二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備及相關應用
【專利摘要】本發明公開了一種二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備方法并用于檢測miRNA，該方法包括以下步驟：1）在納米金包覆的磁球（MB?AuNPs）表面固定生物素修飾的發夾型DNA探針；2）miRNA與發夾型DNA探針雜交將發夾型DNA探針打開，使探針中修飾生物素基團的一端遠離磁球表面；3）通過生物素與親和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物。將上述復合物收集到磁性電極表面，通過檢測二茂鐵的電化學信號測定miRNA的含量。該復合物合成方法簡單，用于電化學測試響應強、檢測靈敏度高，能快捷檢測miRNA的含量，可廣泛應用。
【專利說明】
二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備及相關應用
技術領域
[0001]本發明涉及一種二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備新方法，該方法重點應用于電化學生物傳感領域，該復合物可用于定量檢測miRNA。【背景技術】
[0002]二茂鐵標記的磁性納米復合物具有如下特性:易于磁性分離、表面便于化學修飾、 導電性好、電化學信號強。因此，該復合物在電化學分析方面具有一定的應用潛力。
[0003]本工藝選擇將直徑為40.5 nm、帶正電荷的納米金靜電吸附于直徑為2.6 Ml、帶負電的磁球表面，通過表面生長過程使納米金填滿磁球表面的位點。通過Au-S鍵，在納米金包覆的磁球(MB-AuNPs)表面固定生物素修飾的發夾型DNA探針，當序列完全匹配的miRNA與 DNA探針的環狀部分雜交時，發夾型探針被打開，生物素基團遠離磁球表面。通過生物素與親和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物。隨后，將上述復合物收集到磁性金電極表面進行電化學測定。基于上述復合物對電化學信號的雙重放大作用，可用于檢測含量極低的miRNA序列。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備方法并用于檢測 miRNA。該復合物制備簡單，具有雙重信號放大功能，對miRNA檢測快速、靈敏度高、選擇性好，且無需對樣品進行標記。
[0005]本發明公開了一種二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備方法并應用于miRNA的測定，其特征在于通過堿基序列配對在MB-AuNPs表面衍生二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物，來放大電化學信號。具體步驟如下:1)在MB-AuNPs表面通過Au-S鍵固定生物素修飾的發夾型DNA探針；2)miRNA與發夾型探針DNA的環狀部分雜交將發夾型探針打開，使得生物素基團遠離磁球表面；3)通過生物素與親和素的相互作用，在磁球表面衍生二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物。
[0006]所述的發夾型DNA探針莖部一端修飾巰基，另一端修飾生物素基團。
[0007]所述的發夾型DNA探針環狀部分與miRNA序列互補配對，使得發夾結構打開，生物素基團遠離磁球表面。
[0008]采用上述復合物檢測miRNA的具體方法是:(1)將MB-AuNPs與濃度為1 yM生物素修飾的發夾型DNA探針溶液混合震蕩5 h，超純水清洗，磁分離，除去上清液；(2)將步驟(1)得到的MB-AuNPs采用50此，0.1 mM的巰基己醇封閉10~30 min，超純水清洗，磁分離，除去上清液；(3)在步驟(2)的基礎上采用50 yL，1%的牛血清白蛋白封閉0.5?1.5 h，超純水清洗，磁分離，除去上清液；(4)miRNA的檢測:(a)將上述(3)封閉后的MB-AuNPs與50 yL濃度為1 nM的miRNA混合震蕩20?180 min，超純水清洗，磁分離，除去上清液；(b)將10 yL二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物加入到步驟(a)所得的MB-AuNPs中，20 ?60 min后用超純水清洗，磁分離，除去上清液；(c )將步驟(b)中所得的復合物收集到磁性金電極表面，在0.1?0.5 M的KC1 〇4水溶液中進行電化學檢測；本發明采用的電化學檢測是在室溫條件下，采用三電極體系，其中，二茂鐵標記的磁性納米復合物修飾的金電極為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，Pt絲為輔助電極，掃速為 0.1 V/s，掃描范圍為-0.1?0.7 V。
[0009]本技術發明了一種二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備方法并用于檢測miRNA， 相比于現有技術，有如下優點:易于磁性分離、表面便于化學修飾、導電性好、電化學信號強。通過上述復合物對電化學信號的雙重放大作用，本發明對靶點miRNA的最低檢測濃度可達到5 fM。【附圖說明】
[0010]【圖1】為本發明制備的二茂鐵標記的磁性納米復合物示意圖:1為納米金包覆的磁球，2為生物素修飾的發夾DNA探針，3為miRNA，4為二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物。 [〇〇11]【圖2】為本發明檢測miRNA的原理圖。[0〇12]【圖3】為磁球(a)，納米金包覆的磁球(b)，在(b)基礎上納米金的生長(c)，二茂鐵標記的磁性納米復合物(d)的掃描電鏡圖。[〇〇13]【圖4】曲線a和b分別為miRNA濃度為0.1 nM和0.1 pM時二茂鐵標記的磁性納米復合物的循環伏安圖；曲線c為miRNA不存在時的循環伏安圖。掃速為0.1 V/s，箭頭為掃描方向。【具體實施方式】[〇〇14]為了方便本領域的生產人員便于理解，本發明提供了一種二茂鐵標記的磁性納米復合物制備方法的【具體實施方式】。
[0015]實施例1二茂鐵標記的磁性納米復合物制備，其過程包括以下流程:第一步，生物素修飾的發夾型DNA探針在MB-AuNPs表面的固定MB-AuNPs中加入20此，5虛的發夾型DNA探針，常溫震蕩5小時，磁分離;50此，0.1 mM疏基己醇封閉30分鐘，磁分離;50 yL，1%牛血清白蛋白封閉1 h，磁分離備用。
[0016]第二步，miRNA的雜交以及二茂鐵覆蓋的納米金-親和素復合物的固定發夾型DNA探針修飾的MB-AuNPs中加入100此，1 nM的miRNA，室溫震蕩3 h，通過磁分離將未反應的miRNA分離。加入10 yL二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物，震蕩1 h，超純水清洗，磁分離。
[0017]所制備的二茂鐵標記的磁性納米復合物與裸磁球、磁球上沉積金以及磁球上進一步生長金的掃描電鏡圖和能譜圖見附圖3。
【主權項】
1.二茂鐵標記的磁性納米復合物的制備并用于miRNA的檢測，其特征在于以下步驟:1)通過震蕩孵育5 h將發夾型DNA探針固定于納米金包裹的磁球表面；2)將1 nM的 miRNA和5 yL上述磁球混合震蕩3 h后，miRNA與發夾型DNA探針的環狀部分雜交，使得發夾 結構打開，隨后將二茂鐵覆蓋的納米金/親和素復合物衍生到磁球表面;3)將上述復合物收 集到磁性電極表面，通過測定二茂鐵的電化學響應對miRNA定量。
【文檔編號】C12Q1/68GK105950711SQ201610246575
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年4月20日
【發明人】王建秀, 盧知軒, 衣馨瑤, 王璟芮
【申請人】中南大學