AGTGGCGAGATTTCGGTTTAT-3 ' ；下游引物： 5 '-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 '。
[0156] 另外，在組7、8和12的其他測試中，也取得類似的技術效果，具體來說，
[0157] 組17的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCAACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0158] 組17的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -GGGTGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0159] 組17的上下游引物序列為：上游引物:5 ' -GGGCGTGTGAAAAGATGGG-3 ' ；下游引物： 5 '-CCGACAATACTAACTACAACACACC-3 '；
[0160] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTTGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0161] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACAAACCAACACCTCCA-3,；
[0162] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGGGTCGGGTTTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACGAACCAACACCTCCA-3,；
[0163] 組18的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGGGTCGGGTGTGTTGTAG-3 ' ；下游引物： 5，-AAAACGAACCAACACCTCCA-3,；
[0164] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACGAAACTCCGTCTCA-3,；
[0165] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGTGTGGGGTTTATGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3,；
[0166] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -CGTGTGGGGTTTATGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACGAAACTCCATCTCA-3,；
[0167] 組19的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TGTGTGGGGTTTACGGAAC-3 ' ；下游引物： 5，-ACACAACAAAACTCCATCTCA-3,；
[0168] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGACGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0169] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5'-了厶1'1'了厶1'1'1'1'了6厶6厶了66厶61'1'-3'；下游引 物:5，-ACTCGAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0170] 組20的上下游引物序列為：上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGATGGAGTT-3 ' ；下游引 物:5，-ACTCAAAAAACTAAAACAAAAAAATC-3，；
[0171] 組21的上下游引物序列為:上游引物:5 ' -AGTGGCGAGATTTTGGTTTAT-3 ' ；下游引物： 5 '-AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 '。
[0172] 這些序列在測試中也取得極佳的測試效果，待測DNA樣本稀釋600倍的情況下仍然 可以檢測ZNF843基因甲基化程度。
[0173] 本
【發明內容】
僅僅舉例說明了要求保護的一些具體實施方案，其中一個或更多個技 術方案中所記載的技術特征可以與任意的一個或多個技術方案相組合，這些經組合而得到 的技術方案也在本申請保護范圍內，就像這些經組合而得到的技術方案已經在本發明公開 內容中具體記載一樣。
【主權項】
1. 一種用于結直腸癌早期診斷的無創甲基化定量檢測試劑盒；其通過實時熒光定量 PCR檢測受試者血漿或血清樣本中游離DNA的rRNA_pseudogene，HECTDl和/或ZNF843基因啟 動子區甲基化修飾變化，來輔助判斷結直腸癌的易感性或發病。2. 根據權利要求1所述的無創甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于，所述定量檢測試劑 盒是通過PCR引物及Taqman探針來完成檢測的，其包含檢測rRNA_pseudogene基因啟動子區 甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列中的任意一組或多組，具體如下： 組 1:上游引物：5 ' -GGTTTGGGATTTTAGATTTTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -AAAACCTAAAAACCTCAAATTAITT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-TTTTCGATTCGATTTTTTTGTTTTTG-BHQ1-3 ' ； 組2:上游引物:5 ' -GGAAGGGG (C/T) GGGAAAATTAT-3 ' 下游引物：5 ' -AATCCCTAAACCCTTCCCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-TCTACGCTCCCCATAAAATCCGA-BHQ1-3 ' ； 組3:上游引物:5 ' - (C/T) GGGAG (C/T) (C/T) G (C/T) AGGGAAGGGG-3 ' 下游引物:5 ' -ACCCGACAC (A/G) ACCTAAAACT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CCTCCGACCCGATCTTTCTACC-BHQ1-3 '。3. 根據權利要求1所述的無創甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于，所述定量檢測試劑 盒還包含檢測HECTDl基因啟動子區甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列 中的任意一組或多組，具體如下： 組4:上游引物：5 ' -AAAGGAATATGATGAAGGAATGTAT-3 ' 下游引物:5 ' -AAAAAAAACATACAACTAATAACCCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CAACGTAAATCGTTAITTTAAAACGTA-BHQ1-3 ' ； 組5:上游引物：5 ' -AGAATTAAATTTTTATAGTGTTTTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -CAACAACCTAATCAACTTATATACTCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-AAACACTCTTACGTCCAAACGTACT-BHQ1-3 ' ； 組6:上游引物:5 ' -AAAAAAGGAAAGGTTAAAAGTAAATG-3， 下游引物：5 ' -CCAACTACCCTATCTTATAAAACTAAA-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CATTCGTTCGAATCCGTAACCT-BHQ1-3 ' ； 組7:上游引物：5 ' -TATAAGATAGGGTAGTTGGTTAAAAAA-3 ' 下游引物：5 ' - (A/G) TAAAACCCAAAACTATCCTCC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ATCAAAACGCTTACGAAACGCTT-BHQ1-3 ' ； 組8:上游引物：5 ' -GAAGGTTTGGTAG(C/T)GAATTTT-3 ' 下游引物：5 ' - (A/G) CTAACCCCTTTATTCCCC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CGATTACCCGCGCCAAAA-BHQ1-3 ' ； 組9:上游引物：5 ' -TAGGTTGGAGTGAGGTGGTATTA-3 ' 下游引物：5 ' -ACAACATAAACCTAATCTCTACAAAAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCAAATACGATAACGCACACCT-BHQ1-3 ' ； 組 10:上游引物：5 ' -TTTTTTGTAGAGATTAGGTTTATGTTG-3 ' 下游引物：5 ' -TCCCAACACTTTATAATTTTACTCTCT-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-AACCCGAAATTCGAAACCAA-BHQ1-3 ' ； 組11:上游引物：5 ' -GGTTGTTTGAGGGATTATGTTTT-3 ' 下游引物：5 ' -ATTCTTTTCAAACTTTATTTCACAC-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-AACCCGAAAACGTCCTACTATACTC-BHQ1-3 ' ； 組 12:上游引物：5 ' -TTGAATG (C/T) GTGTGAAATAAAGTT-3 ' 下游引物:5，-CAAATAAAACACTAAAACTCCAAAAA-3， 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCAACGCCGTACCCGATC-BHQ1-3 '。4. 根據權利要求1所述的無創甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于，所述定量檢測試劑 盒還包含檢測ZNF843基因啟動子區甲基化修飾變化的核苷酸序列;所述序列選自以下序列 中的任意一組或多組，具體如下： 組 13:上游引物：5 ' -AGGGATAAAGGGTTGAGATTGT-3 ' 下游引物:5 ' -TAAAAACCACTACTTTAACCCCTAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCCGAAACACTAAACCGAACA-BHQ1-3 ' ； 組 14:上游引物：5 ' -GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTT-3 ' 下游引物：5 ' -AACGCTACGACTCACGTCTATAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCAAAACGAAAAAATCGCTTAA-BHQ1-3 ' ； 組15:上游引物：5 ' -GTGTAGATAGGATTTTATTGTTGTTTA-3 ' 下游引物:5 ' -ACCTTAAACACCTCAATACATAACC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCGAACGCTACGACTCACG-BHQ1-3 ' ； 組 16:上游引物：5 ' -TTTGAATTGTTGGATTTAATGTTAT-3 ' 下游引物:5 ' -CACACAAACATAAACACCCATCT-3 ' 熒光定量探針：5 ' -6-FAM-CACACGCCCCGTTTACTTTC-BHQ1-3 ' ； 組 17:上游引物:5 ' -GGG (C/T) GTGTGAAAAGATGGG-3 ' 下游引物：5 ' -CC (A/G) ACAATACTAACTACAACACACC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CCTCCCCCGTCCCGAAAT-BHQ1-3 ' ； 組 18:上游引物：5 ' - (C/T) GGGT (C/T) GGGTGTGTTGTAG-3 ' 下游引物:5 ' -AAAAC (A/G) AACCAACACCTCCA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CGCCTTTACGACCGACCGT-BHQ1-3 ' ； 組 19:上游引物：5 ' - (C/T) GTGTGGGGTTTA (C/T) GGAA (C/T) -3 ' 下游引物:5 ' -ACACAAC (A/G) AAACTCC (A/G)TCTCA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-CTAAACACGCGCCTCCGC-BHQ1-3 ' ； 組 20:上游引物：5 ' -TATTTATTTTTGAGA(C/T)GGAGTT-3 ' 下游引物:5 ' -ACTC (A/G) AAAAACTAAAACAAAAAAATC-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-AATAAACCGAAATCTCGCCACT-BHQ1-3 ' ； 組21:上游引物：5 ' -AGTGGCGAGATTT (C/T) GGTTTAT-3 ' 下游引物：5 ' -AAATCCCTTCTCTACTAAAAATACAAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCGAACGTAATAACGAACGC-BHQ1-3 '。5. 根據權利要求1所述的無創甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含用 于檢測ACTB基因甲基化程度的核苷酸序列，具體如下： 組 22:上游引物:5 ' -TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ' 下游引物：5 ' -AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3 ' 熒光定量探針:5 ' -6-FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ1-3 '。6. 根據權利要求1所述的無創甲基化定量檢測試劑盒，其特征在于，所述定量檢測試劑 盒還包含如下組分:2XGoldstar TaqMan Mixture、陽性對照和陰性對照。7. 權利要求1-6任一項所述試劑盒在制備用于結直腸癌早期診斷試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950723SQ201610291803
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月4日
【發明人】王紅衛, 段世偉, 鄧友平, 朱勇, 王琳
【申請人】王紅衛