一種Wnt信號通路中β-catenin基因突變檢測試劑及應用
【專利摘要】本發明公開了一種基于肽核酸探針的Wnt信號通路中β?catenin基因突變檢測的試劑、PCR檢測方法及應用，屬于基礎生物研究及生物檢測技術領域。檢測試劑包括引物、肽核酸熒光探針及野生型互補的肽核酸序列，正向引物如序列表中SEQ ID NO.1、NO.3；反向引物如序列表中SEQ ID NO.2、NO.4；肽核酸熒光探針如序列表中SEQ ID NO.5、NO.6；野生型互補肽核酸序列如序列表中SEQ ID NO.7、NO.8。本發明從轉錄水平能快速發現Wnt信號通路中β?catenin基因突變情況，具有特異性強、靈敏度高等顯著優點，為抗癌藥物篩選，新靶向藥物探討、基礎科學研究提供工具。
【專利說明】
一種Wnt信號通路中β-caten i η基因突變檢測試劑及應用
技術領域
[0001] 本發明涉及分子生物學及臨床分子診斷技術領域，特別是涉及一種基于肽核酸 (ΡΝΑ)探針的Wnt信號通路中β-catenin基因突變檢測試劑、PCR檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高 度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發育、器官形成、組織再生和其它生理過程 中，具有至關重要的作用。如果這條信號通路中的關鍵蛋白發生突變或者異常表達，導致信 號異常活化，就可能誘導癌癥的發生。Wnt信號通路包括經典的Wnt信號通路與非經典的Wnt 信號通路，在經典通路即Wnt-i3-catenin信號通路中，Wnt因子通過激活細胞膜上的 Frizzle/LRP5/6協同受體后抑制細胞內游離β-catenin蛋白的磷酸化和降解，細胞質中的 β-catenin蛋白水平升高后將發生β-catenin蛋白的核移位，導致細胞核中β-catenin蛋白 升高，胞核中β-catenin蛋白能夠聯合Pygo2、Bcl-9以及FoxMl蛋白共同與TCF/LEF-1轉錄因 子家族形成復合體并激活Wnt信號通路下游靶基因的轉錄激活。
[0003] 目前越來越多的研究已經發現，在很多腫瘤中β-catenin蛋白均呈現不同程度的 突變。
[0004] 目前研究核心信號通路的核心分子調控機制，以及某些重要成員在細胞中的表達 水平，已經成為治療腫瘤的一種關鍵手段，近年來Wnt信號通路在癌癥中的研究，以及β-catenin蛋白作為Wnt信號通路重要成員其突變水平的研究，已經成為研究開發腫瘤藥物急 需解決的重要問題，尤其是在β-catenin蛋白Arms重復結構域中發生的突變，對β-catenin 蛋白發揮功能起著非常重要的作用，例如在結直腸腺癌細胞中檢測出R225C突變，肺腺癌細 胞中檢測出V600G突變等。
[0005] 肽核酸(peptide nucleic acids，PNA)是一類以多肽骨架取代糖磷酸主鏈的DNA 類似物。它是在第一代、第二代反義試劑的基礎上，通過計算機設計構建并最終人工合成的 第三代反義試劑，是一種全新的DNA類似物，即以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基甘氨酸鍵取代 了 DNA中的戊糖磷酸二酯鍵骨架，其余的與DNA相同，PNA可以通過Watson-Crick堿基配對的 形式識別并結合DNA或RNA序列，形成穩定的雙螺旋結構。由于PNA不帶負電荷，與DNA和RNA 之間不存在靜電斥力，因而結合的穩定性和特異性都大為提高；不同于DNA或DNA、RNA間的 雜交，PNA與DNA或RNA的雜交幾乎不受雜交體系鹽濃度影響，與DNA或RNA分子的雜交能力遠 優于DNA/DNA或DNA/RNA，表現在很高的雜交穩定性、優良的特異序列識別能力、不被核酸酶 和蛋白酶水解。
[0006] 本方法采用特異序列的PNA寡聚物作為探針。由于PNA是一種人工合成的核酸的類 似物，并且為非手性、不帶電荷的分子，避免了寡核苷酸與其靶基因結合時因電荷相互排斥 所導致的雜交不穩定性，結合不易受雜交液離子強度的影響，從而顯示出極強的雜交優勢， 大大提高了檢測靈敏度。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是針對現有技術中如何確定Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變情況，以及如何解釋核心分子β-catenin在腫瘤細胞中的突變水平變化的 困難，提供了一種檢測Wnt信號通路中β-catenin基因突變檢測試劑、PCR檢測方法及應用。
[0008] 本發明的目的是提供一種用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突 變檢測的試劑，包括用于阻斷野生型β-catenin基因擴增的野生型PNA序列、用于特異性擴 增R225C、V600G突變型β-catenin基因序列的一組引物對及突變型PNA熒光探針：
[0009] 所述檢測β-catenin基因 R225C突變正向引物如序列表中SEQ ID N0.1;
[0010] 所述檢測β-catenin基因 R225C突變反向引物如序列表中SEQ ID N0.2;
[0011] 所述檢測β-catenin基因 V600G突變正向引物如序列表中SEQ ID N0.3;
[0012] 所述檢測β-catenin基因 V600G突變反向引物如序列表中SEQ ID N0.4;
[0013] 所述檢測β-catenin基因 R225C突變型PNA熒光探針如序列表中SEQ ID N0.5;
[0014] 所述檢測β-catenin基因 V600G突變型PNA熒光探針如序列表中SEQ ID N0.6;
[0015] 所述特異性結合包含β-catenin基因225密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID Ν0·7〇
[0016] 所述特異性結合包含β-catenin基因600密碼子野生型ΡΝΑ序列如序列表中SEQ ID Ν0·8〇
[0017] 修飾所述5'端的所述焚光報告基團為:FAM、HEX、TET、J0E、VIC、R0X、Cy3SCy5j_ 飾所述 3'端的淬滅基團為:TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3SDABCYL。
[0018] 本發明所述的檢測試劑還包括PCR反應液、225密碼子和600密碼子突變型參考品、 225密碼子和600密碼子野生型參考品，其中PCR反應液包括:DEPC水、具有5 ' -3 '外切活性 的DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR緩沖液、RNASIN、M-MLV逆轉錄酶、oligo(dT)和含Mg離子的溶 液。
[0019] 所述225密碼子突變型參考品為含SEQ N0.9的重組質粒DNA;
[0020] 所述225密碼子野生型參考品為含SEQ N0.10的重組質粒DNA;
[0021] 所述600密碼子突變型參考品為含SEQ N0.11的重組質粒DNA;
[0022] 所述600密碼子野生型參考品為含SEQ N0.12的重組質粒DNA;
[0023]所述具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶為Taq酶；
[0024] 所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應體系中的終濃度為：Taq酶O.OlU/μΙ~ 0 · 05υ/μ1，dNTPs 0 · 2~0 · 6mM，10 X PCR緩沖液1 X，RNASIN 4〇υ/μ1~6〇υ/μ1，M-MLV逆轉錄 酶20〇υ/μ1 ~320UAU，MgCl2 1.5~5.0mM，溶劑為 DEPC 水。
[0025] 具體地，所述正向引物的終濃度為0.05~0.9μΜ，所述反向引物的終濃度為0.05~ 0.9μΜ，所述oligo(dT)終濃度為0.05~0.9μΜ，所述互補PNA序列終濃度為0.05~0.9μΜ，所 述熒光探針的終濃度為〇. 05~0.9μΜ。
[0026] 本發明所述的試劑進行實時熒光定量PCR的反應程序為:42°C逆轉錄20min;94°C 預變性，2min; 95 °C變性，30s，58 °C，45s (收集熒光），進行40個循環。
[0027]本發明的原理是通過構建與β-catenin基因野生型互補的一段肽核酸PNA序列，當 肽核酸PNA序列與β-catenin基因互補結合時，任一突變均可導致PNA/DNA產生錯配，從而使 得溶解溫度發生改變。進而根據β-catenin基因突變型設計特異性的肽核酸PNA探針以及引 物對β-catenin突變型基因進行熒光定量PCR擴增，經過一輪的PCR擴增后，即可將β-catenin基因突變型與野生型進行區分開來。
[0028] 進一步地，本發明還提供了所述的試劑在制備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用， 所述癌細胞為結直腸腺癌、肺腺癌。
[0029] 與現有技術相比，本發明的優點和積極效果是:本發明提供了直接檢測Wnt信號通 路中β-catenin基因突變檢測的試劑，借助于所述檢測試劑能夠通過實時熒光定量PCR法在 轉錄水平快速檢測出β-catenin基因的突變，而與普通實時熒光定量PCR不同的是，本發明 設計野生型PNA序列，可有效抑制野生型基因組擴增，只富集突變型基因擴增，大大提高了 檢測特異性，我們使用的肽核酸PNA熒光探針更加靈敏，本發明為抗癌藥物的篩選，新靶向 藥物的機制研究都提供了非常有力的工具。
[0030] 同時本發明的實驗體系可以在任何一臺實時熒光定量PCR儀器上進行，上述引物 置于八聯管中，進行實時熒光定量PCR檢測，實驗操作簡單，費用低廉，結果重復性，敏感性 好，是研究腫瘤相關藥物作用機理及基礎科學研究的一種重要手段。
【附圖說明】
[0031] 圖1是本發明實施例中所述肽核酸質譜圖；
[0032] 圖2是樣本、R225C突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
[0033] 圖3是樣本、V600G突變型和野生型參考品PCR擴增圖；
【具體實施方式】
[0034]通過以下詳細說明結合附圖可以進一步理解本發明的特點和優點。所提供的實施 例僅是對本發明方法的說明，而不以任何方式限制本發明揭示的其余內容。
[0035]本發明通過結直腸腺癌細胞進行舉例說明，但是本發明不局限于結直腸腺癌細 胞，本發明所述檢測試劑還可以應用于肺腺癌。
[0036]實施例中的有關DNA和RNA基本操作均參考《分子克隆：實驗室操作指南》(金冬雁 等譯，科學出版社，北京（1998))和《精編分子生物學指南》（顏子譯，科學出版社，北京 (1998))。
[0037]本發明中SW480 (人結直腸腺癌SW480細胞系）購自美國ATCC，培養細胞所使用的 RPMI-1640培養基及10%胎牛血清均購自英俊公司，其他試劑主要購自寶生物工程(大連） 有限公司。
[0038]【實施例1】引物探針設計
[0039] 根據美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI) (http: //www. ncbi .nlm. nih · gov)報道的β-catenin mRNA序列（NCBI Reference Sequence :NM_001098209 · 1)，使用Applied Biosystems公司開發的Primer Express Software for Real-Time PCR軟件設計特異的β-catenin引物與探針。
[0040] β-catenin R225C：
[0041 ] β-catenin-F:5，-CGTTCTCCTCAGATGGTGTCTG-3，；（SEQ NO·1)
[0042] e-catenin-R:5,-ACCAGCTAAACGCACTGCC-3,；(SEQ NO.2)
[0043] 突變型0-catenin(PNA)-P:5'FAM-CCTTTCCCATCATTGTGAGG-BHQ 3'；（SEQ N0.5)
[0044] 野生型β-catenin-PNA: 5 ' -CCTTTCCCATCATCGTGAGG-3 ' ；（SEQ NO · 7)
[0045] 突變型靶序列：
[0047] 野生型靶序列：
[0049] β-catenin V600G:
[0050] 0-catenin-F:5,-AGGTTGTACCGGAGCCCTTC-3 ,；(SEQ NO.3)
[0051] 0-catenin-R:5,-GCAGCTTCCTTGTCCTGAGC-3 ,；(SEQ NO.4)
[0052] 突變型0-catenin(PNA)-P:5，FAM-ATTCCATTGTTTGGGCAGCT-BHQ 3, ；（SEQ N0.6)
[0053] 野生型β-catenin-PNA:5,-ATTCCATTGTTTGTGCAGCT-3，；（SEQ NO.8)
[0054] 突變型靶序列：
[0056] 野生型靶序列：
[0058] 以上:F:forward，正向；β-catenin-F表示用于檢測核酸的正向引物。
[0059] R:reverse，反向；β-catenin-R表示用于檢測核酸的反向引物。
[0060] P:pr〇be，熒光探針;β-catenin-P表示用于檢測核酸的熒光探針，該熒光探針為 TaqMan熒光探針。
[0061 ]在本發明實施例中，修飾熒光探針的5 '端的熒光報告基團可以為:FAM，HEX，TET， 了(^，￥1(：，1?(^，073或075;修飾熒光探針的3'端的淬滅基團可以為4411^4(31丨？86,8即1， BHQ2，BHQ3或DABCYL，該熒光報告基團與淬滅基團不影響熒光定量PCR的擴增，只需根據探 針的熒光報告基團和淬滅基團選擇所用的儀器的型號設置可檢測的熒光信號范圍。本發明 實施例提供的熒光探針熒光報告基團：FAM、HEX、TET和FAM的激發波長為470-650nm，接收波 長為500-700nm;淬滅基團:Eclipse、TAMRA、BHQl。引物合成后的純化方式可以為:HAP、PAGE 和HPLC純化方式。
[0062]【實施例2】構建含有β-catenin基因突變型和野生型的DNA片段的重組質粒一、人 結直腸腺癌SW480細胞系培養與傳代 [0063] 1)細胞培養
[0064] 所有細胞系使用RPMI-1640培養基（Invitrogen，Carlsbad，CA)，10 % 胎牛血清 (Invitrogen,Carlsbad,CA)，于37°C、5%C〇2環境下培養。
[0065] 2)細胞傳代
[0066]首先使用滅菌吸管將細胞培養皿中的培養液吸出，加入PBS緩沖液清洗2遍，往細 胞中慢慢滴加適量胰蛋白酶，待細胞變圓，調整角度細胞能夠移動后加入3ml的含10%胎牛 血清的DMEM培養基，反復輕輕吹打后，顯微鏡下觀察細胞形態并計數，根據培養皿中細胞的 含量將適量的細胞傳代至其他滅菌的培養皿中，加入5ml的DMEM培養基后放入5%C0 2培養 箱。
[0067] 細胞計數公式(個/ml): (4大格細胞總數）X 104X稀釋倍數/4
[0068] 二、總RNA的提取
[0069] 1)倒掉培養基，PBS清洗后，直接將lml Trizol注入培養瓶（其中細胞5X106個/ ml)，反復抽吸均勻；
[0070] 2)在裝有裂解物的離心管中加入0.2ml的氯仿(為Trizol總體積的1/5 )，振蕩混均 30秒，室溫下靜置5分鐘；
[0071] 3)12000rpm 4°C離心15分鐘，分相為三層。上層：RNA(約為Trizol的60%);中間： DNA;下層:蛋白質(酸-氯仿）；
[0072] 4)小心吸取上清液，轉移到另一 EP管中。lml裂解物產生的上清液體積約為0.4~ 0.6ml。有機相和中間層含有DNA和蛋白質，避免觸及；
[0073] 5)上清液加入約0.5ml的異丙醇，振蕩混均30秒。室溫下靜置10分鐘；
[0074] 6)12000rpm 4°C離心 10分鐘；
[0075] 7 )RNA沉淀將在離心底的側面形成。小心吸棄上清液，注意避免吸棄RNA沉淀；
[0076] 8)離心管加入lml預冷的75%乙醇（lml Trizol至少lml乙醇清洗DNA)，振蕩混均 30秒，使沉淀振蕩起來，室溫12000rpm離心1~2分鐘。盡可能吸棄上清液，防止RNA沉淀丟 失。重復以上清洗步驟一次。在75 %乙醇中，RNA在4 °C至少保存1周，一 20 °C至少保存1年；
[0077] 9)室溫選擇流動性小，倒置離心管于濾紙上，干燥RNA，但不能完全干燥（5~10分 鐘）。用DEPC水15μ1溶解沉淀，55-60°C孵育10~15分鐘。
[0078] 10)RNA純度檢測
[0079] 滴加2μ1 RNA溶液于超微量分光光度計（型號：P330-311)，并讀取儀器中0D260/ 0D280比值。
[0080] 三、構建重組質粒
[0081 ] 1)將含有β-catenin基因突變型和野生型的DNA片段進行PCR擴增；
[0082] 2)將PCR產物進行雙酶切；
[0083]載體和PCR產物分別用一下條件進行雙酶切（反應體系均為30μ1，37Γ，酶切2小 時）；
[0084] 3)將雙酶切產物電泳后割膠回收(按照試劑盒說明書進行操作）；
[0085] 4)將酶切產物與質粒載體進行連接；
[0086] 上述雙酶切產物經過純化(其中載體酶切產物割膠回收，PCR片段酶切后純化步驟 與上述PCR產物純化步驟相同），在T4DNA連接酶作用下16°C連接過夜。連接體系如下:載體， 2yl;PCR片段，6μ1;10χΤ4 buffer，1μ1;Τ4 DNA ligase，lyl〇
[0087] 5)轉化大腸桿菌感受態；
[0088]取上述連接液5μ1轉化到預先制備的DH5a化學感受態細胞中，冰浴30分鐘，42°C熱 激2min，置冰上5min，加入lmlLB培養液37°C搖床45min，離心5000rpm，l_5min(不要離心太 久，以免太實），最后均勻涂布在含有l〇〇ng/ml抗生素的LB平板上（100-150μ1)。將平板在37 °C倒置培養過夜。挑取陽性克隆菌落轉劃到另一塊含有100ng/ml抗生素的LB平板上，并對 之進行編號，37°C倒置培養過夜。
[0089] 6)QIAGEN試劑盒抽提質粒(按照說明書進行），制成參考品。
[0090] 【實施例3】實時熒光定量PCR法擴增樣本
[0091] 取提取的總RNAl-5yg，加入PCR反應液，PCR反應液包括:無菌水、具有5 ' -3 '外切 活性的DNA聚合酶、dNTPs、10 X PCR Buff er、RNASIN、M-MLV逆轉錄酶、〇1 igo(dT)和含Mg離子 的溶液。其中，濃度為5UAU的具有5'-3'外切活性的DNA聚合酶0.3μ1，濃度為10mm〇l/L的 dNTPs 2yl，10XPCR Buffer 5μ1，濃度為4〇υ/μ1 的RNASIN 0·6μ1，濃度為20〇υ/μ1 的M-MLV 逆轉錄酶0.6μ1，濃度為25mmol/L的MgCl2溶液5μ1，添加無菌水至體積為50μ1。其中，具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶可以為Taq酶。
[0092] PCR擴增:將各反應管放入熒光定量PCR儀器的反應槽內，設置標記熒光基團種類、 樣品名稱及類型，選擇要用的Taqman熒光探針(本產品熒光報告基團為FAM、HEX、TATj* 淬滅基團為Eclipse)，定義樣品孔，并按下表提供的擴增程序進行PCR擴增：
[0093]表1為PCR擴增反應擴增程序
[0094]
[0095]在擴增程序的第三步的終了讀取熒光值；
[0096]數據分析判斷：
[0097]同時選定所檢樣本與該樣本檢測位點對應的突變型和野生型參考品孔，對比三孔 PCR擴增曲線(CTa表示樣本孔CT值，CIV表示野生型CT值，CTm表示突變型CT值）：
[0098] 當CTm彡CTa<CTw時，表明該樣本存在突變；
[0099] 當CTw=CTa時，表明該樣本為野生型。
[0100]圖1是本發明實施例中所述肽核酸質譜圖；
[0101 ]圖2是本發明實施例中所述R225C突變型和野生型參考品PCR擴增圖，圖中上、中、 下三條線各表示β-catenin第225位密碼子突變型參考品、樣本以及野生型參考品的擴增曲 線；
[0102] 圖3是本發明實施例中所述V600G突變型和野生型參考品PCR擴增圖，圖中上、中、 下三條線各表示β-catenin第600位密碼子突變型參考品、樣本以及野生型參考品的擴增曲 線；
[0103] 以上實施例僅用來說明本發明的技術方案，而非對其進行限制，盡管參照前述實 施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施 例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換，而這些修改或者 替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變檢測的試劑，其特征在 于，包括用于阻斷野生型β-catenin基因擴增的野生型PNA序列、用于特異性擴增R225C、 V600G突變型β-catenin基因序列的一組引物對及突變型PNA熒光探針： 所述檢測β-catenin基因 R225C突變正向引物如序列表中SEQ ID N0.1; 所述檢測β-catenin基因 R225C突變反向引物如序列表中SEQ ID N0.2; 所述檢測β-catenin基因 V600G突變正向引物如序列表中SEQ ID N0.3; 所述檢測β-catenin基因 V600G突變反向引物如序列表中SEQ ID N0.4; 所述檢測β-catenin基因 R225C突變型PNA熒光探針如序列表中SEQ ID N0.5; 所述檢測β-catenin基因 V600G突變型PNA熒光探針如序列表中SEQ ID N0.6; 所述特異性結合包含β-catenin基因225密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.7； 所述特異性結合包含β-catenin基因600密碼子野生型PNA序列如序列表中SEQ ID NO.8； 修飾所述5 '端的所述熒光報告基團為:FAM、HEX、TET、JOE、VIC、ROX、Cy 3或Cy 5，修飾所 述3'端的淬滅基團為：TAMRA、Eclipse、BHQl、BHQ2、BHQ3SDABCYL。2. 根據權利要求1所述的用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變檢測 的試劑，其特征在于，所述的檢測試劑還包括PCR反應液、225密碼子和600密碼子突變型參 考品、225密碼子和600密碼子野生型參考品；其中PCR反應液包括:DEPC水、具有5'-3'外切 活性的DNA聚合酶、dNTPs、10XPCR緩沖液、RNASIN、M-MLV逆轉錄酶、oligo(dT)和含Mg離子 的溶液;所述225密碼子突變型參考品為含SEQ NO.9的重組質粒DNA;所述225密碼子野生型 參考品為含SEQ NO. 10的重組質粒DNA;所述600密碼子突變型參考品為含SEQ NO. 11的重組 質粒DNA;所述600密碼子野生型參考品為含SEQ NO. 12的重組質粒DNA。3. 根據權利要求2所述的用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變檢測 的試劑，其特征在于，所述具有5 ' -3 '外切活性的DNA聚合酶為Taq酶。4. 根據權利要求3所述的用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變檢測 的試劑，其特征在于，所述PCR反應液各組分在PCR擴增反應體系中的終濃度為：Taq酶 0 · OlU/μΙ~0 · 05υ/μ1，dNTPs 0 · 2~0 · 6mM，10 X PCR緩沖液I X，RNASIN 4〇υ/μ1~6〇υ/μ1，M-MLV逆轉錄酶200U/μl~320U/μl，MgCl2l.5~5.0mM，溶劑為DEPC水;所述正向引物的終濃 度為0.05~0.9μΜ，所述反向引物的終濃度為0.05~0.9μΜ，所述oligo(dT)終濃度為0.05~ 0.9μΜ，所述互補PNA序列終濃度為0.05~0.9μΜ，所述熒光探針的終濃度為0.05~0.9μΜ。5. 根據權利要求1-4所述的用于Wnt信號通路中核心的信號分子β-catenin基因突變檢 測的試劑，其特征在于，所述的試劑進行實時熒光定量PCR的反應程序為：42°C逆轉錄 20min; 94°C預變性，2min; 95°C變性，30s，58°C，45s，此時收集熒光，進行40個循環。6. 權利要求1-5所述的試劑在制備檢測癌細胞的檢測試劑中的應用，所述癌細胞為結 直腸腺癌、肺腺癌。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950720SQ201610279215
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月29日
【發明人】唐景峰, 周策凡, 陳興珍, 張毅, 秦文英
【申請人】湖北工業大學