檢測δ42pd1的方法、引物及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種引物對，所述引物對的擴增產物和/或擴增量能區分Δ42PD1和PD?1序列。本發明還提供了所述的引物對在制備檢測Δ42PD1的產品中的應用。經實驗證明，本發明的引物對特異性好、靈敏度高、檢測時間短和適用范圍廣，且基于該引物對建立的Δ42PD1的檢測方法，可靈敏、準確、簡便和快速的檢測Δ42PD1的存在和/或含量，且可對Δ42PD1與PD?1序列進行高度區分。
【專利說明】
檢測Δ 42PD1的方法、引物及試劑盒
技術領域
[0001]本發明屬于生物技術領域，具體涉及檢測A 42TO1的引物、試劑盒和檢測方法。
【背景技術】
[0002] 細胞程序性細胞死亡受體1 (programmed cell death 1，Ρ?-1 )，又名CD279，屬于 ⑶28分子家族，表達于激活的Τ細胞，ΝΚΤ細胞，Β細胞和巨噬細胞表面Η)-1有兩個配體，PD-L1 (又名CD274或者B7-H1)和H)-L2(又名CD273或者B7-DC)，二者都是B7家族成員。研究結果 表明，PD-1/ro-L通路(包括ro-1/PD-Ll和ro-l/PD-L2)具有免疫抑制功能。
[0003] 在研究中國人群PD-1分子的基因多態性時首次發現了一種全新的PD-1基因的 mRNA選擇性剪接轉錄本。與全長ro-lmRNA相比，該新型轉錄本框內缺失了外顯子2起始端的 42個堿基(ACT CCC CAG ACA GGC CCT GGA ACC CCC CCA CCT TCT CCC CAG)，該段堿基編 碼ro-Ι胞外區的14個氨基酸(DSPDRPWNPPTFFP)。因此，該新型ro-Ι基因的選擇性剪接轉錄 本被命名為A 42PD1。研究發現，常用的商業化的PD-1的單克隆抗體（EH12.2H7，MIH4， EH12.1，J110等）不能識別Δ 42PD1，提示14個氨基酸的缺失使Δ 42PD1的結構發生顯著變 化。此外，A42PD1也不能與Η)-1的配體(PD-L1和TO-L2)相結合。以上結果表明，A42PD1與 Η)-1具有不同的結構。進一步研究發現，△ 42PD1可誘導人外周血單個核細胞和樹突狀細胞 分泌TNF-a，IL-6和IL-Ιβ等前炎性細胞因子。此外，在小鼠體內Δ42ΗΗ可作為分子佐劑，顯 著增強HIV Gag p24DNA疫苗誘導的特異性體液免疫應答和細胞免疫應答，這些結果都提示 Δ 42TO1可能具有重要的免疫調節功能。
[0004] 然而，Δ42ΗΗ與ro-Ι序列的高度一致性，顯著增加了開發特異性檢測該基因轉錄 水平的技術手段，限制了對該新發現免疫調節分子的研究和應用。
[0005] 然而，Δ42ΗΗ與Η)-1序列的高度一致性，顯著增加了開發特異性檢測該基因轉錄 水平的技術手段，限制了對該新發現免疫調節分子的研究和應用。目前對基因轉錄水平的 常用檢測方法包括普通PCR和qPCR等。PCR技術是終點法分析，需要PCR后的凝膠電泳分析結 果，耗時較長，使用的染料(如EB等)具有致癌性，且其檢測靈敏度較低。qPCR又分為探針法 和SYBR Green I法，二者均無需電泳分析，且靈敏度高，可定量。但是探針法需要使用較為 昂貴的特異性探針，成本較高，不利于大規模使用;而SYBR Green I法雖無需為使用較為昂 貴的探針而被廣泛使用，但其所用引物的特異性和靈敏性則成為設計的關鍵。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種靈敏、準確、簡便和快速的檢測A42PD1的方 法，本發明還提供了用于該方法的特異性好、靈敏度高、檢測時間短和適用范圍廣的引物對 和含有該引物對的試劑盒及其應用。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0008] 本發明一方面公開了一種用于檢測A42PD1的引物對，所述引物對的擴增產物和/ 或擴增量能區分A 42TO1和Η)-1序列。
[0009] 在一優選例中，檢測A42PD1的引物對的兩條引物序列均與A42PD1完全配對，且 其中一條引物序列在與ro-ι序列配對時被ro-i序列中形成的Δ42ΗΗ的剪接位點所隔斷。
[0010] 在一優選例中，在剪接位點所隔斷的引物序列，隔斷后分為引物的上游區域和引 物的下游區域，所述上游區域的堿基與下游區域的堿基比為1:4~4:1。
[0011]在一優選例中，檢測Δ42ΗΗ的引物對中的一條序列包含SEQ ID N0:1所示的核苷 酸序列。
[0012] 在一優選例中，另一條引物序列包含SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。
[0013] 在一優選例中，所述的區分所用的方法為熒光定量PCR方法。
[0014]在一優選例中，所述的區分所用的方法為熒光定量PCR SYBR Green I染料法。同 時區分方法不局限于熒光定量PCR方法，區分方法還包括芯片雜交、測序、凝膠電泳等方法。
[0015] 本發明第二方面公開了上面所述引物對在制備檢測Δ42ΗΗ的產品中的應用。
[0016] 在一優選例中，所述檢測Δ 42TO1的產品包括PCR擴增試劑。
[0017] 在一優選例中，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑。
[0018]本發明第三方面公開了一種試劑盒，包括上面所述的引物對。
[0019] 在一優選例中，試劑盒還包括PCR擴增試劑。
[0020] 在一優選例中，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑。
[0021] 在一優選例中，所述熒光定量PCR試劑包括來自TaKaRa公司的貨號為RR820A的 SYBR?PremiX Ex Taq?II試劑盒所包含的試劑。
[0022] 在一優選例中，試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
[0023] 在一優選例中，試劑盒還包括RNA提取試劑。
[0024] 在一優選例中，所述RNA提取試劑包括來自TIANGEN公司的貨號為Cat.#DP419的 RNAsimple Totle RNA Kit總RNA提取試劑盒所包含的試劑。
[0025]在一優選例中，試劑盒還包括逆轉錄試劑。
[0026] 在一優選例中，所述逆轉錄試劑包括來自TaKaRa公司的貨號為Code No.6110A的 逆轉錄試劑盒1st Strand cDNA Synthesis Kit所包含的試劑。
[0027]本發明第四方面公開了上面所述的試劑盒在檢測Λ42Η)1中的應用。
[0028]本發明第五方面公開了一種檢測待測樣品中A42PD1的方法，包括使用上面所述 的引物對的步驟。
[0029]在一優選例中，檢測待測樣品中Δ 42TO1的方法，所述待測樣品為包含有DNA和/或 RNA的血液、細胞或組織，或為質粒，或為DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、 mRNA或cDNA片段的試劑；
[0030] 在一優選例中，當待測樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA或cDNA片 段的試劑，或為質粒時，將其直接作為模板與所述引物對進行實時熒光PCR反應;然后判斷 待測樣品中A 42TO1的存在和/或含量。
[0031] 在一優選例中，當待測樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA，或 為含有mRNA的試劑時，將其轉化為DNA、cDNA或cDNA片段再進行實時熒光PCR反應檢測;然后 判斷待測樣品中A42TO1的存在和/或含量。
[0032] 在一優選例中，所述待測樣品為血液時，還包括對血液的總RNA提取的步驟以及對 總RNA進行逆轉錄的步驟。
[0033] 在一優選例中，檢測待測樣品中A42PD1的方法，利用熒光PCR反應檢測所用的反 應體系如下： SYBR? Premix Ex Taq? II 12,5 μL ROX Reference Dye II 0,5 μL
[0034] 弓丨物對（上下游引物濃度分別為ΙΟμΜ)上下游引物均為IpL MA、cDNA或eDNA片段 拷貝數為1><10%iL ddH.O 9 μL.
[0035] 在一優選例中，上面所述的熒光PCR反應的程序如下：98°C預變性1分鐘;98°C變性 1 Os、60 °C退火30s，40個循環。
[0036]本發明的有益效果包括：
[0037] (1)本發明針對Δ42Η)1設計的擴增引物特異性好、靈敏度高、檢測時間短和適用 范圍廣。
[0038] (2)本發明建立的△ 42PD1的檢測方法，可靈敏、準確、簡便和快速的定性和/或定 量的檢測A 42PD1的存在和/或含量，對△ 42PD1與Η)-1序列可進行高度區分。
【附圖說明】
[0039]圖1 Λ 42PD1與PD-1的有差異部分的基因序列對比，以及Δ 42PD1上游引物的序列 (SEQ ID Ν0.1)在Δ42ΗΗ與Η)-1對應的位置的示意圖。
[0040] 圖2 SEQ ID NO.USEQ ID從).2引物對檢測&42^)1的特異性分析結果示意圖。 [0041 ] 圖3 SEQ ID NO.USEQ ID從).2引物對檢測&42^)1的靈敏性分析結果示意圖。 [0042] 圖4 SEQ ID N0.1、SEQ ID勵.2引物對定量檢測&42?01的(^值與&42?01拷貝數 的線性回歸分析。
[0043] 圖5每ml人外周血Δ 42roimRNA拷貝數檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0044] 除非特殊說明，本發明所用術語具有本發明所屬領域中的一般含義。
[0045] 下面參考具體實施例和附圖，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅 是說明性的，而不能理解為對本發明的限制。實施例中未注明具體技術或條件的，按照本領 域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠 商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。
[0046] 實施例1
[0047]本實施例提供了一種檢測人△ 42TO1轉錄水平的引物對及其應用。
[0048]引物對的設計:上游引物(SEQ ID NO. 1)包含20個寡核苷酸，其中前16個核苷酸位 于Δ42ΗΗ的第一個外顯子上，后4個位于第二個外顯子上，該設計可以排除基因組PD-1DNA 對檢測結果的干擾;此外在ro-i全長轉錄本上，上游引物的前16個寡核苷酸和后4個寡核苷 酸所對應的核酸序列之間存在42個堿基(如圖1所示），以排除ro-lmRNA對檢測結果的干擾， 即上游引物序列跨越PD-1形成Δ 42PD1的剪接位點，是該對引物可以特異性檢測Δ 42PDlmRNA的關鍵所在。
[0049] 為得到靈敏度和特異性最好的引物，我們最初設計了至少5條跨越剪接位點的上 游引物，實驗結果發現，盡管這至少5條上游引物的檢測敏感性相當，但是上游引物(SEQ ID NO. 1)的特異性顯著優于其它4條引物。
[0050] 引物對具體序列如下：
[0051] 上游引物F:5'-CCAGGATGGTTCTTAGCCCT-3'（SEQ ID N0.1)，
[0052] 下游引物R:5'-GCTTGTCCGTCTGGTTGCTG-3'（SEQIDN0·2)。
[0053] 上述引物對由深圳華大基因科技有限公司合成。
[0054] 上述PCR引物可應用于制備檢測Δ 42PD1的產品，以對Δ 42TO1與PD-1序列可進行 高度區分;所述檢測A 42TO1的產品還可以包括PCR擴增試劑;所述PCR擴增試劑優選為熒光 定量PCR試劑。
[0055] 實施例2
[0056] 本實施例提供了一種試劑盒及其應用，所述試劑盒包括：
[0057] (1)上游引物F和下游引物R(來自實施例1);
[0058] (2)來自TaKaRa公司的貨號為RR820A的SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒所包含 的試劑。
[0059] 實驗證明，上述SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒、上游引物F和下游引物R的聯 合使用，具有省時、經濟、可重復性高、高靈敏度和特異性的特點，效果更加優越。
[0060] 上述試劑盒可應用于檢測Δ 42TO1上，能夠高度區分Δ 42TO1與ro-Ι序列。
[0061 ] 實施例3
[0062]本實施例提供了一種檢測待測樣品中A42PD1的方法，例如檢測待測樣品中Δ 42PD1的存在和/或含量，該方法使用了實施例1的RPA引物和實施例2的試劑盒。
[0063]上述待測樣品可以為包含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為質粒，或為 DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段的試劑。當待測樣品為 DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA或cDNA片段的試劑，或為質粒時，將其直接作為模 板與所述引物對進行實時熒光PCR反應;然后判斷待測樣品中△ 42TO1的存在和/或含量； [0064]當待測樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA，或為含有mRNA的 試劑時，將其轉化為DNA、cDNA或cDNA片段再進行實時熒光PCR反應檢測;然后判斷待測樣品 中Δ 42H) 1的存在和/或含量。例如當待測樣品為血液時，還需要對血液的總RNA提取以及對 總RNA進行逆轉錄，以得到cDNA樣品，總之待測樣品本身為DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有 DNA、cDNA或cDNA片段的試劑，或為質粒時不作處理，其余均需處理成DNA、cDNA或cDNA片段 樣品。
[0065]上述方法包括如下步驟：
[0066] 1.實時熒光PCR反應
[0067] 按照SYBRK'Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)試劑盒的說明配制反 應液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL DNA或cDNA或cDNA片段（拷貝數為 101 至 109)、9yL超純水加 入至0.2mL PCR反應管中，以超純水為陰性對照樣品，振蕩混勻后瞬時離心數秒。將反應管 置于ViiA?7實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行實時熒光PCR擴增和檢測，所 述實時熒光PCR擴增的程序如下:98 °C 1分鐘;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40個循環。如表1所示。 [0068]表 1
[0070] 2.判斷待測樣品中Δ 42TO1的存在和/或含量
[0071]在每個循環的60°C階段結束后收集熒光信號并進行熔融曲線的分析，結果為陽性 (Ct彡33)代表待測樣品中含有Δ 42PD1，結果為陰性（Ct > 33)則代表待測樣品中未含Δ 42HH。
[0072] 當需要判斷待測樣品中Δ42Η)1的含量時，則在上述步驟1中還需設定已知拷貝數 的陽性對照。
[0073] 實施例4
[0074]本實施例對實施例1的引物對進行了特異性驗證，具體包括如下步驟：
[0075] 1.樣品制備
[0076] 將Δ 42roi和ro-Ι全長cDNA(其中ro-Ι來源于Genbank的ID NM_005018)插入載體 pVAXl載體（貨號V260-20,美國Invitrogen公司）中，構建真核表達質粒pVAX-A42PDl和 pVAX-PDl。采用質粒中量提取試劑盒(貨號D0018,上海碧云天生物技術有限公司），并按照 試劑盒說明制備質粒PVAX- Δ 42PD1和pVAX-PD1。用微量紫外分光光度計分別測定質粒 pVAX- Δ 42PD1和pVAX-PD 1的濃度，通過其分子量計算出拷貝數，然后制備拷貝數為1 X 109/ yL的樣品。
[0077] 2.PCR 反應
[0078] 按照SYBRK'Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)試劑盒的說明配制反 應液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL樣品、9yL超純水加入至0.2mL PCR反應管中，以超純水為陰 性對照樣品，振蕩混勻后瞬時離心數秒。將反應管置于ViiA?7實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行實時熒光PCR擴增和檢測，所述實時熒光PCR擴增的程序如下：98°C1分 鐘;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40個循環。如表1所示。
[0079] 表 1
[0081] 3.結果：
[0082] 檢測結果如圖2所示，圖2表明ΙΟ9拷貝數的Δ 42TO1樣品的Ct值為10.065，ΙΟ9拷貝 數的H)1樣品的Ct值為31.572,陰性對照檢測不到Ct值。此實驗結果說明用該引物對擴增Δ 42PD1的效率約為擴增Η)-1的效率的221(231·572^^ 65)倍，具有非常強的特異性。
[0083] 實施例5
[0084] 本實施例對實施例1的引物對進行了靈敏性驗證，具體包括如下步驟：
[0085] 1.樣品制備
[0086]用微量紫外分光光度計分別測定質粒pVAX- △ 42Η)1(質粒的制備見實施例4)的濃 度，通過其分子量計算出拷貝數，然后依次制備10倍梯度稀釋至個位拷貝數的樣品，共計7 個梯度，拷貝數為：1X 1〇6至1X 10Q/yL。
[0087] 2.PCR 反應
[0088] 按照SY'BRK Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)試劑盒的說明配制反 應液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference DyeII、lyL樣品、9yL超純水加入至0.2mL PCR反應管中，以超純水為陰 性對照樣品，振蕩混勻后瞬時離心數秒。將反應管置于ViiA?7實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行實時熒光PCR擴增和檢測，所述實時熒光PCR擴增的程序如下：98°C1分 鐘;98 °C 10秒，60 °C 30秒，40個循環。如表2所示。
[0089] 表2
[0091] 3.結果:檢測結果如圖3所示，圖3表明用所述引物的qPCR檢測A42PD1的檢測下線 為1(10,拷貝，而陰性對照檢測不到Ct值。且Ct值與A42PD1拷貝數之間具有非常強的線性 關系(P〈0.0001，r = 0.999，圖4)，表明用本發明的引物對的qPCR檢測Δ 42PD1的靈敏性非常 強。
[0092] 實施例6
[0093]本實施例提供了實施例1中提供的引物對定量檢測人外周血A42roimRNA逆轉錄 后cDNA的拷貝數。
[0094] 1.樣品制備
[0095] 取24名健康人靜脈抗凝血(EDTA抗凝）250yL，用RNAsimple Totle RNA Kit總RNA 提取試劑盒(Cat. #DP419，TIANGEN)，參考試劑盒說明書，提取血液細胞總RNA，溶于50yL無 RNA酶的超純水中。取12.5yL總RNA，用逆轉錄試劑盒PrimeScript?lst Strand cDNA Synthesis Kit(Code No.6110A，TaRaKa)，參考試劑盒說明書，進行逆轉錄合成20yL cDNA。 陽性對照的標準品制備如實施例4所述的樣品制備。
[0096] 2.PCR 反應
[0097] 按照SYBRK Premix Ex Taq?II(Code No.RR820A，TaKaRa)試劑盒的說明配制反 應液：取 12.5yL SYBR Premix Ex Taq II、lyL上游引物F(10yM)、lyL下游引物R(10yM)、0.5 yL ROX Reference Dye II、lyL cDNA模板（由健康人抗凝血制備）、9yL超純水加入至0.2mL PCR反應管中；以超純水為陰性對照模板，用標準品平行做陽性對照實驗。振蕩混勻后瞬時 離心數秒。將反應管置于ViiA?7實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)上進行實時熒 光PCR擴增和檢測，所述實時熒光PCR擴增的程序如表2所示。
[0098] 3.結果
[0099]檢測結果如圖5所示，圖5表明24例健康成年人外周血中A42PDlcDNA拷貝數平均 值為7.92 X 107，最小和最大值分別為2.85 X 106和1.91 X 108。
【主權項】
1. 一種用于檢測A 42PD1的引物對，其特征在于，所述引物對的擴增產物和/或擴增量 能區分Δ 42TO1和Η)-1序列； 任選的，所述引物對的兩條引物序列均與A 42TO1完全配對，且其中一條引物序列在與 ro-Ι序列配對時被ro-Ι序列中形成的Δ 42TO1的剪接位點所隔斷； 任選的，在剪接位點所隔斷的引物序列，隔斷后分為引物的上游區域和引物的下游區 域，所述上游區域的堿基與下游區域的堿基比為1:4~4:1。2. 根據權利要求1所述的引物對，其特征在于，引物對中的一條序列包含SEQ ID NO: 1 所示的核苷酸序列； 任選的，另一條序列包含SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； 任選的，所述的區分所用的方法為熒光定量PCR方法； 任選的，所述的區分所用的方法為熒光定量PCR SYBR Green I染料法。3. 根據權利要求1或2所述的引物對在制備檢測A42PD1的產品中的應用； 任選的，所述檢測A 42PD1的產品還包括PCR擴增試劑； 任選的，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑。4. 一種試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的引物對。5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于:還包括PCR擴增試劑； 任選的，所述PCR擴增試劑為熒光定量PCR試劑； 任選的，所述熒光定量PCR試劑包括來自TaKaRa公司的貨號為RR820A的S YBR?Premix Ex Taq?II試劑盒所包含的試劑； 任選的，還包括陽性對照和陰性對照； 任選的，還包括RNA提取試劑； 任選的，所述RNA提取試劑包括來自TIANGEN公司的貨號為Cat.#DP419的RNAsimple Totle RNA Kit總RNA提取試劑盒所包含的試劑； 任選的，還包括逆轉錄試劑； 任選的，所述逆轉錄試劑包括來自TaKaRa公司的貨號為Code No . 6110A的逆轉錄試劑 盒.Pfim6Scnpt?lst Strand cDNA Synthesis Kit所包含的試劑。6. 權利要求5所述的試劑盒在檢測△ 42PD1中的應用。7. -種檢測待測樣品中A42PD1的方法，其特征在于，包括使用權利要求1或2所述的引 物對的步驟。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于:所述待測樣品為包含有DNA和/或RNA的血 液、細胞或組織，或為質粒，或為DNA、cDNA、mRNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA、mRNA或 cDNA片段的試劑； 任選的，當待測樣品為DNA、cDNA或cDNA片段，或為含有DNA、cDNA或cDNA片段的試劑，或 為質粒時，將其直接作為模板與所述引物對進行實時熒光PCR反應;然后判斷待測樣品中△ 42PD1的存在和/或含量； 任選的，當待測樣品為含有DNA和/或RNA的血液、細胞或組織，或為mRNA，或為含有mRNA 的試劑時，將其轉化為DNA、cDNA或cDNA片段再進行實時熒光PCR反應檢測;然后判斷待測樣 品中△ 42TO1的存在和/或含量； 任選的，所述待測樣品為血液時，還包括對血液的總RNA提取的步驟以及對總RNA進行 逆轉錄的步驟。9. 根據權利要求8所述的方法，其特征在于： 所述實時熒光PCR反應的反應體系如下： SYBR? Premix Ex Taq? II 12.5 μL. ROX Reference Dye II 0.5 pL 引物對 上下游引物濃度分別為1 ΟμΜ，上下游引物均 Λ/1 DNA、cdDNA或cDNA片段 拷貝數為1x10%iL ddH20 9. pL。.10. 根據權利要求9所述的方法，其特征在于:所述實時熒光PCR反應的程序如下：98°C 預變性1分鐘;98 °C變性10s、60 °C退火30s，40個循環。
【文檔編號】C12N15/11GK105950715SQ201610270351
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月27日
【發明人】程林, 唐嫻, 王輝, 陳志偉
【申請人】深圳市第三人民醫院