一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和遷移的腺病毒載體及其應用

            文檔序號:10589147閱讀:544來源:國知局
            一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和遷移的腺病毒載體及其應用
            【專利摘要】本發明公開了一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和遷移的腺病毒載體及其應用,該腺病毒載體的多克隆位點處插入有目的基因和miRNA的調控序列。動脈粥樣硬化性疾病介入治療術后,再狹窄的主要原理在于平滑肌細胞遷移至內膜并進行病態性增殖,應用本發明腺病毒本載體可以很好抑制平滑肌細胞增殖和遷移等運動,從而達到防止再狹窄的發生。本發明腺病毒載體基于miRNA調控,可實現特異性抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移,而對血管內皮細胞影響甚微,因此,不會影響內皮的修復,從而減少血栓形成的風險,有望減少抗血小板藥的使用和出血的發生;可提高介入治療動脈粥樣硬化性疾病的效果。
            【專利說明】
            一種特異性抑制平滑肌細胞増殖和遷移的腺病毒載體及其 應用
            技術領域
            [0001] 本發明涉及一種基于miRNA調控的特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的重組腺病 毒載體及其用途。
            【背景技術】
            [0002] 下肢動脈硬化閉塞癥(lower extremity arteriosclerosis obliterans, LEASO),是由于下肢動脈粥樣硬化,動脈管腔進行性狹窄甚至出現閉塞所導致的慢性下肢 缺血性疾病。LEAS0的發病率較高。大量的流行病學研究結果顯示,大約有10-20%的老年人 (大于60歲)罹患LEAS0 m。在國內,一項基于北京社區的橫斷面研究結果提示,LEAS0在我 國老年人群中的患病率為12.9%m。隨著人口的老齡化,LEAS0的發病率還有逐年升高的趨 勢。
            [0003] LEAS0典型的癥狀為間歇性跛行,而更加嚴重的臨床表現(critical limb ischemia,嚴重下肢缺血)包括靜息痛和足趾的潰瘍壞疽。而一旦進展為嚴重下肢缺血,預 后極差。在Norg renm等的研究中,單純保守治療的嚴重LEAS0患者,1年死亡或者需要截 肢的比例達到了33%(截肢或死亡人數:總人數=86:266)。Jones 【4】等則對2730742名LEAS0 患者的預后進行了研究,納入患者的病變程度包含了各個分期,總的截肢率高達5.79%。 LEAS0嚴重危害著人類的健康。
            [0004] 以球囊擴張成形以及支架血管成形術為基礎的腔內治療(endovascular treatment)是近年來發展起來的針對動脈粥樣硬化性疾病微創的治療手段。該技術具有創 傷小、可重復性強、手術并發癥少等優點,已成為當今動脈粥樣硬化性疾病外科治療的首 選。
            [0005] 然而,目前基于球囊和支架的腔內治療存在兩個問題:①術后再狹窄 (restenosis),其原因在于球囊擴張或者支架植入后對血管的急性損傷,刺激血管內膜平 滑肌細胞增殖并迀移到內膜,從而導致內膜病態增厚,最終導致術后再狹窄據。據報道,介 入治療LEAS01年術后再狹窄的發生率為20%~40% [5]。②術后早期及晚期血栓形成:球囊及 支架在擴張血管過程中會損傷內皮。內皮損傷后,首先激活血小板的是與血小板接觸的膠 原,繼后凝血鏈鎖反應被啟動而產生了凝血酶,并且血小板繼續地被活化又不斷釋出二磷 酸腺苷和血栓素 A2,隨血流而來的是血小板在局部不斷地被激活,最終導致血栓形成[6]。盡 管術后常規使用抗血小板治療可以減少血栓的風險,但是血栓形成的事件仍有發生。并且, 由于抗血細胞板藥物的使用,會增加出血的風險。
            [0006] 藥物洗脫球囊和支架指的是承載有藥物并按照一定速率釋放的球囊和支架,即在 其表面覆蓋一層抗增殖藥物,旨在支撐病變管腔的同時,通過承載的藥物在局部發揮抗平 滑肌細胞增殖的作用。藥物洗脫球囊和支架的應用,是腔內治療心血管疾病的一次革新。藥 物洗脫球囊和支架能夠明顯抑制平滑肌細胞的病態增生,提高遠期通暢率,成為下肢動脈 腔內治療中最具有前景的技術然而,藥物洗脫球囊和支架在抑制平滑肌細胞增殖的 同時,也抑制了內皮細胞的增殖。另外,鑒于內皮損傷是術后再狹窄發生的始動環節,藥物 洗脫球囊或者支架抑制損傷內皮的修復,可能一定程度上影響了其減少術后再狹窄的性 能。值得關注的是,有研究表明,藥物洗脫球囊和支架在使用過程中,晚期血栓形成的發生 率升高,主要原因在于:藥物洗脫球囊和支架非選擇性地抑制了內皮細胞,從而影響了內皮 的修復 121。
            [0007] 因此,尋找一種方法,使其特異性的抑制平滑肌細胞的增殖和迀移,而對內皮細胞 的影響甚微。成為未來支架發展的熱點和難點。
            [0008] 基因治療是一種較新型的治療手段,可治療多種疾病,包括癌癥、遺傳病、感染性 疾病、心血管疾病和自身免疫性疾病。過去十幾年里,全世界的基因治療取得了巨大的進 步。截止2008年9月,臨床試驗總數已達1432項。腺病毒是目前基因治療最常見的載體之一, 全球近1/4的基因治療臨床試驗方案采用腺病毒作為載體。
            [0009] 微小RNA(microRNA)是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單 鏈RNA分子,它主要是通過與蛋白編碼基因的UTR-3'端的沉默子結合,抑制信使RNA蛋白的 翻譯或促進信息RNA的降解,從而在轉錄后水平上發揮調控基因蛋白表達的作用。
            [0010] TPM1基因,即ΤΡΜα基因,在哺乳類及鳥類都有表達。TPM1基因主要編碼骨骼肌 α_原肌球蛋白和其他異構體,包括平滑肌α-ΤΜ;既往認為,ΤΡΜ1蛋白僅在肌肉組織的運動 中發揮作用,然而,近年來,越來越多的研究發現,ΤΡΜ作為抑癌基因,在神經膠質瘤、結腸 癌等的生物學行為方面同樣發揮著重要的作用。
            [0011] 藥物洗脫球囊和支架已經成為動脈粥樣硬化疾病腔內治療中最具有前景的技術 之一。然而,藥物洗脫球囊和支架在抑制平滑肌細胞增殖的同時,也抑制了內皮細胞的增 殖。其主要問題在于:抑制內皮的修復,增加血栓的風險并減弱自身的抗再狹窄性能。實現 特異性地抑制平滑肌細胞,而對內皮細胞的影響甚微是本發明的目的。
            [0012] 參考文獻: 1. Lloyd-Jones D, Adams RJ, Brown TM, et al. Heart disease and stroke statistics-2010 update : a report from the American Heart Association. Circulation. Feb 23 2010;121(7):e46-e215. 2. 王潔,李小鷹,何耀等,北京市萬壽路地區老年人群周圍動脈硬化閉塞病橫斷面調 查,中華流行病學雜志,2004年3月,第2 5卷第3期:221-4 3. Norgren L, Hiatt WR, Dormandy JA, et al. Inter-Society Consensus for the Management of Peripheral Arterial Disease (TASC II). European journal of vascular and endovascular surgery : the official journal of the European Society for Vascular Surgery. 2007;33 Suppl 1:Sl-75. 4. Jones WS, Patel MR, Dai D,et al. Temporal trends and geographic variation of lower-extremity amputation in patients with peripheral artery disease: results from U.S. Medicare 2000-2008. Journal of the American College of Cardiology. Nov 20 2012;60(21):2230-2236. 5. Curcio A, Torella D, Indolfi C. Mechanisms of smooth muscle cell proliferation and endothelial regeneration after vascular injury and stenting: approach to therapy. Circulation journal : official journal of the Japanese Circulation Society. 2011;75(6):1287-1296. 6·Pereira-da-Si1va T, Bernardes L, Cacela D, et al. Safety and effectiveness of the Genous endothelial progenitor cell-capture stent: follow-up to 5 years. The Journal of invasive cardiology. Dec 2013;25(12): 666-669. 7.Scheinert D, Katsanos K, Zeller T, et al. A prospective randomized multicenter comparison of balloon angioplasty and infrapopliteal stenting with the sirolimus-eluting stent in patients with ischemic peripheral arterial disease: 1-year results from the ACHILLES trial. Journal of the American College of Cardiology. Dec 4 2012;60(22):2290-2295. 8. Rastan A, Brechtel K, Krankenberg H, et al. Sirolimus-eluting stents for treatment of infrapopliteal arteries reduce clinical event rate compared to bare-metal stents: long-term results from a randomized trial. Journal of the American College of Cardiology. Aug 14 2012;60(7):587-591. 9. Dake MD,Ansel GM,Jaff MR, et al. Paditaxel-eluting stents show superiority to balloon angioplasty and bare metal stents in femoropopliteal disease : twelve-month Zi1ver PTX randomized study results . Circulation· Cardiovascular interventions. Oct 1 2011;4(5):495-504. 10. Cassese S,Byrne RA,Ott I,et al. Paclitaxel-coated versus uncoated balloon angioplasty reduces target lesion revascularization in patients with femoropopliteal arterial disease : a meta-analysis of randomized trials . Circulation. Cardiovascular interventions. Aug 1 2012; 5(4): 582-589· 11. Joner M, Finn AV, Farb A, et al. Pathology of drug-eluting stents in humans: delayed healing and late thrombotic risk. Journal of the American College of Cardiology. Jul 4 2006;48(1):193-202. 12. Awata M, Kotani J, Uematsu M, et al. Serial angioscopic evidence of incomplete neointimal coverage after sirolimus-eluting stent implantation: comparison with bare-metal stents. Circulation. Aug 21 2007;116(8):910_916〇

            【發明內容】

            [0013] 為了尋找一種能夠特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移,而對內皮細胞影響甚微的 方法,從而達到治療血管硬化的理想效果。本發明通過研究構建了一種腺病毒載體,該載體 通過球囊或者支架實現局部轉染,最終實現特異性抑制平滑肌細胞而對內皮細胞影響甚微 的目的。
            [0014] 本發明的目的在于提供一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體。
            [0015] 本發明的另一目的在于提供上述腺病毒載體的應用 本發明所采取的技術方案是: 一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體,該腺病毒載體的多克隆位點處 插入有目的基因和miRNA的調控序列; 所述目的基因選自基因77W/、W份?、似設沒戶劃網/?基因中的至少一 種; 所述miRNA的調控序列選自miR-126-3p的反向互補序列、miR-1298的反向互補序列、 miR-140_3p的反向互補序列、miR_125b的反向互補序列、miR-100的反向互補序列、miR-24 的反向互補序列中的至少一種。
            [0016] 進一步的,所述腺病毒載體的骨架選自GV135、GV314、pXCl、pAdEasy-l、pADtreak-CMV、AdMax中的至少一種。
            [0017] 優選的,所述miRNA的調控序列為至少2個串聯的miR-126-3p反向補互序列、或至 少2個串聯的miR-1298反向補互序列、或至少2個串聯的miR-140-3p反向補互序列、或至少2 個串聯的miR-125b反向補互序列、或至少2個串聯的miR-100反向補互序列、或至少2個串聯 的miR-24反向補互序列。
            [0018] 上述任一所述腺病毒載體在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。
            [0019] 進一步的,所述的動脈粥樣硬化性疾病為下肢動脈硬化閉塞癥、頸動脈狹窄、冠心 病、腦血管的狹窄、腎動脈及內臟動脈的狹窄。
            [0020] 上述任一所述腺病毒載體在制備防治血栓藥物中的應用。
            [0021] 進一步的,所述血栓為脈粥樣硬化性疾病介入治療后引發的血栓 含有上述任一所述腺病毒載體的腺病毒。 進一步的,所述腺病毒在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。
            [0022] 進一步的,所述腺病毒在制備防治血栓藥物中的應用。
            [0023]本發明的有益效果是: 1)動脈粥樣硬化性疾病介入治療術后,再狹窄的主要原理在于平滑肌細胞迀移至內膜 并進行病態性增殖,應用本發明腺病毒本載體可以很好抑制平滑肌細胞增殖和迀移等運 動,從而達到防止再狹窄的發生。
            [0024] 2)本發明腺病毒載體可以通過基于球囊或者支架的介入技術,實現重組載體的局 部轉染,適用于動脈粥樣硬化性疾病;本發明腺病毒載體基于miRNA調控,可實現特異性抑 制血管平滑肌細胞增殖和迀移,而對血管內皮細胞影響甚微,因此,不會影響內皮的修復, 從而減少血栓形成的風險,有望減少抗血小板藥的使用和出血的發生。
            [0025] 3)本發明通過構建一種腺病毒載體,通過球囊或者支架實現局部轉染,最終實現 特異性抑制平滑肌細胞而對內皮細胞影響甚微的目的。使用球囊或者支架轉染本發明重組 載體,可以減少介入治療后,防止術后再狹窄的發生。并且由于其對內皮細胞的影響甚微, 因此,不會影響內皮的修復,從而減少血栓形成的風險,有望減少抗血小板藥的使用和出血 的發生。
            【附圖說明】
            [0026] 圖1為重組載體ad-TPMl-miR-126-3pTS的示意圖,在腺病毒GV135的MCS區插入 TPM1及其3'端的miR-126-3p調控區; 圖2為本發明重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS對平滑肌細胞和內皮細胞增殖的 檢測結果,n=3,*P〈0 · 05,***P〈0 · 001; 圖3為本發明重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS抑制平滑肌細胞的迀移,n=3,*P〈 0·05,***Ρ〈0·001; 圖4為管腔形成檢測本發明重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS對血管內皮功能的 影響,n=3; 圖5為豬髂動脈經不同球囊擴張后動脈再狹窄的情況檢測;a.普通球囊介入組28天后 再狹窄情況;b.ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入組28天后再狹窄情況。
            【具體實施方式】
            [0027] -種特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體,該腺病毒載體的多克隆位 點處插入有目的基因和miRNA的調控序列; 所述目的基因選自基因77W/、W份?、似設沒戶劃網/?基因中的至少一 種; 所述miRNA的調控序列選自miR-126-3p的反向互補序列、miR-1298的反向互補序列、 miR-140_3p的反向互補序列、miR_125b的反向互補序列、miR-100的反向互補序列、miR-24 的反向互補序列中的至少一種。
            [0028] 優選的,所述腺病毒載體的骨架選自GVnSJVSltpXCUpAdEasy-UpADtreak-CMVjdMax 中 的至少一種。
            [0029] 優選的,所述miRNA的調控序列為至少2個串聯的miR-126-3p反向補互序列、或至 少2個串聯的miR-1298反向補互序列、或至少2個串聯的miR-140-3p反向補互序列、或至少2 個串聯的miR-125b反向補互序列、或至少2個串聯的miR-100反向補互序列、或至少2個串聯 的miR-24反向補互序列。
            [0030] 優選的,所述基因的堿基序列如SEQ ID N0:1所示; 所述基因6^皿/32/3(復制抑制因子)的喊基序列如SEQ ID N0:2所不; 所述基因恐'所久熱休克蛋白60)的堿基序列如SEQ ID N0:3所示; 所述基因胡勺堿基序列如SEQ ID N0:4所示; 所述基因 C7?/?的堿基序列為如SEQIDNO:5所示; 所述基因的堿基序列如SEQ ID NO:6所示; miR-126-3p反向補互序列為:5'-CGCATTATTACTCACGGTACGA-3'(SEQIDN0 :7); miR-1298反向補互序列為:5'-TACATCTGGACAGCCGAATGAA-3'(SEQ ID N0:8); miR-140-3p反向補互序列為:5'-CCGTGGTTCTACCCTGTGGTA-3'(SEQIDN0 :9); miR-125b反向補互序列為:5'-TCACAAGTTAGGGTCTCAGGGA-3'(SEQ ID N0:10); miR-100反向補互序列為:5'-CACAAGTTCGGATCTACGGGTT-3'(SEQ ID N0:11); miR-24反向補互序列為:5'-CTGTTCCTGCTGAACTGAGCCA-3'(SEQ ID N0:12)。
            [0031] 上述任一所述腺病毒載體在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。
            [0032] 優選的,所述的動脈粥樣硬化性疾病為下肢動脈硬化閉塞癥、頸動脈狹窄、冠心 病、腦血管的狹窄、腎動脈及內臟動脈的狹窄。
            [0033] 上述任一所述腺病毒載體在制備防治血栓藥物中的應用。
            [0034] 優選的,所述血栓為脈粥樣硬化性疾病介入治療后引發的血栓 含有上述任一所述腺病毒載體的腺病毒。 優選的,所述腺病毒在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。
            [0035] 優選的,所述腺病毒在制備防治血栓藥物中的應用。
            [0036] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明,但并不局限于此。
            [0037] 實施例1特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 (1)穿梭質粒 pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS 的構建 1)TPM1序列的擴增 用引物TPM1-F:5,-agatctGCCACCATGGACGCCATCAAGAAG-3,(SEQ ID NO: 13)和TPM1-R: 5 ' -gtcgacTTACTATGGAAGTCATATCGTTGAGAG-3 '( SEQ ID NO: 14)從人的cDNA庫中克隆TPM1 序 列,引物中的劃線部分分別為取邏:、?酶切位點。
            [0038] 2)TPMl-miR-126-3pTS 片段的構建 TPMl-miR-126-3pTS片段為在上述TPM1序列的3'端再連上miRNA的調控序列,所述 miRNA的調控序列為4個串聯的miR-126-3p的反向互補序列(miR-126-3p的反向互補序列如 SEQ ID 從):7所示)。
            [0039] TPMl-miR-126-3pTS片段的具體操作方法為:先合成含4個串聯的miR-126-3p反向 互補序列的序列:5'-tcgacAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATCCGCATTATTACTCACGGT ACGAAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATCCGCATTATTACTCACGGTACGAAATC-3'(SEQ ID NO: 15),該序列兩端設有粘性末端,與經I酶切后形成的粘性末端相同,4個miR-126-3p反 向互補序列間通過加入4個堿基連接在一起(連接多個基因序列常用的手段)。然后將步驟 1)中克隆的TPM1序列經酶切后,與合成的SEQ ID N0:15序列進行連接,得到TPMl-miR-126-3pTS片段。
            [0040] 3)穿梭質粒 pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS 的構建 以上步所得 TPMl-miR-126-3TS片段為模板,用引物TPMl-miR-126-3pTS-F 和 TPMl-miR-126-3pTS-R進行擴增,擴增所得片段與穿梭載體pShuttle-IRES-hrGFP-1分別用你遽?和 處〇 I:進行雙酶切,將酶切后的片段進行連接,即得穿梭質粒pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS〇
            [0041 ]上述引物 TPM1 -miR-126-3pTS-F 和 TPM1 -miR-126-3pTS-R 的序列如下所示: TPMl-miR-126-3pTS-F:5,-agatctGCCACCATGGACGCCATCAAGAAG-3,(SEQ ID NO:16),其 中劃線部分為取想位點; TPMl-miR-126-3pTS-R:5'-ctcgagATTCGTACCGTGAGTAATAATGCG-3 '(SEQ ID NO: 17),戈ij 線部分為處〇 酶切位點。
            [0042] (2)重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS的構建及富集 先將腺病毒載體GV135轉化入大腸桿菌DH5ci,制備好感受態細菌。然后將經Pme I線性 化后的pShuttle-TPMl-miR-126-3pTS載體轉化到感受態細菌中進行同源重組,獲得重組腺 病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS。接種于含有氨芐抗性的瓊脂平皿,挑選陽性菌落,用小量 質粒提取試劑盒提取質粒。而后1.2%瓊脂糖凝膠電泳,鑒定陽性克隆,并對陽性質粒進行測 序。所構建重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS的示意圖如圖1所示。
            [0043] (3)293A細胞內包裝及擴增重組腺病毒 1)用Pac I線性化重組腺病毒載體ad- TPMl-miR-126-3pTS質粒,使其暴露兩端的重組 序列。六孔板培養的HEK293細胞長至密度約50%~70%,用lipofectamine 2000轉染經Pac I線性化的ad-TPMl-miR-126-3pTS質粒。轉染約8~10天后,可觀察到HEK293細胞呈現包裝 成功的表型,即GFP聚集成彗星狀,細胞也會出現典型的細胞病理反應(cytopathic effect,CPE)。待細胞出現完全CPE后,收集細胞,液氮/37 °C反復凍融三次,使病毒充分釋 放后,4 °C,5000 rpm,離心10 min,收集上清得到首輪腺病毒。
            [0044] 2)為提高病毒滴度,將首輪腺病毒作為種子進行腺病毒的擴增。以相同密度在培 養皿(100 mm)中接種293細胞,生長密度約為90%時按1:10加入病毒進行擴增,出現完全CPE 后,再次收集細胞作為感染種子。每個病毒至少擴增50塊10cm培養皿。
            [0045] 3)氯化銫梯度純化腺病毒 腺病毒的純化在超速離心機(Backman,Optima L-100xp)上進行。新鮮配制密度分別為 1.25 g/ml、1.35 g/ml、1.40 g/ml的CsCl溶液(用PBS配制hCsCl梯度離心分2步進行:1)把 2 ml 1.25 g/ml的CsCl放入Backman SW 41Ti轉頭的配套離心管中,然后在底層加入1 ml 1.4 g/ml的CsCl,最后加入9 ml含有腺病毒的細胞裂解液。36000 rpm,4°C離心60 min,病 毒濃集在兩層CsCl之間,呈亮白色帶狀。2)用5 ml注射器轉移病毒帶至Backman VTi 90轉 頭相應的熱封管中,用1.35 g/ml的CsCl將熱封管注滿。熱封后,65000 rpm,4°C離心3 h。用 lml注射器側穿刺收集管中央的病毒帶。純化后的腺病毒經透析去除CsCl,然后進行OD260測 量,并計算其病毒顆粒數(VP),A 26Q=1.0時對應1.1 X 1012 VP/ml。我們獲得的腺病毒滴度一 般>1012VP/ml。
            [0046] 實施例2特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 本實施例制備腺病毒載體的方法同實施例1,除了其中用到的目的基因為復 制抑制因子,GMNN),其堿基序列如SEQ ID N0:2所示,用到的miRNA調控序列為4個串聯的 miR-1298反向補互序列(miR-1298反向補互序列如SEQ ID N0:8所示),其他操作均同實施 例1,所得腺病毒載體簡稱為ad-GMNN-miR-1298TS。
            [0047] 實施例3特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 本實施例制備腺病毒載體的方法同實施例1,除了用到的miRNA調控序列為4個串聯的 miR-140_3p反向補互序列(miR-140_3p反向補互序列如SEQ ID N0:9所示),其他操作均同 實施例1,所得腺病毒載體簡稱為ad- TPMl-miR-140-3pTS。
            [0048] 實施例4特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 本實施例制備腺病毒載體的方法同實施例1,除了其中用到的目的基因為//57?^(熱休 克蛋白60),其堿基序列如SEQ ID N0:3所示,用到的miRNA調控序列為4個串聯的miR-125b 反向補互序列(miR-125b反向補互序列如SEQ ID NO: 10所示),其他操作均同實施例1,所得 腺病毒載體簡稱為ad-HSP60-miR-125bTS。
            [0049] 實施例5特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 本實施例制備腺病毒載體的方法同實施例1,除了其中用到的目的基因為似7^4,其堿 基序列如SEQ ID N0:4所示,用到的miRNA調控序列為4個串聯的miR-100反向補互序列 (miR-100反向補互序列如SEQ ID ^):11所示),其他操作均同實施例1,所得腺病毒載體簡 稱為 ad-GATA-6-miR-100TS。
            [0050] 實施例6特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體的制備方法 本實施例制備腺病毒載體的方法同實施例1,除了其中用到的目的基因為其堿基 序列如SEQ ID勵:5所示,用到的11^1?熟調控序列為4個串聯的1^1?-24反向補互序列(1^1?-24 反向補互序列如SEQ ID N0:12所示),其他操作均同實施例1,所得腺病毒載體簡稱為ad-CRP2-miR-24TS〇
            [0051]實施例7本發明腺病毒載體對血管平滑肌細胞和內皮細胞增殖的影響 為了研究本發明構建的腺病毒載體是否對平滑肌細胞具有特異的抑制作用,進行了以 下實驗。
            [0052]實驗方法: 分別設置空白組、模擬陰性對照組(空載體)和實驗組(ad-TPMl -miR-126-3pTS),3組實 驗分別經CCK-8實驗驗證其對于內皮細胞和平滑肌細胞的影響。
            [0053] 1)取對數生長期的內皮/平滑肌細胞,消化、離心后以5X103個/孔接種于96孔板 中,設置4個復孔,每孔加培養基至100ul,融合度約60%時轉染。將細胞培養板在培養箱中預 培養24h(37°C,5% C02的條件下)。
            [0054] 2)用iMAX試劑進行轉染(空白組轉染水、模擬陰性對照組轉染空載體、實驗組轉染 重組載體ad-TPMl-miR-126-3pTS),8~12h即可,12h后直接棄去轉染液,加新鮮培養基測24h 增殖情況。
            [0055] 3)轉染成功后換10%FBS EGM-2在培養箱孵育24h后。
            [0056] 4)向每孔加入10ul CCK-8溶液(注意在孔中不要生成氣泡,他們會影響A值的讀 數)。
            [0057] 5)將培養板在37°C、5%C02細胞培養箱內孵育4h(需根據自己細胞于1、2、3、4h分別 測1次,選A值在0.5~1.5的結果較好的1次的時間點作為孵育時間點)。
            [0058] 6)用酶標儀測定在450nm處各孔的A值。
            [0059] 7)如果暫時不測定A值,打算以后測定,可以向每孔中加入10ul Stop Solution, 并遮蓋培養板避光保存在0~5 °C條件下,在7天內吸光度不會發生變化。
            [0060] 實驗結果: 檢測結果如圖2所示,從中可以看出,與空白組和陰性載體對照組相比,重組腺病毒載 體ad-TPMl-miR-126-3pTS能夠特異性抑制平滑肌細胞的增殖,而對內皮細胞的影響并不 大。另外,對實施例2~6制備的重組腺病毒載體也進行上述類似的實驗檢測,結果發現也具 有同重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS類似的效果。
            [0061 ]實施例8本發明腺病毒載體對血管平滑肌細胞迀移的影響 為了研究本發明構建的腺病毒載體是否對平滑肌細胞的迀移性能具有抑制作用,進行 了以下實驗。
            [0062]實驗方法: 分別設置空白組、模擬陰性對照組(空載體)和實驗組(ad-TPMl -miR-126-3pTS),3組實 驗分別經Transwell實驗驗證其對于平滑肌細胞迀移能力的影響。
            [0063] (l)Transwell 培養 1)選擇生長狀態良好的HUVECs接種6孔板,融合度約60%時轉染,用iMAX試劑進行轉染 (空白組轉染水、模擬陰性對照組轉染空載體、實驗組轉染重組載體ad-TPMl-miR-126-3pTS)〇
            [0064] 2)轉染成功后換無血清培養基饑餓培養24h。
            [0065] 3)用0~1%FBS DMEM消化重懸,消化制備單細胞懸液,調整密度為5X 105個細胞/ ml 〇
            [0066] 4)接種細胞:Transwell小室加入200ul細胞懸液。
            [0067] 5)Transwell 培養板(24 孔)下室加入500ul 10%FBS 的 EGM-2。
            [0068] 6)培養細胞:37°C、5% C02細胞培養箱培養12h。
            [0069] (2)固定染色: 1)洗滌小室:小心取出Transwell小室后PBS洗1次,用濕棉簽輕輕擦去聚碳酯膜上表面 的細胞(快速,以防膜干燥),后再用PBS洗1遍,并做好標記。
            [0070] 2)固定:用冰預冷的甲醇固定30min IBS洗2遍。
            [0071] 3)染色:PBS清洗后結晶紫(0.1%)染色,4°C過夜。自來水沖洗2遍后風干。
            [0072] (3)封片、計數: 1)封片:用刀片小心將聚碳酯膜自Transwell小室基底切取下來,置載玻片上,用中性 樹脂封片。
            [0073] 2)計數:附著于聚碳酯膜下表面的細胞在高倍鏡下(X 100)隨機取6個視野,取平 均數。
            [0074]實驗結果: 檢測結果如圖3所示,從中可以看出,與空白組和陰性對照組相比,ad-TPMl-miR-126-3pTS明顯抑制了平滑肌細胞的迀移能力。另外,對實施例2~6制備的重組腺病毒載體也進行 上述類似的實驗檢測,結果發現也具有同重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS類似的效 果。
            [0075]實施例9管腔形成實驗檢測本發明腺病毒載體對血管內皮細胞功能的影響 實驗方法: 分別設置模擬陰性對照組(空載體)和實驗組(ad-TPMl-miR-126-3pTS),2組分別經管 腔形成實驗驗證其對于血管內皮細胞血管新生能力的影響。
            [0076] (1)細胞和物品準備: 1)基質膠(Matrigel)在4°C冰箱中置于冰上融化過夜,24孔板、200ul和lml無菌槍頭等 所需耗材也應在4 °C冰箱中預冷處理。
            [0077] 2)取年輕和衰老HUVECs種于6孔板,2.5 X 105/well,次日換液后進行轉染操作,用 iMAX試劑進行轉染(模擬陰性對照組轉染空載體、實驗組轉染重組載體ad-TPMl-miR-126-3pTS)〇
            [0078] 3)轉染12h后換液為無血清DMEM進行去血清化處理。
            [0079] (2)Matrigel 鋪膠準備: 1)將4°C預冷融化的Matrigel,96孔板和無菌槍頭,冰盒等放入超凈臺中。
            [0080] 2)將已融化的matirgel在超凈臺內冰上96孔板內鋪膠,100μΙ/孔。
            [00811 3)用200μ1的槍頭引導使matirgel均勻分布后在冰面上靜置lOmin(盡量把膠鋪 平,不留氣泡)。
            [0082] 4)鋪好的膠放入37°C細胞培養箱中凝固備用,一般60min即可。
            [0083] (3)細胞種植: 1)取轉染24h后的細胞,消化后用2% EGM-2重懸制成單細胞懸液,將細胞密度調整為1 Xl〇MVml〇
            [0084] 2)將不同分組細胞加入預先鋪好Matrigel的孔內,200ul/孔。
            [0085] 3)37 °C細胞培養箱中培養,觀察1次/h,一般4~6h成環,本實驗取6h結果拍照,測量 管腔總長度和管腔節點數目。管腔總長度等于在高倍鏡下(X 100)隨機5個視野中,HUVECs 伸出分支樣結構總長度的平均值。
            [0086] 實驗結果: 檢測結果如圖4所示,從中可以看出發明重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS對于 血管內皮細胞的影響并不大,與對照組相比,并無差別。另外,對實施例2~6制備的重組腺病 毒載體也進行上述類似的實驗檢測,結果發現也具有同重組腺病毒載體ad-TPMl-miR-126-3pTS類似的效果。
            [0087] 實施例10管腔形成實驗檢測本發明腺病毒載體對血管內皮細胞功能的影響 實驗方法: 設置普通球囊介入組和ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入組,利用球囊過度擴張小 豬髂股動脈制備下肢動脈硬化閉塞癥介入治療術后損傷模型。
            [0088] 1)小豬由南方醫科大學實驗動物中心提供;所有的動物都使用標準的喂養方式及 伺料進彳丁喂養 2)術前3天始飼以口服用氯吡格雷150mg,口服用阿司匹林325mg以及lg先鋒霉素 IV。 [0089] 3)使用戊巴比妥鈉 10mg/Kg靜脈注射進行誘導麻醉,使用氟烷進行維持麻醉。
            [0090] 4)切開左側頸總動脈,置入引導絲和鞘管,利用造影導管選擇性地進行血管造影, 明確解剖情況后,交換導絲和就搶,使用普通球囊和ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊擴張 制備介入治療術后動脈損傷模型。球囊擴張的時間和壓力在兩組間保持一致。
            [0091] 5)術后繼續予以250mg的阿司匹林進行抗血小板治療治療。
            [0092] 6)28天后,處死小豬并獲取實驗部位的組織; 7)濃度等級升高的乙醇中脫水,在甲基丙烯酸甲酯包埋劑進行包埋,聚合反應完成后, 使用薄片切片機將血管組織切成厚度為5_6μπι的薄片組織。隨后進行HE染色。
            [0093]實驗結果: 檢測結果如圖5所示,從中可以看出,ad-TPMl-miR-126-3pTS涂覆球囊介入組(圖5b)髂 動脈組的再狹窄程度要低于普通球囊組(圖5a),表現出了較為優越的抗再狹窄的性能。說 明本發明ad-TPMl-miR-126-3pTS有利于動脈粥樣硬化性疾病的介入治療,有利于減少動脈 粥樣硬化介入治療后引發的血栓形成的風險。
            [0094] 上述結果說明,本發明重組載體ad-TPMl-miR-126-3pTS可以特異性抑制血管平滑 肌細胞的增殖和迀移,而對內皮細胞的增殖和管腔形成功能的影響幾乎可以忽略。因此,應 用于人體,可以通過特異性抑制平滑肌細胞的增殖和迀移,從而減少介入術后再狹窄和血 栓形成的風險。
            [0095]綜上所述,本發明公開的基于miRNA調控的特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的 重組腺病毒載體可通過球囊和支架等方式,在人體血管腔內局部轉染該重組腺病毒載體, 可以實現"特異性抑制血管平滑肌細胞增殖和迀移而使得內皮細胞免受影響"的效果,從而 實現抑制平滑肌細胞增殖的同時,最大程度地保護內皮細胞,不會影響內皮的修復,從而減 少血栓形成的風險,有望減少抗血小板藥的使用和出血的發生;可提高介入治療動脈粥樣 硬化性疾病的效果,有利于減少動脈粥樣硬化介入治療后引發的血栓形成的風險;所述的 動脈粥樣硬化性疾病包括下肢動脈硬化閉塞癥、頸動脈狹窄、冠心病、腦血管的狹窄、腎動 脈及內臟動脈的狹窄。
            [0096]上述實施例為本發明較佳的實施方式,但本發明的實施方式并不受上述實施例的 限制,其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化, 均應為等效的置換方式,都包含在本發明的保護范圍之內。
            【主權項】
            1. 一種特異性抑制平滑肌細胞增殖和迀移的腺病毒載體,其特征在于,該腺病毒載體 的多克隆位點處插入有目的基因和miRNA的調控序列; 所述目的基因選自基因77W_/、份?、似沒戶劃網/?基因中的至少一 種; 所述miRNA的調控序列選自miR-126-3p的反向互補序列、miR-1298的反向互補序列、 miR-140_3p的反向互補序列、miR_125b的反向互補序列、miR-100的反向互補序列、miR-24 的反向互補序列中的至少一種。2. 根據權利要求1所述的腺病毒載體,其特征在于,所述腺病毒載體的骨架選自GV135、 GV314、pXCl、pAdEasy_l、pADtreak_CMV、AdMax 中的至少一種。3. 根據權利要求1所述的腺病毒載體,其特征在于,所述miRNA的調控序列為至少2個串 聯的miR-126-3p反向補互序列、或至少2個串聯的miR-1298反向補互序列、或至少2^串聯 的miR-140-3p反向補互序列、或至少2個串聯的miR-125b反向補互序列、或至少2個串聯的 miR-100反向補互序列、或至少2個串聯的miR-24反向補互序列。4. 權利要求1~3任一所述腺病毒載體在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。5. 根據權利要求4所述的動脈粥樣硬化性疾病為下肢動脈硬化閉塞癥、頸動脈狹窄、冠 心病、腦血管的狹窄、腎動脈及內臟動脈的狹窄。6. 權利要求1~3任一所述腺病毒載體在制備防治血栓藥物中的應用。7. 根據權利要求6所述的應用,其特征在于:所述的血栓為脈粥樣硬化性疾病介入治療 后引發的血檢。8. 含有權利要求1~3任一所述腺病毒載體的腺病毒。9. 權利要求8所述腺病毒在制備治療動脈粥樣硬化性疾病藥物中的應用。10. 權利要求8所述腺病毒在制備防治血栓藥物中的應用。
            【文檔編號】A61P7/02GK105950660SQ201610498532
            【公開日】2016年9月21日
            【申請日】2016年6月27日
            【發明人】姚陳, 王勁松, 常光其, 王深明, 李勇輝
            【申請人】姚陳, 王勁松, 常光其, 王深明, 李勇輝
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