一種靶向cd22的復制缺陷性重組慢病毒car-t轉基因載體及其構建方法和應用

一種靶向cd22的復制缺陷性重組慢病毒car-t轉基因載體及其構建方法和應用
【專利摘要】本發明公開了一種靶向CD22的復制缺陷性重組慢病毒的CAR?T轉基因載體，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC Ori序列；用于目的菌株大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因AmpR序列；用于增強真核細胞內的復制的病毒復制子SV40Ori序列；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreen1綠色熒光蛋白；用于共同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的人EF1α啟動子；用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE元件。此外，還公開了該載體的構建方法和應用。本發明能顯著提高細胞因子的分泌、CAR?T細胞的體外殺傷作用，臨床治療前體B細胞急性淋巴細胞白血病效果突出。
【專利說明】
一種靶向CD22的復制缺陷性重組慢病毒CAR-T轉基因載體及 其構建方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于醫學生物領域，具體涉及一種載體，尤其涉及一種靶向CD22的復制缺 陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體。此外，本發明還涉及該載體的構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤免疫治療的理論基礎是免疫系統具有識別腫瘤相關抗原、調控機體攻擊腫瘤 細胞(高度特異性的細胞溶解)的能力。這個生物過程十分復雜，目前仍處于研究之中。上世 紀90年代，多個科研小組已經發現了腫瘤抗原(tymor antigens)，T淋巴細胞可以通過主要 組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)依賴性方式識別這些腫瘤 抗原。
[0003] 腫瘤免疫治療通常分為兩類，非特異性免疫和特異性免疫。非特異性免疫治療主 要包括白細胞介素 -2( interleykin_2，IL-2)，干擾素 a( interf erona，IFN-α)，腫瘤壞死因 子(tymor necrosis factor，TNF-a)，卡介苗等細胞因子和毒素，過繼性細胞免疫治療等。 特異性免疫治療主要是腫瘤疫苗。
[0004] 1.1腫瘤非特異性免疫治療
[0005] 非特異性免疫應答是與生倶來的，它的形成并不需要抗原刺激，能廣泛地針對多 種抗原，是免疫應答的基礎，但特異性不強，對某種特定抗原物質往往不能產生足夠強度的 反應非特異性的免疫治療。在進入臨床試驗的多種細胞因子中，白細胞介素-2和干擾素應 用最為廣泛[Rosenberg S A,Lotze Μ Τ,ΜμμΙ L M,et al. A progress report on the treatment of 157patients with advanced cancerusing lymphokine-activated killer cells and interleukin-2or high-dose interleukin-2alone[J].N Engl J Med，1987,316(15):889-897.]。
[0006] 1.2腫瘤單克隆抗體的免疫治療
[0007] 近20多年來單克隆抗體已在腫瘤治療領域得到廣泛應用。抗腫瘤單抗藥物一般包 括兩類:一是抗腫瘤單抗，二是抗腫瘤單抗偶聯物，或稱免疫偶聯物。免疫偶聯物分子由單 抗與"彈頭"藥物兩部分組成，"彈頭"主要包括放射性核素、藥物和毒素，與單抗連接后分別 構成放射免疫偶聯物、化學免疫偶聯物和免疫毒素。在1997年11月和1998年10月美國FDA分 別通過了用于臨床腫瘤治療的兩個單抗一 Rityximab(rityxan)和Trastyzymab (herceptin)[Di1lman R 0.Magic bullets at lastIFinally-approval of a monoclonal antibody for the treatment of cancer[J].Cancer Biother Radiopharm, 1997，12:223 - 225.]。目前認為單抗的作用機制有阻斷作用、信號傳導作用以及靶向作用 等三種作用機制，沒有直接的殺傷作用。另外還存在藥理學方面的問題，主要是到達腫瘤的 藥量不足。由于偶聯物是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚于肝、脾和 骨髓。偶聯物是大分子物質，通過毛細血管內皮層及穿透腫瘤細胞外間隙均受到限制。
[0008] 1.3腫瘤的過繼免疫治療
[0009] 腫瘤的過繼免疫治療是指將體外激活的自體或異體免疫效應細胞輸注給患者，以 殺傷患者體內的腫瘤細胞。腫瘤過繼性免疫治療中的一個關鍵問題是尋找合適的腫瘤殺傷 細胞。自上世紀80年代以來，包括LAK、細胞因誘導的殺傷細胞（cytokine-indyced killers，CIK)、TIL等細胞已先后應用于臨床，但由于存在著擴增倍速較低、細胞來源困難、 細胞毒力不高等諸多問題，在臨床應用上受到限制。如何提高T細胞的腫瘤抗原特異性具有 重要的臨床意義。T細胞對腫瘤抗原的識別主要是通過T細胞受體(T cell receptor，TCR) 識別腫瘤細胞表面的人類白細胞抗原(hyman leykocyte antigen，HLA)_肽復合物，因此，T 細胞對腫瘤抗原識別的特異性取決于Τ細胞表面的TCR。利用分子生物學的手段克隆腫瘤特 異性T細胞的TCR，并通過構建含TCR的病毒載體，把TCR轉入正常的T細胞中，使這些T細胞因 攜帶腫瘤特異性而成為特異性腫瘤殺傷細胞[Johnson L A，Morgan R A，Dydley M E，et al. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal ti ssues expressing cognate antigen[J].Blood， 2009,114(3):535-546·]。
[0010] 1.4腫瘤疫苗治療
[0011] 腫瘤疫苗治療是通過給患者體內導入腫瘤抗原來激發患者的特異性抗腫瘤免疫 反應。由于疫苗治療具有特異性、在體內免疫效應維持時間長等優點，目前已成為研究熱 點。近年來多肽疫苗、核酸疫苗、全蛋白疫苗、抗獨特性抗體疫苗、重組病毒疫苗、細菌疫苗、 基因修飾的腫瘤細胞疫苗、樹突狀細胞(dendritic cells，DC)疫苗等得到廣泛研究和應用 [Robbins P F,Morgan R A,Feldman S A，et al·Tymor regression in patients with metastatic synovial cell sarcoma and melanomaysing genetically engineered lymphocytes reactive with NY-ES0_1[J].J Clin 0ncol，2011，29(7):917 -924·]。腫瘤 疫苗治療的大規模應用還有三個方面的問題亟待解決。首先，腫瘤相關抗原，每個腫瘤、每 個亞型、每個腫瘤分期，這些相對抗原表達是不一樣的，所以選準抗原，選準病人人群是致 關重要的。第二，如何達到腫瘤抗原在樹突狀細胞中髙效吸收與表達?抗原被樹突狀細胞吸 收是以表面受體為介導的。樹突狀細胞有十幾個受體，如何根據特定的抗原選擇相應的受 體?第三，針對樹突狀細胞分化成熟的調控。樹突狀細胞的分化成熟是一個非常復雜的過 程，它既可走向激活T細胞也可以走向抑制T細胞。[靶向DC細胞的治療型腫瘤疫苗：亮點與 挑占戈并存。http: //www. biodiscover · com/news/research/ll5794.html ]。
[0012] 1.5腫瘤 CAR-Τ 治療
[0013] CAR-T，全稱是Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immynotherapy，嵌合抗原受 體T細胞免疫療法，結構如圖 1 所不[Eleanor J.Cheadle，et al.CAR T cells:driving the road from the laboratory to the clinic.Immynological Reviews 2014.Vol.257:91-106]〇
[0014] 第一代CAR介導的T細胞激活是通過⑶3z鏈或FceRIg上的酪氨酸激活基序完成的。 CD3z鏈能夠提供T細胞激活、裂解靶細胞、調節IL-2分泌以及體內發揮抗腫瘤活性所需的信 號。但第一代CAR改造 T細胞的抗腫瘤活性在體內受到了限制，T細胞增殖減少最終導致T細 胞的凋亡。
[0015] 第二代CAR在胞內增加了一個新的共刺激信號，實驗證明，這使得原有的使源自 TCR/CD3復合體的"信號Γ擴大，許多研究都表明，搭載了 "信號2"的第二代CAR與第一代CAR 相比，抗原特異性不變，T細胞增殖、細胞因子分泌增加，抗細胞凋亡蛋白分泌增加，細胞死 亡延遲。常用的共刺激分子為⑶28,但之后有研究將⑶28用⑶137(4-1ΒΒ)進行替換，除此之 外，一種使用ΝΚ細胞受體CD244的思路也被提出來。雖然不同的第二代CAR究竟孰優孰劣，不 同的研究者用不同的腫瘤在體內和體外的研究中得到的結果不盡相同。[深度完整版:CAR-Τ'的現狀和未來. 生物谷. 2015-051-15] 。
[0016]為了進一步改良CAR的設計，許多研究組開始著眼于發展第三代CAR，不僅包括"信 號1"、"信號2"，還包括了額外的共刺激信號。不同研究者們用不同的靶點和共刺激信號開 展的研究所得到的第二代CAR和第三代CAR的比較結果存在一定的差異性。一些研究報道表 達第三代CAR的重組T細胞在抗腫瘤活性、存活周期及細胞因子釋放方面均顯著提高； Wilkie等的研究結果顯示靶向MMC1的第二代CAR與第三代CAR重組T細胞在抗腫瘤細胞毒 性方面并無明顯差異，雖然表達第三代CAR的T細胞能夠分泌更大量的IFN-γ (Wilkie S， Picco G,Foster J,et al.Retargeting of hyman T cells to tymorassociated MMC1: the evolution of a chimeric antigen receptor.J Tmmunol 2008;180:4901-4909·)。 值得注意的是，上述區別僅僅是體外實驗中獲得的結論，目前尚未在體內比較第二代和第 三代CAR的報道。
[0017]這幾代CAR之間的差異可能不止來自于信號傳導域，胞外的抗原結合域(scFv)、重 組T細胞的轉染方法(慢病毒VS逆轉錄病毒）、重組T細胞的回輸方式(靜脈回輸VS腹膜VS瘤 體)等均可能影響CAR-T細胞的最終抗腫瘤效果。
[0018] 本
【申請人】于2016年3月17日申請的發明名稱為"一種基于復制缺陷性重組慢病毒 的CAR-T轉基因載體及其構建方法和應用"的發明專利申請，公開了針對CD19的復制缺陷性 重組慢病毒的CAR-T轉基因載體及其構建方法和應用。本發明是針對CD22的CAR-T轉基因載 體。

【發明內容】

[0019] 本發明要解決的技術問題之一是提供一種靶向⑶22的復制缺陷性重組慢病毒的 CAR-T轉基因載體。
[0020] 本發明要解決的技術問題之二是提供該靶向C D 2 2的復制缺陷性重組慢病毒的 CAR-T轉基因載體的構建方法。
[0021] 本發明要解決的技術問題之三是提供該靶向C D 2 2的復制缺陷性重組慢病毒的 CAR-T轉基因載體的應用。
[0022] 本發明涉及含肽的醫藥配置品，具體涉及：
[0023] 一、含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列、原核復制子pUC Ori序列、病毒復制子 SV400ri序列、RSV啟動子、人EFlα啟動子、慢病毒5terminalLTR、慢病毒3terminalSelf-Inactivating LTR、Gag順式元件、RRE順式元件、env順式元件、cPPT順式元件、IRES核糖體 結合序列、ZsGreenl綠色熒光蛋白、eWPRE 土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件的重組慢病毒載 體骨架，這種重組慢病毒載體骨架可以搭載不同的治療性基因并廣泛的用于過繼性細胞治 療領域。
[0024]二、重組慢病毒載體骨架、⑶81eader嵌合受體信號肽、⑶22單鏈抗體輕鏈VL、單鏈 抗體鉸鏈LinkerA、單鏈抗體鉸鏈Linker B、單鏈抗體鉸鏈Linker C、⑶22單鏈抗體重鏈VH、 CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28嵌合受體共刺激因子、 CD137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細胞激活域構建形成重組慢病毒載體，該方法得 到的重組慢病毒載體可以實現在人T淋巴細胞上表達CD22嵌合抗原受體，引導并激活T淋巴 細胞對CD22陽性細胞的殺傷作用，在臨床上用于治療前體B細胞急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)〇
[0025] 本發明所采用的針對CD22的CAR-T技術，是一種綜合了腫瘤單克隆抗體的免疫治 療和腫瘤的過繼免疫治療優點的靶向治療新技術。CD22是唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素 家族的一員，有7個IgG樣的胞外區，存在于pre-B到mature B的細胞分化階段，CD22在免疫 毒素療法中被證明是針對B淋巴細胞白血病和B淋巴瘤的成功靶點(Waleed Has〇，Crystal L.Mackal1 et al·Anti-CD22_chimeric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia.Blood,February 2013,Vol.121(7),1165-1174.)，由于，最近幾年在前體B細胞急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)的治療上有著顯著的 療效，被認為是最有前景的前體B細胞急性淋巴細胞白血病治療方式之一。
[0026] 嵌合抗原受體(CAR)是CAR-T的核心部件（圖1所示），賦予T淋巴細胞HLA非依賴的 方式識別腫瘤抗原的能力，這使得經過CAR改造的T細胞相較于天然T細胞表面受體TCR能夠 識別更廣泛的目標。CAR的基礎設計中包括一個腫瘤相關抗原（tymor-associated antigen，TAA)結合區（通常來源于單克隆抗體抗原結合區域的scFV段），一個胞外鉸鏈區， 一個跨膜區和一個胞內信號轉導區。scFV段的設計對于CAR的特異性、有效性以及基因改造 T細胞自身的安全性來說是關鍵的決定因素。
[0027] 為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0028] 在本發明的一方面，提供一種靶向⑶22的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因 載體，包括：用于質粒復制的原核復制子pUC Ori序列，如SEQ ID N0.2所示；用于目的菌株 大量擴增的含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列，如SEQ ID NO. 1所示；用于增強真核細胞內的 復制的病毒復制子SV400ri序列，如SEQ ID N0.3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式 元件；用于真核細胞表達綠色熒光的ZsGreenl綠色熒光蛋白，如SEQ ID N0.11所示；用于共 同轉錄表達蛋白質的IRES核糖體結合序列，如SEQ ID N0.12所示；用于嵌合抗原受體基因 的真核轉錄的人EFla啟動子，如SEQ ID N0.14所示；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增 強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件，如SEQ ID N0.13所示；以及用于組成集識別、傳遞、 啟動于一體的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體;所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體 的二代CAR的嵌合抗原受體包括:如SEQ ID N0.15所示的⑶81eader嵌合受體信號肽、如SEQ ID N0.16所示的CD22單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID N0.19所示的Optimal Linker C、如SEQ IDN0.20所示的CD22單鏈抗體重鏈VH、如SEQIDN0.21所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如 SEQIDN0·22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQIDN0·23所示的 ⑶137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO. 24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域。所述用于組 成集識別、傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括：如SEQ ID Ν0.15所示的 CD81eader嵌合受體信號肽、如SEQIDN0.16所示的CD22單鏈抗體輕鏈VL、如SEQIDN0.19 所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO. 20所示的CD22單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO. 21 所示的CD8Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID ^).22所示的0)81'抑11811161111^3116嵌合受體跨膜 區、CD28、如SEQ ID NO.23所示的CD137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌 合受體T細胞激活域、以及如SEQ ID NO. 25所示的CD28嵌合受體共刺激因子。本發明所采用 的scFV段的linker設計，可以應用于第二代CAR設計方案，同樣也可以應用于第三代CAR設 計方案。第三代CAR設計與第二代設計相比，增加了CD28嵌合受體共刺激因子（SEQ ID NO.25)，理論上說，會有更強的信號放大作用。
[0029]進一步地，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括:如SEQ ID N0.5 所不的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件。所述慢病毒 包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQIDN0.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQ ID NO.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所不的 Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如 SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的 RSV啟動子。本發明所采用CAR設計方案可以應用于第三代慢病毒載體結構上，也可以應用 于第二代慢病毒載體結構上。第二代和第三代慢病毒載體在結構上的區別（如圖2B所示）， 主要是第三代慢病毒載體把第二代載體5 ' LTR的U3區域替換為RSV啟動子，這樣就消除了U3 轉錄時對Tat蛋白的依賴，既可以在慢病毒的結構基因里去除Tat序列，也提高了慢病毒基 因組轉錄水平和轉錄持續性。第二代和第三代慢病毒載體主要是基因組轉錄方式的區別， 因此本發明所采用CAR設計方案可以應用于這兩代慢病毒載體。本發明所采用的載體骨架 優選為第三代慢病毒載體（圖2A所示），3'SIN LTR去除了U3區域，消除了慢病毒載體自我復 制的可能性，大大提高了安全性;增加了 cPPT和eWPRE元件，提高了轉導效率和轉基因的表 達效率;采用RSV啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心RNA的持續高效轉錄;采用人自身的 EFla啟動子，使CAR基因能夠在人體內長時間持續表達。
[0030] 進一步地，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件有6個核苷酸的增強 突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0031] 在本發明的另一方面，提供一種上述靶向⑶22的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T 轉基因載體的構建方法，包括以下步驟：
[0032] (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列（如SEQ ID N0.1所示）、原核復制子pUC 0ri序列（如SEQIDN0.2所示）、病毒復制子SV400ri序列（如SEQIDN0.3所示）、用于慢病 毒包裝的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白（如SEQ ID勵.11所示）、11^3核糖 體結合序列（如SEQ ID NO. 12所示）、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件（如SEQ ID NO. 13所示)存儲于慢病毒骨架質粒上；
[0033] (2)將人EFla啟動子（如SEQ ID N0.14所示）、用于組成集識別、傳遞、啟動于一體 的二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設計方案，經過酶切、連接、 重組反應克隆至慢病毒骨架質粒中，得到二代CAR或三代CAR設計的重組慢病毒質粒；
[0034] (3)將得到的重組慢病毒質粒與慢病毒包裝質粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質粒 pEnv-G共同轉染HEK293T/17細胞，在HEK293T/17細胞中進行基因轉錄表達后，包裝成功重 組慢病毒載體會釋放到細胞培養上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液；
[0035] (4)將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的柱純化方式進行純化，分別 得到重組慢病毒載體。
[0036] 在步驟（1)中，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒載體包括：如SEQ ID N0.5所不的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID N0.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元 件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件;所述慢病毒 包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQIDN0.5所示的慢病毒5terminalLTR、 如SEQ ID NO.6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所不的 Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如 SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的 RSV啟動子。
[0037] 在步驟（1)中，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件有6個核苷酸的 增強突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A>T、g.411A>T。
[0038] 在步驟(2)中，由人EFla啟動子啟動整個CAR基因表達;⑶81eader嵌合受體信號肽 位于CAR編碼序列的N端，用于引導CAR蛋白定位于細胞膜;CD22單鏈抗體輕鏈VL、Optimal Linker C、⑶22單鏈抗體重鏈VH組合成scfv區域，用于識別⑶22抗原;⑶8Hinge嵌合受體鉸 鏈用于將scf v錨定于細胞膜外側;CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區用于將整個嵌合受體 固定于細胞膜上;CD137嵌合受體共刺激因子用于刺激T細胞增殖和細胞因子分泌;TCR嵌合 受體T細胞激活域用于激活下游信號通路的表達；當scfv區域與CD22抗原結合時，信號通過 嵌合受體傳遞至細胞內，從而產生T細胞增殖、細胞因子分泌增加、抗細胞凋亡蛋白分泌增 加、細胞死亡延遲、裂解靶細胞等一系列生物學效應。
[0039]在步驟（4)中，所述慢病毒載體有帶熒光標簽zsGreenl的版本和不帶熒光標簽 zsGreenl版本，帶焚光標簽的版本用于體外實驗，不帶焚光標簽的版本用于臨床實驗。
[0040] 在步驟(4)中，需要注意的幾個關鍵點有，a:抽濾步驟要控制上清體積（200ml~ 2000ml)和真空度(-0.5MPA~-0.9MPA)，防止由于堵孔帶來的載體損失;b:吸附步驟需要控 制溶液的PH(6~8)，防止PH的變化導致載體失活;c:洗脫步驟需要控制洗脫液的離子強度 (0.5M~1.0M)，防止離子強度的變化導致洗脫不完全或者載體失活。
[0041] 在本發明的另一方面，提供上述載體在制備過繼性細胞治療藥物中的應用。優選 的，所述過繼性細胞治療藥物為前體B細胞急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)治療藥物。經臨 床試驗驗證，本發明載體應用于臨床治療前體B細胞急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)，在患 者體內實現了腫瘤細胞的完全清除，因此本發明所述的載體在CART治療領域擁有廣闊的應 用前景。
[0042] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0043] 本發明采用的scFV段的linker設計，是使用世翱公司的Linkers pool，經過蛋白 質結構生物信息學數據庫(https :// www.predictprotein.org/)的分析，通過對蛋白質二 級結構、溶劑可接觸性、蛋白質柔韌性、二硫鍵橋、結合位點等蛋白質特性的比較，優選得 出。通過體外細胞因子分泌檢測試驗以及殺傷效率試驗證明，與國外的設計相比，能夠顯著 提高細胞因子的分泌、CAR-T細胞的體外殺傷作用。并且，在臨床治療的效果上也比國外臨 床實驗的效果好。
[0044]本發明所采用的慢病毒載體柱純化系統，系本
【申請人】開發出的慢病毒規模化生產 工藝。本發明所采用的慢病毒載體柱純化方式不同于通常采用的超速離心或者高速離心的 方式，常用的超速離心法或者高速離心法，是利用離心沉降原理分離慢病毒顆粒，不可避免 的會殘留很多沉降系數相近的雜質，對后續實驗帶來不利影響。并且，裝管過程復雜、操作 繁瑣、多次轉換容器帶來更多的污染機會。而本發明的慢病毒載體柱純化工藝為半自動化 操作，全部過程在百級實驗區域完成，避免人工操作的繁瑣和失誤以及污染幾率，所回收的 慢病毒載體在內毒素、支原體、滴度測定等指標上完全達到臨床標準。后續可跟進開發全自 動純化儀。
[0045]本發明所采用的第三代慢病毒骨架質粒pLenti_3G basic，與賓州大學Carl Η · June等人（Porter DL, Levine BL, Kalos M, Bagg A, June CH. Chimeric antigen receptormodified T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med 2011；365: 725-33.)所采用的第三代慢病毒載體相比，去除了噬菌體Π 復制起點，采用真核病毒SV40 復制子，增加了目的基因在真核細胞內的拷貝數，增強了真核表達效果。
[0046] 本發明所采用的第三代慢病毒骨架質粒pLenti-3G basic，采用enhancedWPRE元 件（即eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件），與賓州大學Carl H. June等人 (Porter DL,Levine BL,Kalos M,Bagg A,June CH.Chimeric antigen receptormodif ied T cells in chronic lymphoid leukemia.N Engl J Med2011;365:725_33·)所米用的 WPRE元件相比，有6個核苷酸的增強突變(g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、g.399G>A、g.400A >T、g. 411A>T)，能夠增強初級轉錄產物的多聚腺苷化，增加細胞內mRNA的含量，增強轉基因 的表達效率。
[0047]本發明采用的Lentival包裝系統是無輔助病毒的四質粒包裝系統，通過四種質粒 共同轉染至HEK293T/17細胞中，產生重組慢病毒載體。重組后的慢病毒載體是復制缺陷型 載體，能將外源片段整合入宿主基因，一次性使用，無法復制和增殖，安全性有很大提高。 [0048]本發明采用的慢病毒載體有帶熒光標簽zsGreenl的版本和不帶熒光標簽 zsGreenl版本，帶熒光標簽的版本用于體外實驗，不帶熒光標簽的版本用于臨床實驗，適用 范圍廣泛。
[0049]本發明優選采用第三代慢病毒載體，3'SIN LTR去除了U3區域，消除了慢病毒載體 自我復制的可能性，大大提高了安全性;增加了 cPPT和eWPRE元件，提高了轉導效率和轉基 因的表達效率;采用RSV啟動子保證了慢病毒載體包裝時核心RNA的持續高效轉錄;采用人 自身的EFla啟動子，使CAR基因能夠在人體內長時間持續表達。
[0050]可見，本發明所述的重組慢病毒載體將給前體B細胞急性淋巴細胞白血病（BCP-ALL)的CAR-T治療提供可靠的轉基因保障。
【附圖說明】
[0051 ]圖1是本發明所述的CAR的示意圖，其中圖1A是CAR的基本結構圖，圖1B是CAR的代 次改進示意圖；
[0052]圖2是本發明所述的慢病毒載體結構示意圖；其中圖2A是本發明采用的第三代慢 病毒載體結構示意圖，圖2B是第二代和第三代慢病毒載體結構比較示意圖；
[0053]圖3是本發明實施例1中構建本發明所述的重組慢病毒載體的構建流程圖。其中， 圖3(A)是慢病毒骨架質粒pLenti-3G basic的結構示意圖；圖3(B)是pCAR22-CLA質粒的結 構示意圖；圖3(C)是pCAR22-CLB質粒的結構示意圖；圖3(D)是pCAR22-0LC質粒的結構示意 圖；圖3(E)是慢病毒包裝質粒pPac-GP的結構示意圖；圖3(F)是慢病毒包裝質粒pPac-R的結 構示意圖；圖3(G)是膜蛋白pEnv-G的結構示意圖；
[0054]圖4是本發明實施例1中重組慢病毒質粒pCAR22-CLA的酶切預測及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖4A是重組慢病毒質粒pCAR22-CLA的酶切預測示意圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp，lane2是pCAR22-CLA的Sal 頂每切預測：條帶從上到下 依次為:8613&?、818&?、456&?;圖48是重組慢病毒質粒?041?22-〇^的酶切瓊脂糖凝膠電泳 圖，其中，lanel 是 lkb DNA ladder Marker 的電泳結果，lane2 是 pCAR22_CLA 的 Sal I 酶切電 泳結果；
[0055]圖5是本發明實施例1中重組慢病毒質粒pCAR22-CLB的酶切預測及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖5A是重組慢病毒質粒pCAR22-CLB的酶切預測示意圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp，lane2是pCAR22-CLB的BsrG I酶切預測：條帶從上到 下依次為:8592bp、1298bp;圖5B是重組慢病毒質粒pCAR22-CLB的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖， 其中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結果，lane2是pCAR22_CLB的BsrG I酶切電泳 結果；
[0056]圖6是本發明實施例1中重組慢病毒質粒pCAR22-0LC的酶切預測及酶切瓊脂糖凝 膠電泳圖；其中，圖6A是重組慢病毒質粒pCAR22-0LC的酶切預測示意圖，其中，lanel是lkb DNA ladder Marker:條帶從上到下依次為：10kb、8Kb、6kb、5Kb、4kb、3 · 5Kb、3Kb、2 · 5kb、 2Kb、1 · 5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp，lane2 是 pCAR22-0LC 的 Ncol 酶切預測：條帶從上到下 依次為：5867bp、4023bp;圖6B是重組慢病毒質粒pCAR22-0LC的酶切瓊脂糖凝膠電泳圖，其 中，lanel是lkb DNA ladder Marker的電泳結果，lane2是pCAR22_0LC的Nco I酶切電泳結 果；
[0057] 圖7是本發明實施例2中離子交換色譜法純化重組慢病毒載體的流程圖；
[0058] 圖8是本發明實施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的滴度檢測結果示意圖；
[0059] 圖9為本發明實施例2中重組慢病毒載體的不同純化方式的支原體檢測結果示意 圖，lanel為DL2000marker，從上到下條帶條帶從上到下依次為：2kb、lkb、750bp、500bp、 250bp、100bp; lane2為陽性對照；lane3為陰性對照；lane4為PBS; lane5為水；lane6為裂解 液;lane7為超速離心純化的慢病毒；lane8為高速離心純化的慢病毒；lane9為離子交換色 譜純化的慢病毒;lanelO為空細胞；
[0060] 圖10為本發明實施例3中mRNA相對表達量的柱狀圖，RT-QPCR結果表明CAR在TOMC 細胞內高效轉錄；
[0061 ]圖11為本發明實施例3中CAR蛋白表達量的WB檢測圖，結果表明CAR蛋白在TOMC細 胞內高效表達，圖11A中，lanel為PBMC空細胞，lane2為對照病毒MOCK，lane3為lvCAR22-CLA，lane4為lvCAR22-CLB，lane5為lvCAR22-0LC;圖 11B是beta-actin 內參條帶；
[0062]圖12為本發明實施例3中LDH檢測不同效靶比條件下的殺傷效率，E為效應細胞，T 為靶細胞；
[0063]圖13為本發明實施例3中qPCR檢測不同效靶比條件下細胞因子表達水平示意圖，Ε 為效應細胞，T為靶細胞;其中，圖13A表示a-2的mRNA轉錄水平；圖13B表示IFN- γ的mRNA轉 錄水平；
[0064]圖14為本發明實施例4中CAR22-T細胞在體外和體內的變化情況示意圖；圖14A表 示注射后，實驗組和對照組小鼠體內腫瘤隨時間變化的活體成像結果；圖14B表示注射后， 實驗組和對照組小鼠體內生物發光強度隨時間的變化曲線；圖14C表示注射后，實驗組和對 照組小鼠生存期隨時間的變化情況；
[0065]圖15是本發明實施例5中連續3個批次的第二代和第三代重組慢病毒載體的滴度 結果比較示意圖；
[0066] 圖16是本發明實施例6中LDH檢測不同效靶比條件下的殺傷效率示意圖，E為效應 細胞，T為靶細胞。
【具體實施方式】
[0067] 以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0068]實施例1構建重組慢病毒載體
[0069] 一、材料
[0070] 1、慢病毒骨架質粒pLenti-3G basic，慢病毒包裝質粒pPac-GP、pPac-R以及膜蛋 白質粒pEnv-G，HEK293T/17細胞、同源重組酶由世翱(上海)生物醫藥科技有限公司提供；
[0071] 2、引物:根據引物設計原則設計擴增DNA片段和靶位點所需的引物，該引物由上海 生物公司合成，具體為：
[0096] 3、SEQ ID N0.14、SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16、SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18、
SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20、SEQ ID N0.21、SEQ ID N0.22、SEQ ID N0.23、SEQ ID N0.24、SEQ ID N0.25、SEQ ID N0.26、SEQ ID N0.27、SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.31、、SEQ ID N0.32、SEQ ID N0.33、SEQ ID N0.34、SEQ ID N0.35、SEQ ID N0.36、SEQ ID N0.37、SEQ ID N0.38、SEQ ID N0.39、SEQ ID N0.40、SEQ ID N0.41、SEQ ID N0.42、SEQ ID N0.43、SEQ ID N0.44、SEQ ID N0.45、SEQ ID N0.46、SEQ ID N0.47、SEQ ID NO.48、SEQ ID NO.49所示的DNA序列由上海生物公司合成，并以寡核苷酸干粉或者質粒 形式保存；
[0097] 4、工具酶BsrG I、Nco I、ApaL I、Sac I、Cla I、Sal I、T4DNA連接酶均購自NEB公 司；
[0098] 5、高保真酶 PrimeSTAR、RN 購自 Takara 公司；
[0099] 6、0·22μηι-〇·8ym PES濾器購自millipore公司；
[0100] 7、質粒抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒均購自MN公司；
[0101] 8、感受態細胞T0P10購自Tiangen公司；
[0102] 9、NaCl、KC1、Na2HP〇4 · 12H20、KH2PO4、Tryp s i η、EDTA、CaCl 2、NaOH、PEG6000 均購自上 海生工；
[0103] 10、0?衍_1^]\^85、01^]\1、、1640、拖口68、購自11^1廿(^611公司 ；
[0104] 11'Biotinylated protein L購自GeneScript公司；
[0105] 12、辣根過氧化物酶標記的二抗、DAB工作液均購自北京中杉金橋；
[0106] 13、ECL+plusTM Western blotting system購自Amersham公司；
[0107] 14、DNeasy試劑盒購自上海捷瑞公司；
[0108] 15、淋巴細胞分離液購自深圳達科為公司；
[0109] 16、phycoerythrin(PE)_conjugated streptavidin購自BD Bioscience公司；
[0110] 17、SA-HRP購自上海翊圣公司； 18、支原體檢測試劑盒、內毒素檢測試劑盒、⑶22+K562細胞購自世翱(上海)公司； [0?12] 19、LDH檢測試劑盒購自promega公司。
[0113] 二、重組慢病毒載體 1vCAR22-CLA、1vCAR22-CLB、1vCAR22-0LC 的構建方法。
[0114] 參見圖3,本發明所述重組慢病毒載體的構建方法如下：
[0115] 1、將人EFla啟動子、CD81eader嵌合受體信號肽、CD22單鏈抗體輕鏈VUCommon Linker A.Common Linker B、0ptimal Linker C、CD22單鏈抗體重鏈VH、CD8Hinge嵌合受體 鉸鏈、CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD 137嵌合受體共刺激因子、TCR嵌合受體T細胞 激活域片段克隆至慢病毒骨架質粒pLenti-3G basic，分別得到重組慢病毒質粒?041?22-CLA，pCAR22-CLB，pCAR22-0LC 〇
[0116] (1)將慢病毒骨架質粒pLenti_3G basic使用Cla I和Sal I限制性內切酶進行雙 酶切，產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認8303bp的片段VI，并割膠回收置于Eppendorf 管內，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃 度；
[0118] 表1瓊脂糖凝膠回收步驟
[0119] (2)用引物EFla-F和EFla-R以合成的SEQ ID勵.14為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€2111丨11)*35〇7(316,72°(：1〇111丨11。產物經過 1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認1208bp的片段a，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司 的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0121] 表2 50μ1 PCR反應體系
[0122] (3)用引物CD81eader-F和CD81eader-R以合成的SEQIDN0.15為模板，使用表2中 的體系，PCR 循環條件為：98°C3min，（98°C10sec，55°C15sec，72°C30sec)*35cycle，72°C 5min。產物經過1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認10 lbp的片段b，并割膠回收置于Eppendorf管 內，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃 度；
[0123] (4)用引物VL-F和VL-R以合成的SEQ ID勵.16為模板，使用表2中的體系，？0?循環 條件為：98°C3min，（98。(：1〇86(3,55。(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35。7(316,721€5111丨11。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認336bp的片段c，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0124] (5)用引物CLA-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認424bp的片段d，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0125] (6)用引物CLB-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認430bp的片段e，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0126] (7)用引物0LC-VH-F和VH-R以合成的SEQ ID勵.20為模板，使用表2中的體系，卩〇? 循環條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35〇7(316,721€5111丨11。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認421bp的片段f，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0127] (8)用引物CD8Hinge-F和CD8Hinge-R以合成的SEQ ID N0.21為模板，使用表2中的 體系，PCR 循環條件為：98Γ3π?η，（98Γ?〇8θ(：，55Γ?58θ(3,72Γ3〇8 θ(3)*35ε7(3?θ，72Γ5π?η。 產物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認147bp的片段g，并割膠回收置于Eppendorf管內，用 MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0128] (9)用引物CD8Transmembrane-F和CD8Transmembrane-R以合成的SEQIDN0·22為 模板，使用表 2 中的體系，PCR 循環條件為：98°C3min，（98°C10sec，55°C15sec，72°C30sec)* 35cy c 1 e，7 2 °C 5min。產物經過1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳，確認1 OObp的片段h，并割膠回收置 于Eppendorf管內，用MN公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產 物的純度和濃度；
[0129] (10)用引物CD137-F和CD137-R以合成的SEQIDN0.23為模板，使用表2中的體系， PCR 循環條件為：981€3111丨11，（98。(：1〇86(3,55。(：1586(3,72 1€3〇86(3)*35。7(316,721€5111丨11。產物 經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認142bp的片段i，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公 司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0130] (11)用引物TCR-F和TCR-R以合成的SEQ ID ^).24為模板，使用表2中的體系，卩0? 循環條件為：981€3111丨11，（98°(：1〇86(3,55°(：1586(3,721€3〇86(3)*35〇7(316,72 1€5111丨11。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認355bp的片段j，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0131] (12)將DNA片段b、c、d各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內，PCR 循環條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認814bp的片段k，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0133] 表3 50μ1重疊 PCR反應體系
[0134] (13)將DNA片段b、c、e各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內，PCR 循環條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認820bp的片段1，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0135] (14)將DNA片段b、c、f各ΙμL作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入Eppendorf 管內，PCR 循環條件為：981€311^11，（98°(：1〇86(3,60°(：1〇86(3,721€3〇86(3)*6。7(316，加入引物 CDSleader-F/VL-RjgsriOsecJOriOsecJSTMOsec^^^ycleJSrSmin。產物經過 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認81 lbp的片段m，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN公司的 瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0136] (15 )將D N A片段g、h、i、j各1 μ 1作為模板，使用表3中的體系，除引物外加入 Eppendorf管內，PCR循環條件為：98°C3min，（98°C lOsec，60°C lOsec，72°C30sec)*6cycle， 加入引物 CDSHinge-F/TCR-R^gsriOsecJOriOsecJST^OsechSAcycleJSrSmin。產 物經過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，確認704bp的片段η，并割膠回收置于Eppendorf管內，用MN 公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收相應的片段(見表1)，并測定產物的純度和濃度；
[0137] (16)將DNA片段Vl、a、k、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內，加入同源重組酶反應液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉移至冰上放置2-3分鐘，將反 應液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養液，然后將管轉移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復蘇，取100μ1的轉化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養箱中37°C培養，16小時。挑取克隆進行菌落PCR鑒 定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質粒PCAR22-CLA，對正確的克隆進行酶切鑒定（見圖 4) ；
[0138] (17)將DNA片段Vl、a、l、n以5μl總體積且摩爾比l:l:l:l的比例加入Eppendorf管 內，加入同源重組酶反應液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉移至冰上放置2-3分鐘，將反 應液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養液，然后將管轉移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復蘇，取100μ1的轉化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養箱中37°C培養，16小時。挑取克隆進行菌落PCR鑒 定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質粒PCAR22-CLB，對正確的克隆進行酶切鑒定（見圖 5) ；
[0139] (18)將DNA片段Vl、a、m、n以5μ1總體積且摩爾比1:1:1:1的比例加入Eppendorf管 內，加入同源重組酶反應液15μ1，混勻后在42°C孵育30分鐘，轉移至冰上放置2-3分鐘，將反 應液加入50μ1 T0P10中，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30分鐘，將管放到預加溫到42 °C的恒溫水浴鍋中熱激90秒，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2-3分鐘，每管加900μ1 LB培養液，然后將管轉移到37 °C搖床上，溫育1小時使細菌復蘇，取100μΙ的轉化菌液涂布于 Amp LB瓊脂平板上，倒置平皿，于恒溫培養箱中37°C培養，16小時。挑取克隆進行菌落PCR鑒 定，鑒定正確的克隆即為重組慢病毒質粒PCAR22-0LC，對正確的克隆進行酶切鑒定（見圖 6)〇
[0140] 2、重組慢病毒載體 1 vCAR22-CLA、1 vCAR22-CLB、1VCAR22-0LC 的包裝。
[0141] (1)完全培養基:取出預熱好的新鮮培養基，加入10%FBS+5ml Pen-Srep，上下顛 倒混勻即可；
[0142] (2)1XPBS溶液：稱量NaCl 8g，KCl 0.2，Na2HP〇4.12H2〇 3.58g，KH2P04 0.24g置于 1000ml燒杯中，加入900ml Milli-Q grade超純水溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容 至1000ml，121°C高溫濕熱滅菌20min;
[0143] (3)0.25%Trypsin溶液：稱量Trypsin 2.5g，EDTA 0.19729g置于 1000ml燒杯中， 加入900ml 1XPBS溶解，溶解完成后，使用1000ml量筒定容至1000ml，0.22μΜ過濾除菌，長期 使用可保存至_20°C冰箱；
[0144] (4)0.5M CaC12溶液：稱量36.75g CaCl2用400ml Milli-Q grade超純水溶解；用 Mi 11 i-Q grade超純水將總體積定容至500ml，混勻;0.22μπι過濾除菌，分裝保存到50ml離心 管中，每管45ml左右，4°C保存。
[0145] (5)2XHBS溶液：稱量4.09g NaCl，0.269g Na2HP04,5.96g Hepes，用400ml Milli-Q grade超純水溶解;校準pH儀后，用2M NaOH溶液將HBS溶液的pH調到7 · 05。調整每瓶HBS的 PH消耗2M NaOH為3ml左右；
[0146] (6)從液氮罐中取出凍存的HEK293T/17細胞，迅速轉移到37°C水浴中，1~2min后 轉移到超凈臺中，無菌操作將凍存管中的液體全部轉移至l〇cm 2培養皿中，補足含10%FBS 的DMEM至8mL/l〇Cm2dish，24h后顯微鏡觀察細胞，細胞匯合的程度大于80 %進行傳代；
[0147] (7)選擇細胞狀態良好、無污染的HEK293T/17細胞，每2-6個培養皿為一組，將細胞 胰酶消化后，用電動移液器吸取4-12ml完全培養基，向每個消化后的培養皿中加2ml，避免 培養皿變干;使用lml移液器將所有細胞吹打成單細胞懸液，轉移到培養基瓶中；
[0148] (8)將上述2-6個培養皿中的剩余細胞轉移到培養基瓶中，并用培養基再沖洗一便 培養皿；
[0149] (9)蓋緊培養基瓶蓋，上下顛倒10次左右充分混勻細胞懸液，將細胞傳到8-24個 10cm 2培養皿中，每皿的細胞密度應當約4X 106個/10ml完全培養基左右。如果細胞密度和預 期的相差較大，則需要對細胞進行計數，然后按照4X10 6個/皿的量接種；
[0150] (10)每6個培養皿整理為一摞，注意保持上下皿之間的配合。將培養皿左右，前后 晃動數次，使細胞充分鋪開，然后放入5 % C02培養箱。剩余細胞做同樣處理；
[0151] (11)檢查所傳代細胞，細胞匯合度應當為70-80 %，輪廓飽滿，貼壁良好，在細胞培 養皿中均勾分布；
[0152] (12)為細胞換液，將培養基替換為新鮮完全培養基，每皿9ml，并將培養箱的0)2濃 度設定值提高到8%;(13)按照糾0.5配0嫩/0 &(：12溶液。每皿冊1(2931'/17細胞轉染質粒量按 照下列比例使用:重組慢病毒質粒(20yg)，pPac-GP (15yg)，pPac-R(1 Oyg)，pEnv-G(7 · 5yg)。 取一個新的5ml離心管，加入Ο · 5M CaC12:0 · 25ml，重組慢病毒質粒20yg: pPac-GP 15yg: pPac-R 10yg:pEnv_G 7.5yg，補充超純水至0.5ml蓋上蓋子，充分混勾；
[0153] (14)另取一支5ml離心管，加入0.5ml DNA/CaC12溶液。打開渦旋振蕩器，一只手拿 住5ml離心管的上端，使管底接觸振蕩頭，使液體在管壁上散開流動，另一只手拿一把lmL移 液槍，吸取0.5mL 2 X HBS溶液，緩慢滴加進入離心管，控制流速，以半分鐘滴完為宜。2 X HBS 加入后，繼續振蕩5秒鐘，停止振蕩，可直接加入需要轉染的細胞中；
[0154] (15)取一皿細胞，將離心管中的lmL鈣轉液滴加進去，盡可能使鈣轉試劑分布到整 個培養皿中；
[0155] (16)鈣轉液加入后，在皿蓋上做好標記，將培養皿放還到另一個5 % C02培養箱中。 確保培養皿水平放置，每摞培養皿不要超過6個。在5%C02培養箱中放置(6-8h);
[0156] (17)將第一個培養箱的C02濃度設定值調回到5% ;
[0157] (18)24小時后，檢查細胞狀態。細胞匯合度應當為80-85%左右，狀態良好。將培養 基吸走，更換l〇ml新鮮的DMEM完全培養基；
[0158] (19)48小時后，觀察轉染效率。絕大多數細胞仍然是貼壁的。可以看到超過95%細 胞都會帶有綠色熒光。將同一個病毒包裝上清液收集到一起，并向培養皿中繼續添加10mL 新鮮培養基；
[0159] (20)72小時后，再次將同一個病毒上清液收集到一起，兩次收集的病毒可以放在 一起，丟棄培養皿;此時收集的上清里包含了重組慢病毒載體lvCAR22-CLA、lvCAR22-CLB、 lvCAR22-0LC〇
[0160] 實施例2重組慢病毒載體的濃縮及檢測
[0161 ] -、超速離心法純化重組慢病毒載體；
[0162] (1)將收集的上清液分裝到50ml離心管中，500g室溫離心10min，除去細胞和大的 碎片；
[0163] (2)用0 · 22μπι-0 · 8μπι濾器過濾上清液；
[0164] (3)取6個Hitachi 40ΡΑ超速離心管，表面噴灑70%乙醇消毒，放在超凈臺用紫外 燈照射殺菌30分鐘。也可以通過高溫濕熱滅菌；
[0165] (4)將第2步處理好的細胞上清樣品分裝32ml到離心管中；
[0166] (5)蓋上金屬蓋，將離心管連同金屬蓋一起配平，用1XPBS調整使重量偏差在0.02g 范圍內；
[0167] (6)將配平的離心管對稱放置于超速離心轉子P50AT2中。設置離心轉速100,000g， 4°C離心2小時；
[0168] (7)離心結束后，小心將離心管從轉子中拿出，可以看到在離心管底有一小團沉 淀，用Marker筆在外管壁上做標記，倒掉上清。將離心管倒扣在預先鋪好的紙巾上，使殘余 液體流掉。可以用移液槍將掛在壁上的液滴吸走；
[0169] (8)向每個離心管中加入200μ1的Opti-MEM，用200μ1移液器吹打使沉淀溶解，盡量 減少泡沫的產生；
[0170] (9)將超速離心管插入50ml離心管中，蓋上蓋子，放入4°C冰箱過夜；
[0171] (10)500g，室溫離心lmin，使病毒液集中到管底；
[0172] (11)將所有相同的病毒濃縮液集中到一起，用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾;將病 毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進行長期保存；
[0173] 二、高速離心法純化重組慢病毒載體；
[0174] (1)將收集的上清液204ml使用0.22μπι-0.8μπι的PES濾器過濾；
[0175] (2)加入51ml 50%的PEG 6000溶液；
[0176] (3)加入21.711114]\1恥(：1溶液；
[0177] (4)加入23.3ml的PBS溶液，這時溶液總體積為300ml. PEG 6000的終濃度8.5%、
[0178] NaCl 終濃度 0.3M;
[0179] (5)將溶液分裝進250ml廣口瓶中，每份150ml;
[0180] (6) 4 °C放置1 · 5小時，每20-30分鐘混勻一次；
[0181] (7)4°C、7000g 離心 lOmin;
[0182] (8)離心后能看見管底有白色沉淀；
[0183] (9)小心棄去上清液，每瓶加入1.211115〇11^1^8-!1(：1(?!17.4)，劇烈搖晃重懸沉 淀；
[0184] (10)渦旋震蕩20-30秒進一步重懸沉淀；
[0185] (11)將病毒分成25到50μ1-管，凍存到-80°C冰箱，進行長期保存；
[0186] 三、離子交換色譜法純化重組慢病毒載體(如圖7所示）；
[0187] (1)將收集的上清液使用Thermo真空栗，經0 · 22μπι-0 · 8μπι的PES濾器抽濾，除去雜 質；
[0188] (2)按1:1 ~1:10的比例往上清中加入 1.5Μ NaCl 250mM Tris-HCl(pH 6-8);
[0189] (3)將2個離子交換柱串聯放置，用4ml 1M NaOH、4ml 1M NaCl、5ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液依次過柱；
[0190] (4)將步驟2中獲得的溶液通過蠕動栗以l-10ml/min的速度給離子交換柱上樣；
[0191] (5)全部上清液過柱后，使用10ml 0.15M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)溶液清洗 一遍；
[0192] (6)根據上樣量使用l-5ml 1.5M NaCl 25mM Tris-HCl(pH 6-8)進行洗脫，收集洗 脫液；
[0193] (7)將洗脫液分成25到50μ1-管，凍存到-80 °C冰箱，進行長期保存。
[0194] 四、滴度測定及比較；
[0195] (1)取24孔板接種293T細胞。每孔細胞為5 X 104個，所加培養基體積為500ul，不同 種類的細胞生長速度有所差異，進行病毒感染時的細胞融合率為40 % -60 % ;
[0196] (2)準備3個無菌EP管，在每個管中加入90ul的新鮮完全培養基（高糖DMEM+10% FBS)接種細胞24小時后，取兩個孔的細胞用血球計數板計數，確定感染時細胞的實際數目， 記為N;
[0197] (3)取待測定的病毒原液10ul加入到第一個管中，輕輕混勻后，取10ul加入到第二 個管中，然后依次操作直到最后一管；在每管中加入410ul完全培養基（高糖DMEM+10% FBS)，終體積為500ul;
[0198] (4)感染開始后20小時，除去培養上清，更換為500μ1完全培養基（高糖DMEM+10% FBS)，5%C02繼續培養48小時；
[0199] (5)72小時后，觀察熒光表達情況，正常情況下，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相 應減少，并拍照；
[0200] (6)用0.2ml 0.25%胰酶-EDTA溶液消化細胞，在37°C放置1分鐘。用培養基吹洗整 個細胞面，離心收集細胞。按照DNeasy試劑盒的說明抽提基因組DNA。每個樣品管中加入200 μL洗脫液洗下DNA并定量；
[0201] (7)準備目的DNA檢測qPCRmix總管I(QPCR引物序列為SEQ ID Ν0.44-SEQ ID NO.45)：
[0203] n = number of reactions.例如：總反應數為40,將lml2XTaqMan Universal PCR Master Mix，4μ1 forward primer,4μ1 reverse primer,4μ1 probe和788μ1 H2〇混和。震 蕩后放在冰上；
[0204] (8)準備內參DNA檢測qPCRmix管 Π (QPCR引物序列為SEQ ID Ν0.46SEQ ID NO.47)：
[0205] 2 XTaqMan Master Mix 25μ1 Xn
[0206] lOXRNaseP primer/probe mix 2.5μ1 Xn
[0207] H2O 17.5μLΧη
[0208] n = number of reactions.例如：總反應數為40,將 lml 2 XTaqMan Universal PCR Master Mix，100yll0XRNaseP primer/probe mix和700μ1 H2O混和。震蕩后放在冰 上；
[0209] (9)在預冷的96孔PCR板上完成PCR體系建立。從總管I中各取45μ1加入到A-D各行 的孔中，從總管Π 中各取45μ1加入到E-G各行的孔中。
[0210] (10)分別取5μ1質粒標準品和待測樣品基因組DNA加入到A-D行中，每個樣品重復1 次。另留1個孔加入5μ1的水做為無模板對照(no-template control)。
[0211] (11)分別取5μ1基因組標準品和待測樣品基因組DNA加入到E-G行中，每個樣品重 復1次。另留1個孔加入5μ1的水做為無模板對照(no-template control)。
[0212] (12)所使用定量PCR儀為ABI PRISM 7000定量系統。循環條件設定為:50°C2分鐘， 95 °C 10分鐘，然后是95 °C 15秒，60 °C 1分鐘的40個循環。
[0213] 數據分析:測得的DNA樣品中整合的慢病毒載體拷貝數用基因組數加以標定，得到 每基因組整合的病毒拷貝數。
[0214] 滴度（integration units per ml，IU ml-4 的計算公式如下：
[0215] IU mr1=(CXNXDX1000)/V
[0216] 其中：C =平均每基因組整合的病毒拷貝數 [0217] N=感染時細胞的數目（約為1X105)
[0218] D =病毒載體的稀釋倍數
[0219] V =加入的稀釋病毒的體積數
[0220] (13)重組慢病毒載體 1vCAR22-CLA、1vCAR22-CLB、1vCAR22-0LC 的滴度結果如圖 8 所示，離子交換色譜法的結果明顯優于超速離心法和高速離心法。
[0221]五、內毒素測定及比較；
[0222] (1)、內毒素工作標準品為15EU/支；
[0223] (2)、鱟試劑靈敏度λ = 〇· 25EU/ml，0· 5ml/管
[0224] (3)、內毒素標準品稀釋:取內毒素標準品一支，分別用BET水按比例稀釋成4λ和2λ 的溶解，封口膜封口，震蕩溶解15min;稀釋時每稀釋一步均應在漩渦混合器上混勻30s;
[0225] (4 )、加樣:取鱟試劑若干支，每支加入BET水0.5ml溶解，分裝至若干支無內毒素試 管中，每管0. lml。其中2支為陰性對照管，加入BET水0. lml;
[0226] 2支為陽性對照管，加入2λ濃度的內毒素工作標準品溶液〇. lml;
[0227] 2支為樣品陽性對照管，加入0.1ml含2λ內毒素標準品的樣品溶液(稀釋20倍的待 測樣品1πι1+4λ的內毒素標準品溶液lml = 2ml含2λ內毒素標準品的稀釋40倍樣品）。
[0228] 樣品管中加入0.1ml樣品，稀釋比例見表4,37±1 °C水浴（或培養箱）保溫60 土 lmin；
[0230] 表4內毒素稀釋比例及對應內毒素含量
[0231] (5)、重組慢病毒載體1vCAR22-CLA、1vCAR22-CLB、1vCAR22-0LC的內毒素檢測結果 (如表5所示），超速離心法的內毒素含量在20~40EU/ml之間，高速離心法的內毒素含量在 20~40EU/ml之間，離子交換色譜法的內毒素含量在1.25~2.5EU/ml之間明顯優于超速離 心法和高速離心法。
[0233] 表5重組慢病毒載體的不同純化方式的內毒素檢測結果
[0234] 六、支原體測定及比較；
[0235] (1)在實驗前三日，細胞樣品用無抗生素培養基進行培養；
[0236] (2)收集lml細胞懸浮液(細胞數大于1*105)，置于1.5ml離心管中；
[0237] (3) 13000 X g離心lmin，收集沉淀，棄去培養基；
[0238] (4)加入500ul PBS用槍頭吹吸或渦旋振蕩，重懸沉淀。13000Xg離心5min;
[0239] (5)步驟4重復一次；
[0240] (6)加入50μ1 Cell Lysis Buffer，用槍頭吹吸，充分混勻后，在55°C水浴中孵育 20min；
[0241] (7)將樣品置于95°C中加熱5min;
[0242] (8) 13000 X g離心5min后，取5μ1上清作為模板，25ylPCR反應體系為：ddH20 6 · 5μ 1、 Myco Mix 1μ1、2χ Taq Plus Mix Master(Dye ?1118)12.541、模板541;卩0?循環條件為： 95Γ3〇8θ(：，（95Γ3〇8θ(3,56Γ3〇8 θ(3,72Γ3〇8θ(3)*3(^7(3?θ，72Γ5π?η〇
[0243] (9)支原體檢測結果顯示(如圖9所示），超速離心法、高速離心法、離子交換色譜法 純化的重組慢病毒載體均不含支原體。
[0244] 可見，本發明采用離子交換色譜法純化重組慢病毒載體，與傳統的高速離心法和 超速離心法純化重組慢病毒載體相比，滴度測定結果以及內毒素測定結果明顯更優。
[0245] 實施例3重組慢病毒載體1vCAR22-CLA、1vCAR22-CLB、1vCAR22-0LC的功能檢測。
[0246] 一、CAR基因的細胞水平表達檢測：
[0247] (1)重組慢病毒載體 lvCAR22-CLA、lvCAR22-CLB、lvCAR22-0LC 感染 PBMC 細胞后，收 集細胞采用RT-PCR進行CAR mRNA轉錄水平的檢測，驗證CAR基因的表達，如果CAR mRNA轉錄 水平增高，則說明CAR基因的轉錄水平表達成功；
[0248] (2)重組慢病毒載體1￥〇六1?22-〇^、1￥〇41?22-〇^、1￥〇41?22-〇1^(：感染?81(：細胞后，收 集細胞采用western blot進行CAR蛋白表達水平的檢測，驗證CAR基因的表達，如果CAR蛋白 表達水平增高，則說明CAR基因的翻譯水平表達成功；
[0249] (3)分別將 M0I = 15 的 1vCAR22-CLA、1vCAR22-CLB、1vCAR22-0LC 和對照病毒 MOCK 感 染細胞，48h后提取6孔板中細胞的總RNA和總蛋白分別進行熒光定量PCR實驗和免疫印跡實 驗。具體步驟:包被6孔板的四個孔，每個孔加入相應的PBS和RN，4 °C過夜。12小時后按Μ0Ι = 15包被病毒，37 °C培養箱放置5h;取出的6孔板，棄掉病毒上清，用roS洗兩遍，按1*106/孔， 包被PBMC(用淋巴細胞分離液從人血中分離），加入500ul培養基(含10%血清、201]/111111^- 2、 Polybrene 8ug/ml)。靜置20min，1000g 2CTC離心30min，37°C培養48h〇
[0250] (4) Tr i ζο 1法提取6孔板中PBMC細胞的總RNA，逆轉錄擴增cDNA，用QPCR引物(序列 為SEQ ID N0.46SEQ ID NO.49)進行熒光定量PCR實驗，反應體系見表6,以內參Actin為 對照組，驗證其mRNA的轉錄情況。
[0252] 表6 20μ1 qPCR反應體系
[0253] (5)蛋白免疫印跡(Western B1 ot)通過聚丙烯酰胺凝膠電泳將從PBMC中提取的總 蛋白質按相對分子質量分離。采用濕轉(4°C，400mA，120min)，將蛋白轉移到PVDF膜上。用封 閉液（含5 %脫脂牛奶的TBST溶液）室溫封閉PVDF膜lh，封閉液1:1000稀釋Biotinylated protein L，然后與封閉好的PVDF膜室溫孵育4°C過夜。TBST洗膜3次，每次lOmin。封閉液1: 500稀釋相應的SA-HRP，室溫下孵育PVDF膜2h，TBST洗膜3次，每次lOmin。采用Amersham公司 ECL+plusTM Western blotting system試劑盒進行顯色。X光顯影獲得顯示條帶的膠片。 [0254] (6)RT-QPCR檢測顯示，重組慢病毒載體感染PBMC后的CAR的表達水平比對照病毒 MOCK和空細胞有明顯升高(如圖10所示），說明CAR基因的轉錄水平表達成功。
[0255] (7)蛋白免疫印跡(Western Blot)的結果表明，CAR蛋白在重組慢病毒系統中表達 (如圖11所示），說明CAR基因的翻譯水平表達成功。
[0256] 二、細胞因子分泌及殺傷效果評估。
[0257] (1)分別培養 CD22+K562 細胞和效應細胞 lvCAR22-CLA-PBMC、lvCAR22-CLB-PBMC、 lvCAR22-0LC-PBMC；
[0258] (2)收集靶細胞（CD22+K562)4xl05cells 和效應細胞（CART 細胞）2.8xl06cells， 800g，6min離心，棄上清；
[0259] (3)用1ml lxPBS溶液分別重懸靶細胞和效應細胞，800g，6min離心，棄上清；
[0260] (4)重復步驟3-次；
[0261] (5)用700ul培養基（1640培養基+10%FBS)重懸效應細胞，用2ml培養基（1640培養 基+10%FBS)重懸靶細胞；
[0262] (6)設置效靶比為1:1、5:1、10:1的實驗孔，并設置對照組，每組3個復孔；
[0263] (7)250xg，5min 平板離心；
[0264] (8) 37 °C 5 % C02培養箱中培養4小時；
[0265] (9)25〇xg，5min 平板離心；
[0266] (10)取每個孔的50ul上清到新96孔板中，并且每孔加入50ul底物溶液（避光操 作)；
[0267] (11)避光孵育25分鐘；
[0268] (12)每孔加入50ul終止液；
[0269] (13)酶標儀檢測490nm吸光度；
[0270] (14)將3個復孔取平均值;將所有實驗孔、靶細胞孔和效應細胞孔的吸光值減去培 養基背景吸光值的均值;將靶細胞最大值的吸光值減去體積校正對照吸光值的均值。
[0271] (15)將步驟14中獲得的經過校正的值帶入下面公式，計算每個效靶比所產生的細 胞毒性百分比。結果如圖12所示，重組慢病毒載體lvCAR22-0LC轉導的PBMC細胞在不同效靶 比條件下殺傷效率明顯高于1 vCAR2 2-CLA和1 vCAR2 2-CLB轉導的PBMC細胞；
[0272] 殺傷效率=(實驗孔-效應細胞孔-靶細胞孔)/(靶細胞最大孔-靶細胞孔)X100%
[0273] (16)重復準備一份步驟6的樣品用于qPCR檢測細胞因子表達水平，結果如圖13所 示，重組慢病毒載體lvCAR22-0LC轉導的PBMC細胞在不同效靶比條件下IL-2和IFN-γ的 mRNA轉錄水平明顯高于1 vCAR2 2-CLA和1 vCAR2 2-CLB轉導的PBMC細胞。
[0274] 實施例4、重組慢病毒載體lvCAR22_0LC(去除熒光標簽zsGreenl的版本）的臨床應 用
[0275] 根據文獻報道（Waleed Haso，Crystal L.Mackall et al .Anti-CD22-chime;ric antigen receptors targeting B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia .Blood，February 2013, Vol · 121(7)，1165-1174.)，CAR22載體針對前體B細胞急 性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)有著良好的效果。
[0276] 目前在www. clinical trial s · gov有3項針對⑶22的CAR-T臨床實驗正在招募病人， 分別是賓州大學的#%1'02650414和#%1'02588456，以及國立癌癥研究所的#%1'02315612， 相信不久就會有結果。本研究中使用表達CAR22基因的T淋巴細胞在小鼠體內針對CD22低表 達的人BCP-ALL細胞系NALM6-GL有良好的腫瘤殺傷效果。注射后3天、7天、15天后的活體成 像結果顯示，CAR22-T(HA22SH 28z)淋巴細胞在小鼠體內對NALM6-GL細胞系形成的腫瘤與 對照相比有一定的抑制作用，而CAR22-T(m971-28z)在小鼠體內對NALM6-GL細胞系形成的 腫瘤與對照相比有非常明顯的腫瘤殺傷作用（如圖15A所示）；CAR22-T(m971-28z)組注射的 小鼠，與CAR22-T(HA22SH 28z)組和對照組小鼠相比，隨著時間的增加，生物發光信號強度 變化幅度很小，說明腫瘤細胞受到明顯抑制(如圖15B所示）;Kaplan-Meier生存曲線結果顯 示，注射CAR22-T(m971-28z)淋巴細胞的實驗組與其余兩組相比有著更長的生存期（如圖 15C所示）。過繼性CAR22-T細胞療法在針對前體B細胞急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)的治 療方面擁有良好的前景。
[0277] 實施例5第三代慢病毒骨架載體3rdLV-CAR22與第二代慢病毒骨架載體2ndLV-CAR22滴度比較。
[0278] 分別構建3rdLV-CAR22和2ndLV-CAR22;質粒構建、病毒包裝、病毒超速離心濃縮、 滴度測定過程參考實施例1;連續3個批次的滴度結果如圖15所示，第三代慢病毒骨架載體 3rdLV-CAR22的滴度要優于第二代慢病毒骨架載體2ndLV-CAR22;因此，本發明優選使用第 三代慢病毒骨架載體作為CAR基因的搭載骨架。
[0279] 實施例6第二代CAR慢病毒載體3rdLV-2ndCAR22與第三代CAR慢病毒載體3rdLV-3rd CAR22殺傷效率比較。
[0280] 分別構建3rdLV-2ndCAR22和3rdLV-3rdCAR22;質粒構建、病毒包裝、病毒超速離心 濃縮、滴度測定過程參考實施例1;殺傷實驗參考實施例3 ;第二代CAR慢病毒載體3rdLV-2ndCAR22與第三代CAR慢病毒載體3rdLV-3rd CAR22殺傷效率結果比較如圖16所示，3rdLV-3rd CAR22針對靶細胞的殺傷效率在不同效靶比條件下并未表現的比3rdLV-2ndCAR22更高 效;因此，本發明優選使用第二代CAR設計的慢病毒載體作為臨床實驗載體。
【主權項】
1. 一種靶向CD22的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體，其特征在于，包括：用 于質粒復制的原核復制子PUC Ori序列，如SEQ ID NO.2所示；用于目的菌株大量擴增的含 氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列，如SEQ ID NO. 1所示；用于增強真核細胞內的復制的病毒復 制子SV400ri序列，如SEQ ID NO. 3所示；用于慢病毒包裝的慢病毒包裝順式元件；用于真核 細胞表達綠色熒光的ZsGreenl綠色熒光蛋白，如SEQ ID NO. 11所示；用于共同轉錄表達蛋 白質的IRES核糖體結合序列，如SEQ ID NO.12所示；用于嵌合抗原受體基因的真核轉錄的 人EFla啟動子，如SEQ ID NO. 14所示；用于增強轉基因的表達效率的eWPRE增強型土撥鼠乙 肝病毒轉錄后調控元件，如SEQ ID NO. 13所示；以及用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的 二代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體;所述用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二代CAR的 嵌合抗原受體包括：如SEQ ID NO. 15所示的CD8 leader嵌合受體信號肽、如SEQ ID NO. 16 所示的CD22單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO. 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.20 所示的⑶22單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO. 21所示的⑶8 Hinge嵌合受體鉸鏈、如SEQ ID NO.22所示的CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQ ID NO.23所示的CD137嵌合 受體共刺激因子、如SEQ ID NO.24所示的TCR嵌合受體T細胞激活域;所述用于組成集識別、 傳遞、啟動于一體的三代CAR的嵌合抗原受體包括:如SEQ ID NO. 15所示的⑶8 leader嵌合 受體信號肽、如SEQ ID NO. 16所示的CD22單鏈抗體輕鏈VL、如SEQ ID NO. 19所示的Optimal Linker C、如SEQ ID NO.20所示的CD22單鏈抗體重鏈VH、如SEQ ID NO.21所示的CD8 Hinge 嵌合受體鉸鏈、如SEQIDN0.22所示的CD8Transmembrane嵌合受體跨膜區、CD28、如SEQID NO. 23所示的⑶137嵌合受體共刺激因子、如SEQ ID NO. 24所示的TCR嵌合受體T細胞激活 域、以及如SEQ ID NO.25所示的⑶28嵌合受體共刺激因子。2. 如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第二代慢病毒 載體包括：如SEQIDN0.5所示的慢病毒5terminalLTR、如SEQIDN0.6所示的慢病毒 3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID N0.7所不的Gag順式元件、如SEQ ID N0.8 所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式 元件。3. 如權利要求1所述的載體，其特征在于，所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒 載體包括：如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5 terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID N0.7所不的Gag順式元件、如SEQ ID N0.8所 示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元 件所述慢病毒包裝順式元件，以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動子。4. 如權利要求1-3任一項所述的載體，其特征在于，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒 轉錄后調控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為:g. 396G>A、g. 397C>T、g. 398T>C、g. 399G> A、g.400A>T、g.411A>T〇5. -種如權利要求1所述的靶向CD22的復制缺陷性重組慢病毒的CAR-T轉基因載體的 構建方法，其特征在于，包括以下步驟： (1)將含氨芐青霉素抗性基因 AmpR序列（如SEQ ID NO. 1所示）、原核復制子pUC Ori序 列（如SEQ ID NO.2所示）、病毒復制子SV400ri序列（如SEQ ID NO.3所示）、用于慢病毒包裝 的慢病毒包裝順式元件、ZsGreenl綠色熒光蛋白（如SEQ ID NO. 11所示）、IRES核糖體結合 序列（如SEQ ID NO. 12所示）、eWPRE增強型土撥鼠乙肝病毒轉錄后調控元件（如SEQID NO. 13所示)存儲于慢病毒骨架質粒上； (2) 將人EFla啟動子(如SEQ ID NO. 14所示）、用于組成集識別、傳遞、啟動于一體的二 代CAR或三代CAR的嵌合抗原受體組合成二代CAR或三代CAR設計方案，經過酶切、連接、重組 反應克隆至慢病毒骨架質粒中，得到二代CAR或三代CAR設計的重組慢病毒質粒； (3) 將得到的重組慢病毒質粒與慢病毒包裝質粒pPac-GP、pPac_R以及膜蛋白質粒 pEnv-G共同轉染HEK293T/17細胞，在HEK293T/17細胞中進行基因轉錄表達后，包裝成功重 組慢病毒載體會釋放到細胞培養上清中，收集包含的重組慢病毒載體的上清液； (4) 將得到的重組慢病毒上清采用抽濾、吸附、洗脫的離子交換方式進行純化，分別得 到重組慢病毒載體。6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述慢病毒包裝順式元件采用第 二代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO.5所示的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO.6所示的 慢病毒3 terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所不的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的 cPPT順式元件;所述慢病毒包裝順式元件采用第三代慢病毒載體包括:如SEQ ID NO. 5所示 的慢病毒5terminal LTR、如SEQ ID NO. 6所不的慢病毒3terminal Self-Inactivating LTR、如SEQ ID NO.7所示的Gag順式元件、如SEQ ID NO.8所示的RRE順式元件、如SEQ ID NO.9所示的env順式元件、如SEQ ID NO. 10所示的cPPT順式元件所述慢病毒包裝順式元件， 以及如SEQ ID NO.4所示的RSV啟動子。7. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，所述eWPRE增強型土撥鼠乙肝病 毒轉錄后調控元件有6個核苷酸的增強突變，具體為：g.396G>A、g.397C>T、g.398T>C、 g·399G>A、g·400A>T、g·411A>T。8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，由人EFla啟動子啟動整個CAR基 因表達;CD8 leader嵌合受體信號肽位于CAR編碼序列的N端，用于引導CAR蛋白定位于細胞 膜;CD22單鏈抗體輕鏈VL、Optimal Linker C、CD22單鏈抗體重鏈VH組合成scfv區域，用于 識別CD22抗原；CD8 Hinge嵌合受體鉸鏈用于將scfv錨定于細胞膜外側；CD8 Transmembrane嵌合受體跨膜區用于將整個嵌合受體固定于細胞膜上;CD137嵌合受體共刺 激因子用于刺激T細胞增殖和細胞因子分泌;TCR嵌合受體T細胞激活域用于激活下游信號 通路的表達;當scfv區域與CD22抗原結合時，信號通過嵌合受體傳遞至細胞內，從而產生包 括T細胞增殖、細胞因子分泌增加、抗細胞凋亡蛋白分泌增加、細胞死亡延遲、裂解靶細胞的 一系列生物學效應。9. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述慢病毒載體有帶熒光標簽 zsGreenl的版本和不帶焚光標簽zsGreenl版本，帶焚光標簽的版本用于體外實驗，不帶焚 光標簽的版本用于臨床實驗。10. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，所述抽濾步驟要控制上清體積 在200ml~2000ml，控制真空度在-0.5MPA~-0.9MPA，防止由于堵孔帶來的載體損失;所述 吸附步驟要控制溶液的PH值在6~8,防止PH的變化導致載體失活;所述洗脫步驟要控制洗 脫液的離子強度在0.5M~1.0M，防止離子強度的變化導致洗脫不完全或者載體失活。11. 如權利要求1-4任一項所述的載體在制備過繼性細胞治療藥物中的應用。12. 如權利要求11所述的應用，其特征在于，所述過繼性細胞治療藥物為前體B細胞急 性淋巴細胞白血病治療藥物。
【文檔編號】A61K35/17GK105950662SQ201610326101
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】祁偉, 俞磊, 林高武
【申請人】上海優卡迪生物醫藥科技有限公司