一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法、組合物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種阿膠膠液半成品及成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法、組合物及試劑盒，屬于分子生物學技術領域，該方法為根據驢和牛看家基因單拷貝基因，設計驢和牛通用引物及驢和牛特異性探針，提取待測樣品DNA，采用TaqMan qPCR的方法對阿膠膠液半成品或成品進行驢源或牛源成分定量檢測，根據標準曲線和待測樣本的Ct值計算阿膠膠液單位質量中驢和牛源核基因的拷貝數，計算出阿膠中驢源和牛源所占比例，進而對阿膠樣品驢源或牛源成分定量，本發明的方法、組合物及試劑盒檢測特異性好、靈敏度強、不僅實現阿膠中驢源和牛源定性檢測，還可以實現定量分析，為阿膠企業質量把控提供技術推廣和應用。
【專利說明】
一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方 法、組合物及試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種阿膠膠液及成品中動物源性成分定量檢測方法，具體涉及一種阿 膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法、組合物及試劑盒，屬于分子生物學
技術領域。
【背景技術】
[0002] 阿膠為馬科動物驢的皮，經煎煮、濃縮制成的固體膠，原產自山東省泛東阿區，始 載于《神農本草經》，與人參、鹿茸并稱為"滋補三寶"，至今已有近三千年歷史。阿膠補血圣 藥，味甘平，入肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用，長期服用可補血養 血、美白養顏、抗衰老、抗疲勞、提高免疫力，適用人群廣泛。李時珍著《本草綱目》載："阿膠 《本經》上品。
[0003] 2015版《中國藥典》明確規定阿膠為馬科動物驢(Equus animus L.)的皮經去毛、 煎煮并佐以黃酒、豆油、冰糖熬制而成。然而隨著膠類市場的不斷發展，隨著熬膠原料供應 的緊張和原料價格上漲，一些驢皮供應商拿廉價馬皮、騾子皮甚至牛皮下腳料、豬皮冒充驢 皮，摻假手段高明，有的甚至將驢耳朵縫制馬皮上等變成驢皮的特征來冒充驢皮，成為企業 原料質量把控的一大難題，或多或少會摻入牛皮等無意摻假現象在所難免，作為阿膠生產 企業更加迫切需要阿膠整個生產過程的質量把控，不讓牛皮摻入阿膠中，生產純正的驢皮 源阿膠，這就要求發展更加可行、靈敏的檢測技術來滿足阿膠生產企業及監管部門質量控 制與監管的需求。
[0004] 隨著分子生物學技術的發展，一些基于DNA的生物學鑒定手段逐漸豐富起來，DNA 分子法主要是利用顯示生物特征的各種生物物種所具有的不同DNA序列信息進行鑒別，它 可以突破依據感官檢測的局限性，與傳統分析方法相比，更加具有客觀性和準確性。以聚合 酶鏈式反應(PCR)為基礎的技術已逐步成為了食品藥品中動物源性成分種屬鑒定的核心方 法。近年來實時熒光PCR技術的飛速發展大大提高了檢測的靈敏度、特異性和準確性，并使 得成分含量的定量溯源成為可能，由于熒光定量整個檢測過程為閉管操作，所以有效的減 少了實驗過程中的污染的危險，目前廣泛應用于各個領域。
[0005] 近年來隨著阿膠摻假現象不斷被媒體曝光，逐漸引起科研工作者的重視，國內外 科研機構及阿膠企業開展了大量利用分子生物學技術手段鑒定驢皮、馬皮真偽鑒定的科學 研究工作，專利授權號為(CN.104046700B)利用qPCR技術解決了快速鑒別驢皮、馬皮、驢騾 及馬騾皮的技術難題，專利(CN201510018058.3)公開了阿膠中驢、馬、豬及牛源性多重實時 熒光PCR檢測方法，專利(CN 201510403781.3)利用巢式PCR技術鑒別阿膠真偽，但都是針對 阿膠成品的真偽利用線粒體為靶基因進行定性檢測，由于線粒體基因在所有的動物不同組 織細胞中拷貝數不同而不能量化，無法區分阿膠中是污染還是有意摻假，更不能知曉摻假 比例，因此，阿膠摻假量化研究十分必要。而基于DNA檢測技術的阿膠中驢源和牛源成分量 化分析方法研究目前在國內外還尚未報道。
【發明內容】
[0006] 為解決上述技術問題，本發明提供一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分 的定量檢測方法、組合物及試劑盒，該方法、組合物及試劑盒檢測特異性好、靈敏度強、不僅 實現阿膠中驢源和牛源定性檢測，可以實現定量分析，為阿膠企業質量把控技術推廣應用。
[0007] 為實現上述目的，本發明的技術方案為：
[0008] 一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，根據驢和牛看家 基因單拷貝基因，設計引物及探針，提取待測樣品DNA，采用TaqMan qPCR的方法對阿膠膠液 半成品或成品進行驢源或牛源成分定量檢測，根據標準曲線和待測樣本的Ct值計算阿膠膠 液單位質量中驢和牛源核基因的拷貝數，計算出阿膠中驢源和牛源所占比例，進而定量。
[0009] 本發明還具有以下附加技術特征：
[0010] 進一步的，采集阿膠膠液樣本，根據阿膠現代加工工藝流程，在阿膠生產的不同階 段化皮后和膠汁分離階段取樣200ml，利用專利CN. 201410317118阿膠DNA提取技術提取核 酸DNA。經實驗證明阿膠在化皮后和膠汁分離階段所提取的核酸DNA完整性好。利用基因信 息學技術尋找驢和牛的單拷貝基因，設計特異引物及特異性探針，采用TaqMan qPCR的方法 對阿膠中進行驢源和牛源成分定量檢測，根據標準曲線和待測樣本的Ct值計算阿膠單位體 積中驢和牛源核基因的拷貝數，推算出阿膠中驢源和牛源所占比例，進而達到定量的目的。 [0011]優選的，所述待測樣品為阿膠生產過程中化皮和膠汁分離階段的樣品。
[0012]優選的，所述看家基因為驢和牛的特征基因 LHB基因。
[0013]優選的，包括以下引物、探針，序列分別如下：
[0014] (1)驢特異引物：
[0015] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 · 1所示；
[0016] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 · 2所示；
[0017] (2)驢特異探針：
[0018] Equus asinus-Probe: 5，-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3，，如SEQ N0 · 3所示；
[0019] ⑶牛特異引物：
[0020] NF: 5，-CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3，，如SEQ N0 · 4所示；
[0021 ] NR: 5，-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0022] (4)牛特異探針：
[0023] Bovine-Probe: 5，-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3，，如SEQ N0· 6所示；
[0024] 其中，所述驢、牛特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述 報告基團為FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一種，所述淬滅基團為Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一種。
[0025]優選的，驢特異探針：
[0026] Equus asinus-Probe:5'FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所示； [0027] 牛特異探針：
[0028] Bovine-Probe: 5，J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2-3，，如SEQ N0 · 3所示。
[0029] 優選的，所述提取阿膠樣品DNA為使用專利號為CN. 201410317118.7的專利公開的 方法提取。
[0030] 優選的，所述標準曲線的制作具體為:將驢和牛的目標靶基因分別克隆到PMD18-T 載體中，通過測序篩選陽性克隆，分別取已知濃度的驢、牛陽性克隆質粒作為標準樣，按照 10倍體積梯度稀釋作為標準模板，標準模板與待測樣品DNA同時進行定量PCR擴增，反應結 束后，根據各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒光定量PCR標準曲線；
[0031] 其中驢目標靶基因序列為：
[0033]其中牛目標靶基因序列為：
[0035] 優選的，所述PCR擴增體系為:含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，驢特異探針0.25 μΜ，牛特異探針0.4μΜ，驢特異性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8yM，R0X參比熒光（50 X )0.4μ1，待測樣本總DNA2yl，用雙蒸水補足20μ1反應體系；所述 PCR擴增條件為:95 °C lOmin; 95 °C 10s，63 °C，35s，在此收集熒光信號，45個循環。
[0036] 優選的，所述PCR擴增階段反應需在至少2通道型號的熒光定量PCR儀上進行。
[0037] 本發明另提供一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測引物、探 針組合物，包括以下引物、探針：
[0038] (1)驢特異引物：
[0039] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ N0 · 1所示；
[0040] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如SEQ N0 · 2所示；
[0041 ] (2)驢特異探針：
[0042] Equus asinus-Probe: 5，-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3，，如SEQ N0 · 3所示；
[0043] (3)牛特異引物：
[0044] NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ N0 · 4所示；
[0045] NR: 5，-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3，，如SEQ N0 · 5所示；
[0046] (4)牛特異探針：
[0047] Bovine-Probe: 5，-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3，，如SEQ N0 · 6所示；
[0048] 其中，所述驢、牛特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述 報告基團為FAM、HEX、TAMRA、R0X、CY5中的任一種，所述淬滅基團為Dab cy 1、BHQ1、BHQ2中的 任一種。
[0049] 優選的，驢特異探針：
[0050] Equus asinus-Probe:5'FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3,，如SEQ N0.3所示；
[0051 ] 牛特異探針：
[0052] Bovine-Probe:5,J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2-3,，如SEQ N0.3所示。
[0053] 本發明還一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測試劑盒，包括 上述引物、探針組合物以及熒光PCR反應所需試劑。
[0054] 優選的，所述PCR擴增體系為:含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，驢特異探針0.25 μΜ，牛特異探針0.4μΜ，驢特異性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8yM，R0X參比熒光（50 X )0.4μ1，待測樣本總DNA2yl，用雙蒸水補足20μ1反應體系；所述 PCR擴增條件為:95 °C lOmin; 95 °C 10s，63 °C，35s，在此收集熒光信號，45個循環。
[0055] 具體的，一種阿膠膠液中驢、牛源性成分的實時熒光定量PCR量化檢測方法，其步 驟如下：
[0056] (1)驢和牛特異基因的引物、探針設計。本發明通過比對驢和牛的特征基因序列， 設計驢特異性引物和牛特異性引物以及各自特異性探針。基于阿膠高溫炮制降解為DNA小 片段情況，本發明采用Mini-qPCR技術，PCR擴增片段長度范圍在70~200bp左右，大大提高 了檢測成功率。本發明提供引物及探針序列如下：
[0057]驢特異引物：
[0058] 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 ' ；
[0059] 下游引物LVR: 5 ' -CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 ' ；
[0060] 驢特異探針：
[0061] Equus asinus-Probe:5，FAM-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-BHQ2 3，
[0062] 牛特異引物(5'->3，）
[0063] NF:5 '-CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG 3 '
[0064] NR:5 '-CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '
[0065] 牛特異探針：
[0066] Bovine-Probe:5，J0E-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-BHQ2 3，
[0067]上述2種特異探針的5'端熒光修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團。所述報告基 團可以為?六1、冊乂、了六11^、1?(^丄￥5等，所述淬滅基團可以為〇31^71、8即1、8即2等。
[0068] (3)本發明提供了一種阿膠取樣方法。根據阿膠現代加工工藝流程，在化皮后和膠 汁分離階段取樣200ml，利用專利CN. 201410317118.7阿膠DNA提取技術提取核酸DNA，其方 法在專利201410317118.7中有詳細的記載，在此不再贅述。經實驗證明阿膠在化皮后和膠 汁分離階段所提取的核酸DNA完整性好。
[0069] (4)本發明優先選用20μ1的實時熒光多重PCR擴增體系，含TaqMan reaction Mix (2Χ)10μ1,驢探針E asinus-P 0.25μΜ,牛探針Bovine-P 0.4μΜ,驢特異性正反向引物LVF/ LVR0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8μΜ，R0X參比熒光（50 X ) 0.4μ1，待測樣本總DNA2y 1，用雙蒸水補足20μ1反應體系。陰性模板對照加無菌雙蒸水。
[0070] (5)本發明優先選用？0財廣增條件:？0財廣增條件為：95°(：1〇1^11;95°(：1〇8,63°(：， 35s，在此收集熒光信號，45個循環。
[0071] (6)標準曲線的制作：將驢和牛的目標靶基因分別克隆至PMD18-T載體中，通過測 序篩選陽性克隆，分別取已知濃度的驢、牛陽性克隆質粒作為標準樣，按照10倍體積梯度稀 釋作為標準模板（10 8104拷貝/μL)。依照上述熒光定量PCR體系和PCR擴增條件(步驟4和5) 與待測樣本同時進行定量PCR擴增。反應結束后，根據各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒 光定量PCR標準曲線。
[0072] (7)根據待測樣本的Ct值和標準曲線計算樣本中含驢源和牛源基因拷貝數，進而 推算驢源和牛源所占百分含量。
[0073]上述所涉及到的引物探針全部為本發明所設計，并在上海生工生物工程股份有限 公司合成。上述多重實時熒光定量PCR檢測步驟中，進行PCR擴增時，擴增階段反應需在至少 2通道型號的熒光定量PCR儀上進行，根據不同型號的定量PCR儀的要求對標記熒光素進行 相應的調整。
[0074] 有益效果：
[0075] 本發明有益效果在于:本發明公開了一種阿膠膠液中驢、牛源性成分的實時熒光 定量PCR量化檢測方法，其創新性在于：
[0076] (1)本發明創造性的選取了阿膠生產過程中化皮和膠汁分離階段取樣，克服了由 于阿膠成品經過長時間高溫炮制導致DNA降解而提取困難不完整的難題；
[0077] (2)本發明利用基因信息學技術分析尋找驢和牛的基因組單拷貝看家基因，并設 計特異引物和探針，通過繪制標準曲線和確立基因質量比系數，實現對阿膠中摻有牛源成 分的比例進行定量檢測。
[0078] (3)本發明在阿膠生產加工質量監控及監管部門監管中具有很高的應用價值。
[0079] (4)本發明的所使用的引物、探針組合物特異性強，靈敏度好，能夠有效實現阿膠 膠液動物源成分的定量檢測。
[0080] (5)本發明的方法重復性好、特異性強、準確度高、通量大、使用方便、耗時短3小時 之內可完成檢測。
【附圖說明】
[0081 ]圖1.為阿膠不同生產階段提取的DNA瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0082]圖2.阿膠膠液PCR擴增結果瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0083] 圖3.驢和牛特征核酸同源性BLAST分析圖。
[0084] 圖4.驢源牛源特征基因與其他物種基因序列同源性比對圖。
[0085] 圖 5.為驢源的標準曲線擴增圖，y5戶=-3.702x+29.702(Eff % =86.265，R2 = 0·998)〇
[0086] 圖6.為驢源的DNA標準品不同梯度濃度的擴增曲線圖。
[0087] 圖7.為牛源的標準曲線擴增圖，y 牛=-3.58x+31.38(Eff%=90.238，R2 = 0.998)。
[0088] 圖8.為牛源的DNA標準品不同梯度濃度的擴增曲線圖。
[0089] 圖9.為驢源和牛源靈敏度定量檢測圖，定量檢測限為0.5%。
【具體實施方式】
[0090] 以下結合具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應該理解為對本發明的限 制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換， 均屬于本發明的范圍。除非特別說明，本發明采用的除引物、探針之外的試劑、方法和設備 為本領域常規試劑、方法和設備。除非特別說明，本發明使用的試劑和試劑盒均為市購。 [0091 ] 1.下列實施例中，所用實驗材料、試劑與儀器如下：
[0092] 實驗材料：
[0093] 牛、豬、驢、馬、駱駝、牦牛、山羊、綿羊、兔、魚、雞、鴨、狗、水貂及狐貍等動物皮張或 新鮮組織，阿膠同一批次不同生產階段，同一生產階段不同批次的樣本共30份，均購自濟南 市。
[0094]所用試劑：
[0095] 動物組織提取試劑盒為OMEGA品牌。DNA分子量MakerDLlOOO、電泳上樣緩沖液等 PCR反應試劑購自寶生物工程(大連)有限公司。引物與探針由生工生物工程(上海)有限公 司負責合成。2 XTaqMan Master Mix為DBI Bioscience品牌。DNA測序由山東省農業科學院 生物技術中心測序中心完成。
[0096] 所用儀器:ABI 7500熒光定量PCR儀為ABI公司產品，Takara PCR儀為寶生物工程 (大連)有限公司產品。5424D型高速離心機為Eppendorf公司產品。
[0097] 實施例1
[0098] (l)DNA提取:本發明提供了一種阿膠取樣方法。根據阿膠現代加工工藝流程，在化 皮、膠汁分離、撤沫提雜雙效后、濃縮階段、凝膠成膠膏階段及加工成品阿膠取樣200ml (l〇〇g)，利用專利CN. 201410317118阿膠DNA提取技術提取核酸DNA。經實驗證明阿膠在化皮 后、膠汁分離階段、雙效前和濃縮前所提取的核酸DNA相對完整度好，進入濃縮后和加輔料 時期DNA已降解為小片段，膠膏時期（已接近成品阿膠)DNA已成彌散條帶，相對前期已降解 嚴重，見圖1，對濃縮后和加輔料及膠膏時期的樣本提取DNA并用不同擴增片段長度的引物 對進行擴增，阿膠膠液DNA提取及擴增瓊脂糖凝膠電泳圖見【附圖說明】圖2，結果顯示濃縮后 和加輔料及膠膏200bp范圍的小片段基因均可以得到很好擴增，但750bp大小的片段除濃縮 階段前能擴出來，加輔料前加輔料后及膠膏成品階段均擴增不出條帶。
[0099] (2)驢或牛內標準基因的篩選與獲得：分別進Aftp://ftp.ensembl .org/pub/ release_84/fasta/equus_caballus/和ftp://ftp·ensembl·org/pub/release_84/fasta/ bos_taurus/目錄下，分別下載cdna、ncma和pep下級文件內的文件，解壓后合并cDNA列表和 ncRNA列表生成核酸序列文件，作為牛和驢基因核酸序列信息庫(驢全基因組信息還未公布 只能借鑒馬的全基因組信息），服務器本地BLASTn運行，按照E值和identity篩選，篩選得到 牛物種內同其他物種在核酸水平及蛋白質水平比對同源性小的目標序列。通過篩選結合文 獻查找最終找到驢和牛的特征基因，該基因據文獻報道為單拷貝基因。通過BLAST分析驢和 牛特征核酸同源性85%。見【附圖說明】圖3和圖4.
[0100] (3)驢和牛特異基因的引物、探針設計:本發明通過比對驢和牛的特征基因序列， 分別設計驢和牛特異引物以及各自特異性探針。基于阿膠高溫炮制降解為DNA小片段情況， 本發明采用Mini-qPCR技術，PCR擴增片段長度范圍100~200bp左右，大大提高了檢測成功 率。本發明提供引物及探針序列如下：
[0101]表1引物及探針序列信息
[0103] (4)阿膠中牛源性、驢源性成分的定量檢測:選用20μ1的實時熒光多重PCR擴增體 系，含TaqMan reaction Μ?χ(2χ)10μ1，Ε asinus-P 0.25yM，Bovine_P 0·3μΜ,驢特異性正 反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8Mm，R0X參比熒光（50χ)0.4μ1，待 測樣本總DNA2yl，用雙蒸水補足20μ1反應體系。陰性模板對照加無菌雙蒸水。20μ1反應體系 見表2.
[0104] 表2 20ylPCR反應體系
[0106] (5)本發明優先選用PCR擴增條件:PCR擴增條件為:95°C3min;95°C10s，63°C，35s， 在此收集熒光信號，45個循環。
[0107] (6)標準曲線的制作：將驢和牛的目標靶基因分別克隆的PMD18-T載體中，通過測 序篩選陽性克隆，分別取已知濃度的驢、牛陽性克隆質粒作為標準樣，按照10倍體積梯度稀 釋作為標準模板（10 8104拷貝/μL)。依照上述熒光定量PCR體系和PCR擴增條件(步驟4和5) 與待測樣本同時進行定量PCR擴增。反應結束后，根據各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒 光定量PCR標準曲線。根據待測樣本的Ct值和標準曲線按照數學公式計算樣本中含驢源和 牛源基因拷貝數，進而推算驢源和牛源所占百分含量。
[0108] (7)阿膠樣品中驢源和牛源百分比含量計算:標準曲線的計算公式:y驢=-3.702x+ 29.702江€€%=86.265，1?2 = 0.998)，驢的標準曲線見圖5，擴增曲線圖見圖6;7牛=-3.581+ 31.38(Eff % =90.238，R2 = 0.998)牛的標準曲線見圖7,擴增曲線圖見圖8。通過標準曲線 及待測樣本ct值即可計算出待測樣本含有驢源性及牛源性拷貝數。
[0109] 實施例2特異性驗證
[0110] 利用所設計的引物及探針，分別以牛、豬、馬、驢、騾子、山羊、綿羊、兔、魚、雞、鴨、 狗、駱駝、水貂及狐貍等動物的總基因組DNA為模板，進行實時熒光定量PCR檢測，驗證引物 及探針的特異性。其結果見表3,結果表明本發明所設計的引物及探針具有很強的特異性。
[0111] 表3特異性驗證實驗
[0114] 實施例3靈敏度實驗
[0115] 按照驢皮中摻入1%。，5%〇，1 %，5 %，10 %，20 %，50 %的牛皮混勻（質量比），提取 DNA，進行實時熒光定量PCR檢測，評估本發明的檢測限，見【附圖說明】圖9,結果表明本方法定 量檢測限為0.5%，說明本發明所提供的方法具有很高的靈敏度。
[0116] 實施例4模擬摻假定量檢測
[0117] 按照驢皮中摻入0 %、1%、2 %、5 %、10 %、20 %、50 %和100 %的比例摻入牛皮，按 照本專利所述定量方法進行定量檢測，設5個平行試驗，結果見表4，結果顯示含有牛源成分 越低如1 %，2%、5%定量相對誤差值越大，隨著牛皮源百分比含量的增加如10%、20%、 50%相對誤差減小，造成誤差的原因可能是操作誤差或檢測誤差造成，結果證明但基本符 合實際摻假比例情況，驗證了本發明的定量方法的可行性。
[0118] 表4混合樣本驢和牛源成分定量檢測
[0121]實施例5阿膠膠液樣品的定量檢測
[0122] 按照不同的摻入比例，驢皮中摻入0%，5%，10%，20%，50%的牛皮進行實驗室階 段的熬制，完全按照生產過程進行模擬，在化皮階段取樣，該步驟由山東國膠堂阿膠藥業有 限公司提供供試樣本，由本實驗室以未知樣本處理，提取DNA，每個樣品設5個平行試驗，通 過標準曲線法對阿膠中驢、牛源性進行定量分析，實驗結果見表5,結果表明牛皮實際摻入 比例與定量檢測結果基本一致，進一步驗證了本發明的定量方法的可行性。
[0123] 表5阿膠膠液樣本定量檢測
[0124]
[0125] 上述雖然結合實施例對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發明保護 范圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員 不需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍以內。
【主權項】
1. 一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其特征在于，根據驢 和牛看家基因單拷貝基因，設計引物及探針，提取待測樣品DNA，采用TaqMan qPCR的方法對 阿膠膠液半成品或成品進行驢源或牛源成分定量檢測，使用梯度濃度的目標靶基因作為標 準模板，PCR擴增后制作標準曲線，根據標準曲線和待測樣本的Ct值計算阿膠膠液單位質量 中驢和牛源核基因的拷貝數，計算出阿膠中驢源和牛源所占比例，進而定量。2. 根據權利要求1所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其 特征在于，所述看家基因為驢和牛的特征基因 LHB基因。3. 根據權利要求1所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其 特征在于，包括以下引物、探針，序列分別如下： (1) 驢特異引物： 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； 下游引物LVR: 5 '-CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO. 2所示； (2) 驢特異探針： Equus asinus-Probe: 5 '-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3 '，如SEQ NO· 3所示； (3) 牛特異引物： NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ NO · 4所示； NR: 5 ' -CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '，如 SEQ NO · 5所示； (4) 牛特異探針： Bovine-Probe: 5 '-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3 '，如SEQ NO · 6所示； 其中，所述驢、牛特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告 基團為?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一 種。4. 根據權利要求1所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其 特征在于，所述提取阿膠樣品DNA為使用專利號為CN. 201410317118.7的專利公開的方法提 取。5. 根據權利要求1所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其 特征在于，所述標準曲線的制作具體為:將驢和牛的目標靶基因分別克隆到PMD18-T載體 中，通過測序篩選陽性克隆，分別取已知濃度的驢、牛陽性克隆質粒作為標準樣，按照10倍 體積梯度稀釋作為標準模板，標準模板與待測樣品DNA同時進行定量PCR擴增，反應結束后， 根據各個濃度梯度的Ct值和濃度值繪制熒光定量PCR標準曲線。6. 根據權利要求5所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方法，其 特征在于，所述PCR擴增體系為:含TaqMan reaction Mix(2x) 10μ1，驢特異探針0.25μΜ，牛 特異探針〇. 4μΜ，驢特異性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8μΜ， ROX參比熒光（50 X )0.4μ1，待測樣本總DNA2yl，用雙蒸水補足20μ1反應體系;所述PCR擴增 條件為:95°C10min;95°C10s，63°C，35s，在此收集熒光信號，45個循環。7. 根據權利要求5或6所述的阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測方 法，其特征在于，所述PCR擴增階段反應需在至少2通道型號的熒光定量PCR儀上進行。8. -種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測引物、探針組合物，其特征 在于，包括以下引物、探針： (1) 驢特異引物： 上游引物LVF: 5 ' -TGGACCCCATGGTCTCCTTC-3 '，如SEQ NO · 1所示； 下游引物LVR: 5 '-CAGGAGTTGGGGTGGATGTG-3 '，如 SEQ NO. 2所示； (2) 驢特異探針： Equus asinus-Probe: 5 '-CGGGGGTCCCAGAGACCACC-3 '，如SEQ NO· 3所示； (3) 牛特異引物： NF: 5 ' -CTTTGCTGGGTTTGGTTCCG-3 '，如SEQ NO · 4所示； NR: 5 ' -CAGCGGCCAAAGCCTAAATC-3 '，如 SEQ NO · 5所示； (4) 牛特異探針： Bovine-Probe: 5 '-CGGGTGTGGGGCAGGTGG-3 '，如SEQ NO · 6所示； 其中，所述驢、牛特異性探針的5'端修飾有報告基團，3'端修飾有淬滅基團，所述報告 基團為?六1、冊父、了六11^、1?(^、0￥5中的任一種，所述淬滅基團為〇31^71、8即1、8即2中的任一 種。9. 一種阿膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測試劑盒，其特征在于，包括 權利要求8所述引物、探針組合物以及熒光PCR反應所需試劑。10. 根據權利要求9所述膠膠液半成品或成品中驢、牛源性成分的定量檢測試劑盒，其 特征在于，所述PCR擴增體系為:含TaqMan reaction Mix(2x) 10μ1，驢特異探針0.25μΜ，牛 特異探針〇. 4μΜ，驢特異性正反向引物LVF/LVR 0.8μΜ，牛特異性正反向引物NF/NR 0.8μΜ， ROX參比熒光（50 X )0.4μ1，待測樣本總DNA2yl，用雙蒸水補足20μ1反應體系;所述PCR擴增 條件為:95°C10min;95°C10s，63°C，35s，在此收集熒光信號，45個循環。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950717SQ201610272618
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月28日
【發明人】步迅, 張全芳, 劉艷艷, 范陽陽
【申請人】山東省農業科學院生物技術研究中心